Method Article

전체 마운트 조직 이미징을 사용한 장 점액의 3차원 정량화

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 전체 마운트 장 조직과 다광자 현미경을 사용하여 분비된 점액을 정량화하여 카르바모일콜린 클로라이드와 같은 자극에 대한 점액 역학의 정밀한 체적 분석 및 시각화를 가능하게 하는 3D 이미징 방법을 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

점액은 소화를 촉진하고, 미생물에 대한 장벽을 형성하며, 장 내 면역 반응을 조절함으로써 장 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 그 분비는 미생물 감염 및 염증을 포함한 다양한 내인성 및 외인성 요인에 의해 조절됩니다. 점액 분석을 위한 전통적인 방법은 조직학적 절편에서 점액 두께 측정과 같은 상대적 정량화에 의존하지만, 이러한 접근 방식은 장 내강 내에서 분비된 점액의 실제 부피와 공간적 분포에 대한 제한된 통찰력을 제공합니다. 여기에서는 전체 마운트 장 조직과 다광자 현미경을 사용하여 점액의 절대적인 3차원 정량화를 위한 자세한 방법론을 제시합니다. 이 프로토콜에는 결찰된 장 루프의 준비, 잔 세포 활성화를 위한 자극으로서 염화카르바모일콜린 처리, 조직 고정 및 이미징을 위한 염색이 포함됩니다. 다광자 현미경을 사용하여 내강 표면의 Z-스택 이미지를 획득합니다. 이들은 분비된 점액의 부피와 공간적 분포를 정량화하기 위해 Imaris 소프트웨어에서 처리됩니다. 우리는 카르바모일콜린 클로라이드가 30분 이내에 회장과 결장 조직 모두에서 점액 분비를 강력하게 유도한다는 것을 입증합니다. 분비된 점액은 내강 전체에 산발적이고 불연속적인 방식으로 나타나며, 이는 전통적인 2차원 접근 방식에 비해 체적 분석의 중요성을 강조합니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 절대적인 정량적 데이터를 얻고 현장에서 점액 분포를 시각화할 수 있으며, 생리학적 및 병리학적 조건에서 장 점액 역학을 연구하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 위장관의 점막 환경은 매우 역동적이어서 다양한 미생물 군집의 식민지화를 지원합니다. 장 상피는 영양분을 흡수하고 장벽 무결성을 유지하며 면역 체계와 통신하기 위해 협력하는 다양한 특수 세포로 구성됩니다1. 이 중 잔 세포는 점액 과립을 저장하고 정상 상태 조건에서 점액을 내강으로 분비합니다. 이 점액은 중요한 물리적 장벽을 형성하여 미생물이 상피층과 직접 접촉하는 것을 방지하고 조직 염증을 조절하며 장 항상성을 유지합니다 2,3. 점액 분비의 조절 장애는 장벽 기능을 손상시키고 염증 및 종양 형성과 관련이 있습니다 4,5,6,7.

장 점액 분비는 신경 전달 물질인 아세틸콜린과 같은 내인적 요인과 공생체의 미생물 성분에 의해 유발될 수 있습니다 8,9. 장 환경의 복잡성을 감안할 때 잔 세포 점액 분비에 영향을 미치는 많은 요인은 아직 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 따라서 다양한 자극이 분비 역학에 어떤 영향을 미치는지 조사하려면 내강 점액을 정량화하는 정확한 방법이 필수적입니다. 전통적인 접근법은 주로 상대적 정량화에 의존합니다: 예를 들어, 생체 외 장 외식편 시스템에서 형광 또는 숯 입자를 사용하여 점액 두께를 측정하거나(10,11) 염색된 조직 절편에서 내강 미생물과 상피 사이의 거리를 평가합니다(12,13). 이러한 방법은 상대적 비교에 편리하지만, 특히 분비된 점액이 항상 상피를 균일하게 덮는 것은 아니기 때문에 분비된 점액의 전체 분포나 3차원 구조를 포착하지 못할 수 있습니다.

본 연구에서는 전체 마운트 장 조직을 사용하여 내강 점액의 3차원 시각화 및 절대 정량화 방법을 제시합니다. 이 접근법은 구조적 무결성과 형태를 보존하기 위해 적절한 고정제로 신선한 조직을 고정한 다음 공초점 또는 다광자 현미경을 사용하여 형광 염색 및 이미징을 수행해야 합니다. 심부 마취된 마우스의 결찰된 장 루프에 시험제를 직접 투여한 후 즉시 고정함으로써 이 방법은 천연 점액 구조를 보존하고 분비 동역학을 분석할 수 있습니다. 이미징 깊이가 주로 조직 두께에 의해 제한되는 절편 조직과 비교할 때 전체 마운트 조직(탈지질 없음)의 이미징 깊이는 광 산란 및 조직 불투명도에 의해 제한되는 약 200-300μm에 이릅니다. 이 기술을 사용하여 우리는 수용체가 잔 세포14에서 발현되는 아세틸콜린 유사체인 카르바모일콜린 염화(CCh)가 빠른 점액 분비를 강력하게 유도한다는 것을 보여줍니다. 특히, 분비된 점액은 상피를 따라 연속적인 층과 내강 내의 불연속 구조를 모두 형성하는데, 이는 기존 조직 절편에서는 감지하기 어려운 특징입니다. 이 프로토콜은 장 점액의 3차원 분포를 정량화하고 다양한 자극의 점액 유도 가능성을 비교하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험은 장궁대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. Chang Gung University의 동물 시설은 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(AAALAC)의 인증을 받았습니다. 이 연구에서는 동물 건강 문제가 관찰되지 않았습니다.

1. 고정베이스 준비

  1. 전자레인지용 플라스크에서 아가로스 분말을 ddH2O와 4%(w/v)의 농도로 혼합합니다. 작은 거품 없이 끓을 때까지 전자레인지에 2-3분 동안 돌립니다.
    알림: 부피는 샘플 수에 따라 다릅니다. 6cm 접시에 약 10mL.
  2. 아가로스 용액을 ~3분 안에 ~60°C까지 식힙니다. 액체 높이가 접시의 절반(6cm 접시의 경우 약 10mL)에 도달할 때까지 아가로스를 6cm 접시에 조심스럽게 붓습니다.
  3. 아가로스가 완전히 굳을 때까지 뚜껑이 있는 접시를 닫힌 공간에 20-30분 동안 놓습니다.

2. 고정재 준비

  1. 새 구리선을 준비하고 5mm 길이로 자릅니다. 각 조직 조각에는 6-8개의 와이어가 필요합니다.

3. CCh 용액의 제조

  1. 멸균 PBS 완충액에 결정질 CCh를 10μM(하나의 장 루프당 200μL)의 최종 농도로 용해시킵니다.

4. 주사용 마취제의 준비

  1. 마취용 원액을 준비하려면 2,2,2-트리브로모에탄올을 2-메틸-2-부탄올에 녹입니다.
  2. 멸균 PBS를 사용하여 원액을 희석하여 최종 작업 용액에 30mg/mL 2,2,2-트리브로모에탄올 및 3%(v/v) 2-메틸-2-부탄올이 포함되도록 합니다.
  3. 용액에 펠릿이 남지 않을 때까지 ~1분 동안 완전히 소용돌이치십시오(최대 속도: 8).
  4. 분해를 방지하기 위해 원액을 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오. 준비 후 1개월 후에 재고를 폐기하십시오.
  5. 마취 전에 원액을 멸균 PBS에 끌어당기고 잘 혼합하여 균일한 분산을 보장하여 마우스당 250mg/kg의 최종 용량을 달성합니다.
    주의: 2,2,2-트리브로모에탄올은 신경독성이 있고 2-메틸-2-부탄올은 휘발성이며 자극적인 냄새가 있습니다. 적절한 보호 장비를 사용해야 합니다. 폐기를 위해 폐기물을 밀봉된 용기에 수거하고 기관의 유해 화학 폐기물 처리 절차를 따르십시오.

5. 루프 주입을 통한 장내 접종

  1. 6-8주 령령의 마우스를 2,2,2-트리브로모에탄올 200μL(마우스당 250mg/kg)의 복강내 주사로 마취하고 마우스를 가열 패드 위에 올려 체온을 유지합니다.
  2. 알코올로 피부 표면을 살균한 후 수술용 가위를 사용하여 마우스의 왼쪽 하복부를 절개하고 마취 하에 맹장을 노출시킵니다.
  3. 회장 또는 근위 결장을 식별하고 멸균 거즈 위에 장 루프를 놓고 동맥 클램프를 사용하여 양쪽 끝을 고정하여 3cm 길이의 폐쇄 루프를 만듭니다.
  4. 멸균 PBS로 거즈의 장기를 헹굽니다.
  5. 마취 하에 결찰된 장 루프에 200μL 이하의 부피로 멸균 PBS 또는 CCh 시약을 주입합니다.

6. 조직 채취, 고정 및 염색

  1. 치료 30분 후, 자궁경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시키고 장 루프를 채취합니다.
  2. 집게를 사용하여 장 루프를 잡고 멸균 PBS로 부드럽게 헹굽니다.
  3. 장 루프를 세로로 부드럽게 자르고 멸균 PBS로 조직을 헹굽니다.
  4. 조직을 평평하게 펴고 구리선 세그먼트를 사용하여 6cm 접시의 아가로스에 고정합니다.
  5. 접시에 10-4시간 동안 4% 파라포름알데히드 용액 4mL로 조직을 고정합니다.
  6. 잔류 파라포름알데히드를 제거하기 위해 PBS로 조직을 최소 3회 세척합니다.
  7. 접시에서 12-24시간 동안 4°C에서 10mL의 차단 완충액(0.4% Triton X-100 및 3% 소 혈청 알부민[BSA]이 보충된 PBS)에 조직을 담급니다.
  8. 차단 완충액에 밀 배아 응집소(WGA, 1:200) 및 팔로이딘(1:500)으로 조직을 염색하고 접시에서 4°C에서 120rpm으로 12-24시간 동안 흔듭니다.
    참고: 염료 소비를 최소화하기 위해 염색을 위해 2mL의 염료 완충액에 담근 3cm 접시에 조직을 응고된 아가로스에 고정할 수 있습니다.
    주의 : 파라포름알데히드는 흡입 위험이 있습니다. 흄 후드에서의 작동과 같이 취급 중에는 적절한 보호 장비를 사용해야 합니다. 폐기를 위해 폐기물을 밀봉된 용기에 수거하고 기관의 유해 화학 폐기물 처리 절차를 따르십시오.

7. 다광자 현미경에 의한 이미지 캡처

  1. 남은 염색 완충액을 PBS로 최소 3배 씻어냅니다.
  2. PBS 10mL에 6cm 접시에 구리선으로 아가로스에 조직을 고정합니다.
  3. 심부 조직 이미징을 위한 높은 NA 대물 렌즈가 장착된 다광자 현미경을 사용하여 장 조직 및 관련 분비된 점액의 광학 절편 100개(깊이 99μm 포함)를 획득합니다. 750nm의 파장으로 설정된 다광자 현미경용 여기 소스를 사용하십시오. BP500-550 nm 및 BP565-610 nm 대역 통과 필터를 사용하여 방출 신호를 수집합니다. 스캔 속도를 8로 설정합니다.
    참고: 다광자 현미경의 경우 최대 스캔 속도는 9이며, 값이 높을수록 획득 속도가 빠릅니다. 속도 설정은 현미경의 용량에 따라 다릅니다. 3D 스택을 획득하는 데 사용되는 이미징 플랫폼을 사용하는 경우 획득 시간과 이미지 품질의 균형을 맞추기 위해 스캔 속도를 8로 사용하는 것이 좋습니다.

8. 이미지 분석 및 점액 정량화(그림 1)

  1. 각 점액 입자의 부피(WGA 채널에서)를 측정하려면 파일을 아레나 페이지로 끌어다 놓아 Imaris에서 이미지 스택을 엽니다. 지표면 아이콘을 클릭하여 지표면 작성 워크플로우를 시작합니다. 표준 단계에 따라 z-스택 내의 입자 부피를 분할하고 정량화합니다. 특정 매개변수 및 처리 단계는 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다.
  2. 대부분 잔 세포인 1,000μm3보다 작은 점액 입자를 제외합니다(그림 2A,B).
  3. 각 그룹에 대해 분비된 점액의 양을 합산합니다.

9. 통계 분석

  1. 각 그룹의 총 볼륨을 분석하고 비교합니다. Column 에 점액량 값을 입력하고 비모수 Mann-Whitney 검정을 사용하여 분석합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법에서는 다광자 현미경을 통해 획득한 전체 마운트 조직의 적층 이미지에서 장 점액의 양을 정량화했습니다. 장 조직을 형광 팔로이딘과 밀 배아 응집소(WGA)로 염색하여 세포 F-액틴과 점액을 각각 시각화했습니다15,16. PBS로 처리된 회장 및 결장 조직 모두에서 WGA+ 점액은 주로 상피 표면의 잔 세포 내에서 검출되었습니다. 카르바모일콜린 클로라이드(CCh) 투여 후 두 조직의 장 내강에서 점액의 증가가 관찰되었습니다. 특히, 분비된 점액은 상피 위에 연속적인 층을 형성하지 않고 대신 내강 전체에 산발적으로 분포되었습니다(그림 3A). WGA+ 점액의 총 부피를 계산하기 위해 Imaris의 표면 생성 도구를 사용하여 스택 이미지의 모든 WGA+ 구조를 라벨링하고 세포내 잔 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 전체 마운트 조직 염색, 다광자 현미경 및 Imaris 소프트웨어를 사용한 분석을 사용하여 장 점액의 3차원 정량화 방법을 제시합니다. 이 절차를 통해 장 내강 내 점액의 불연속적인 분포를 관찰할 수 있으며 점액량을 절대적으로 측정할 수 있습니다.

자극 시 불연속적인 점액 분포는 외식편 조직 배양 시스템에서도 관찰되었습니다8. 생체 외 외식목 배양을 사용한 이전 연구에서 점액 정량화는 보충된 비드와 조직 표면 사이의 거리 측정을 기반으로 했습니다10,11. 그러나 이 방법은 자극에 대한 반응으로 분비된 점액의 흩어지고 고르지 못한 분포를 포착하지 않습니다. 우리의 방법은 이러한 한계를 해결하며 실험 기간이 마취 제약에 의해 제한되지 않는 외식편 조...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기술 지원을 해주신 Linkou의 Chang Gung Memorial Hospital의 현미경 핵심 실험실에 감사드립니다. 또한 Zeiss LSM 7 MP 다광자 현미경 서비스에 대한 National Yang Ming Chiao Tung University의 이미징 핵심 시설, 특히 기술 지원에 대한 Pei-jun Chen 씨와 Yung-yu Lu의 지원에 감사드립니다. 저자는 NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 및 113-2628-B-182-002-MY3(YHT로)의 지원을 인정하고자 합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-트리브로모에탄올시그마-올드리치T48402
2-메틸-2-부탄올시그마-올드리치240486
6cm 접시 및 nbsp;알파 플러스16021-1
아가로스 히스파나가르A02599
BSA바이오샵ALB001
카르바모일콜린 염화물; 98% (적정), 결정질시그마SI-C4382-1G
구리선 (새롭게)탑 테크 와이어 & 케이블 인더스트리얼IW00125절연층이 없는 구리선입니다
집게시네테ST-M110
거즈, 멸균GMTH1940년 5월
그래프패드 프리즘 8 그래프패드 소프트웨어
온열 패드편안함SY-666
IMARIS 10.0.0옥스퍼드 악기
파라포름알데히드비오보바스BL0415-1000
PBS제네스타BL0180-1000
팔로이딘 표지 검사인비트로젠A12379
가위시네테02-1250.18
트리톤 X-100머 크1.08603.1000
밀 배아 응집체(WGA) 접합체바이오티움29027
자이스 7MP, W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III 수중 침수 대물렌즈(NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP 사파이어 펨토초 레이저(딥씨 모듈 없음), BP500 nm-550 nm 및 BP565 nm-610 nm 검출기, 750 nm 레이저 파장을 갖춘고NA 대물렌즈를 장착한 3D 스택을 획득하는 데 사용된 영상 플랫폼; 750 nm 파장으로 설정된 다광자 현미경용 여기 소스

References

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