미세유체 유동 초점 장치를 사용하여 실온에서 안정적인 단분산 인지질 코팅 미세 기포 생산

요약

이 기사에서는 인지질 코팅 제형을 제조하는 방법을 포함하여 실온에서 미세유체 유동 초점 장치를 사용하여 단분산 인지질 코팅 마이크로버블을 생성하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

단분산 미세기포는 이미징 및 치료 응용 분야 모두에서 초음파 조영제의 효능을 향상시키는 데 상당한 잠재력을 입증했습니다. 이러한 미세 기포는 미세유체 흐름 초점 방법을 사용하여 직접 생산할 수 있으며, 이를 통해 크기를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 그러나 생산 중 유착을 방지하는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다. 높은 생산 온도(예: 55°C)는 유착을 억제할 수 있지만 이러한 조건은 미세유체 장치 설계를 복잡하게 만들고 표적제 및 약물 접합체와 호환되지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜은 미세 기포의 안정성과 단일 분산성을 최소 7일 동안 유지하면서 실온에서 단분산 인지질 코팅 마이크로버블을 생성하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 재사용 가능한 PDMS 미세유체 칩의 제조 및 계면활성제 Pluronic F68을 포함하는 인지질 코팅 제형의 제조를 설명합니다. 우리의 연구 결과는 이 방법을 사용하여 생성된 미세 기포가 7일 동안 크기와 안정성을 유지하여 안정적이고 제어 가능한 초음파 조영제가 필수적인 임상 환경에서 향후 적용 가능성을 뒷받침한다는 것을 보여줍니다.

서론

초음파 조영제(UCA)는 임상 초음파 검사 및 치료 응용 분야에 널리 사용됩니다 ^1,2,3. 정맥 주사로 투여된 이 미세 기포는 혈관계에 갇혀 혈액 풀 제제 역할을 합니다 ^4,5. 안정화 쉘은 미세 기포를 코팅하고 라플라스 압력에 의해 구동되는 가스 확산을 줄여 미세 기포의 수명을 연장합니다 ^3,6. 초음파에 노출되면 미세 기포가 진동하기 시작하고 가스 코어 ^7,8의 압축성으로 인해 강한 에코를 생성합니다. 진동 은 마이크로버블의 공진 주파수에서 가장 두드러지며, 이는 마이크로버블 크기와 쉘 특성 ^9,10,11의 영향을 받습니다. 임상적으로 승인된 UCA는 일반적으로 직경 12,13,14에서 일반적으로 약 0.5-10μm 범위의 광범위한 크기 분포를 갖는 다분산 미세 기포로 구성됩니다. 이러한 광범위한 크기 분포는 이러한 미세 기포가 공진하는 광범위한 주파수로 이어집니다. 임상 초음파 프로브가 일반적으로 좁은 주파수 대역폭에서 작동한다는 점을 감안할 때 UCA 모집단의 하위 집합만이 효과적으로 공명합니다¹⁵. 크기분포가 좁은(예: PDI 3~10%^16,17) 단분산 미세기포는 다분산 미세기포에 비해 진단 및 치료를 강화하는 것으로 나타났습니다. 조영 증강 초음파 영상의 경우 강도가^2-3자릿수 증가한 반면 하위 고조파 신호를 통한 비침습적 압력 감지에 대한 감도는 거의 두 배로 증가했으며^19,20,21 약물 전달 효율은 거의 1자릿수 증가했습니다 . 결과적으로, 크기가 좁고 음향 반응이 좁은 단분산 미세 기포를 생성하는 것은 제어된 미세 기포 진동이 중요한 초음파 이미징 및 치료 응용 분야의 잠재력을 극대화하는 데 중요합니다.

단분산 마이크로버블은 디캔테이션⁽²³), 기계적 여과⁽²⁴) 및 다분산 마이크로버블제⁽²⁵)의 원심분리와 같은 다양한 방법을 통해 생산될 수 있다. 그러나 이러한 기술로 정밀한 크기 제어와 높은 단분산성을 달성하는 것은 여전히 어려운 일입니다²⁶. 대안적이고 보다 통제된 접근 방식은 미세유체 흐름 초점 장치를 사용하여 단분산 미세 기포를 직접 생산하는 것입니다. 이 과정에서 가스 스레드는 미세유체 칩의 두 수성 리포솜 스트림 사이에 집중되어 가스 스레드의 재현 가능한 꼬집음으로 이어지며, 이를 통해 원하는 크기⁽²⁷)에서 단분산 미세 기포를 고속으로 생산할 수 있습니다. 유동 초점 방법은 단분산 액적을 생산하기 위해 널리 사용되어 왔지만^28,29, 단분산 마이크로버블 생산에서의 적용은 크기, 단분산성 및 농도 측면에서 유착을 방지하고 장기 안정성을 적절하게 유지하는 것이 어렵기 때문에 덜 일반적입니다³⁰. 여러 개의 미세 기포가 더 큰 미세 기포로 합쳐지는 유착은 단분산성에 영향을 미칩니다. 높은 생산 온도는 유착을 감소시키는 것으로 나타났습니다³¹, 그러나 이것은 미세유체 시스템 설계를 복잡하게 만들고 표적제 또는 약물 접합체를 포함하는 제형에는 적합하지 않을 수 있습니다. 따라서 실온에서 단분산 미세 기포를 생성하는 것이 유리할 것입니다. 인지질로 코팅된 미세기포는 시간이 지남에 따라 수축, 붕괴 및 단분산성을 잃는 경향이 있기 때문에 이러한 단분산 미세기포를 저장하는 방법도 마찬가지로 중요합니다³². 보관 중 며칠 동안 장기적인 안정성을 보장하는 것은 단분산 마이크로버블 기술을 임상 응용 분야로 전환하는 데 매우 중요합니다.

이 프로토콜에서 우리는 실온에서 흐름 초점 미세유체 플랫폼을 사용하여 인지질 코팅된 단분산 미세 기포를 생산하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 13-42 μL/min 범위의 지질 유속과 호환되며 실온에서 사용하도록 설계되어 미세유체 시스템의 온도 제어가 부족한 실험실에 적합합니다. 이 프로토콜은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜](DPPE-PEG5000) 및 안정성과 재현성을 보장하는 플루로닉 F68로 구성된 인지질 제형을 사용합니다. 이 프로토콜은 재사용 가능한 PDMS 미세유체 칩 제조, 인지질 코팅 용액 준비, 실온에서 생산 중 미세 기포 유착을 방지하기 위한 계면활성제 Pluronic F68 통합에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 또한 노즐 막힘을 방지하기 위해 미세유체 시스템을 청소하고, 미세 기포 크기를 제어하기 위해 가스 압력과 액체 유량을 조정하고, 장기적인 안정성을 위해 생성된 미세 기포를 수집 및 저장하는 절차에 대해서도 자세히 설명합니다. 이 방법은 실온에서 정밀한 크기 제어를 통해 안정적인 단분산 미세 기포를 생성하기 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다.

프로토콜

1. 지질 필름 만들기

참고: 단분산 미세기포 생산을 위한 지질 혼합물은 90:10의 몰비로 DSPC와 DPPE-PEG5000의 이원 혼합물로 제형화됩니다. DSPC는 다분산^33,34 및 단분산 미세 기포³¹ 모두에서 가스 용해에 대해 우수한 안정성을 제공하는 것으로 나타났기 때문에 주요 지질로 선택되었습니다. 이러한 향상된 안정성은 DPPC(~41°C)³⁵와 같은 다른 일반적으로 사용되는 지질보다 높은 55°^C35의 상대적으로 높은 겔-액결정 상전이 온도에 의해 발생하여 실온에서 더 단단하고 불투과성 지질 껍질을 초래하는 것으로 가정됩니다³⁶. 여기에서는 3mL 인지질 코팅 용액을 제조하는 예를 실증한다. 단분산 마이크로버블^16,17을 생성하기 위한 일반적인 농도인 20mg/mL의 최종 인지질 농도를 달성하려면 60mg의 인지질이 필요합니다. 각 인지질 성분의 원하는 양은 표 1에 나와 있습니다.

1. -20°C 냉동고에서 인지질 분말을 꺼내 실온에서 1시간 동안 해동합니다.
2. 별도의 2mL 부피 플라스크에 필요한 지질 분말의 무게를 잰다.
3. 100mL 유리 계량 실린더를 사용하여 90mL의 클로로포름을 측정한 다음 이를 250mL 유리 삼각형으로 옮겨 연기에서 클로로포름:메탄올 용매의 90:10v/v 혼합물 100mL를 준비합니다. 그런 다음 100mL 유리 측정 실린더를 사용하여 10mL의 메탄올을 측정하고 이미 클로로포름이 들어 있는 250mL 유리 삼각 각오에 붓습니다. 유리 삼각 마개로 유리 삼각을 닫고 용액이 투명해질 때까지 삼각을 부드럽게 휘젓어 두 용매를 혼합합니다.
   주의: 클로로포름과 메탄올은 독성 화학 물질입니다. 클로로포름은 잠재적인 발암 물질이며 호흡기, 피부 및 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다. 메탄올은 가연성이 높고 흡입, 섭취 또는 피부를 통해 흡수될 경우 독성이 있으며 섭취 시 실명을 유발할 수 있습니다. 연기 흡입을 방지하기 위해 항상 통풍이 잘 되는 연기에서 클로로포름/메탄올 혼합물을 사용하십시오. 장갑, 보안경, 실험실 가운 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 메탄올을 취급할 때 화염이나 발화원이 없는지 확인하십시오. 기관의 유해 폐기물 프로토콜에 따라 용제 폐기물을 처리하십시오.
4. 1.2단계에서 계량한 지질 분말을 완전히 용해시키려면 각 2mL 부피 유리 플라스크에 클로로포름/메탄올 혼합물 mL를 넣고 증발을 방지하기 위해 유리 뚜껑을 빠르게 닫습니다.
   알림: 지질 분말이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 필요한 경우 플라스크를 부드럽게 휘젓어 용해를 용이하게 합니다.
5. 각 용액을 순차적으로 부어 용해된 지질 용액을 30mL 유리 바이알에 혼합합니다.
6. 아르곤 가스의 일정한 흐름 하에서 용매를 증발시키고 바이알을 회전시켜 유리 표면에 지질 막이 고르게 분포되도록 합니다.
   참고: 용매의 최종 흔적은 아르곤 가스만으로는 증발하기 어려울 수 있습니다. 추가 건조를 위해 바이알을 연기 후드에 2시간 동안 그대로 두십시오. 아르곤 가스를 사용할 수 없는 경우, 질소 가스⁽³⁷) 또는 6°C^31,38(즉, DSPC의 상전이 온도인 55°^C35 이상)에서 작동하는 진공 회전식 증발기를 사용하여 클로로포름/메탄올 용매를 증발시킬 수 있습니다.
7. 용매 증발 후 지질 혼합물을 진공에 두어 남아 있는 유기 용매 잔류물을 제거합니다. 유리 바이알을 파라필름 층으로 밀봉하고 바늘로 여러 구멍을 뚫어 진공 상태에서 공기가 흐를 수 있도록 합니다.
   알림: 파라필름을 사용하는 목적은 동결 건조 과정에서 지질이 유리 바이알 밖으로 분산되는 것을 방지하는 것입니다.
8. 바이알을 진공 상태에서 밤새 동결 건조기에 넣어 잔류 유기 용매를 제거합니다.
9. 다음 단계로 진행하거나 필요할 때까지 지질 필름을 -20°C에서 보관합니다.
   참고: 이 섹션 또는 프로토콜의 다른 곳에서는 원심분리 단계가 사용되지 않습니다.

2. 유동 집중 미세유체 칩 제작

참고: 단분산 미세 기포는 그림 1A와 같이 흐름 초점 미세유체 칩을 사용하여 생성됩니다. 노즐 및 출구 치수를 포함한 미세유체 채널 형상의 개략도는 보충 그림 S1에 제공됩니다. 이러한 금형을 준비하는 데 사용되는 SU-8 기반 포토리소그래피에 대한 자세한 제조 프로토콜은 이전에 설명되었으며³⁷ 이 프로토콜에 대한 보충 정보 로 찾을 수 있습니다. PDMS 칩의 제조 공정은 다음 단계에 요약되어 있습니다.

1. PDMS 베이스(23.g)와 경화제(2.3g)를 10:1 중량비로 혼합하여 총 25.5g의 PDMS를 얻는다.
2. 마스터 몰드를 페트리 접시에 넣고 그 위에 PDMS 혼합물을 붓습니다.
3. 진공 상태(2~7mbar)에서 40분 동안 혼합물을 탈기하여 갇힌 기포를 제거합니다.
   알림: 더 큰 부피의 경우 기포를 완전히 제거하기 위해 더 긴 탈기 시간이 필요할 수 있습니다.
4. 금형을 75°C 핫플레이트에 1시간 동안 놓습니다.
   알림: 더 큰 양의 경우 더 긴 경화 시간이 필요할 수 있습니다.
5. PDMS를 실온으로 식히십시오. 메스를 사용하여 경화된 PDMS 주위를 조심스럽게 자르고 벗겨 칩을 제거합니다.
6. PDMS 칩을 원하는 크기로 자르고 1mm 펀치를 사용하여 입구/출구 구멍을 펀칭합니다.
7. 접착 테이프로 PDMS 칩을 청소하여 먼지 입자를 제거합니다.
8. PDMS 칩과 유리 슬라이드를 모두 이소프로판올로 세척한 다음 탈이온수로 세척합니다.
9. PDMS를 60% 전력(60W)에서 1분 동안 공기 플라즈마 클리너에서 처리하여 유리 슬라이드에 접착합니다.
10. 접착된 칩을 95°C 핫플레이트에 3분 동안 올려 접착력을 강화합니다.
11. PDMS 칩을 실온으로 식히십시오. 완전히 제작된 칩은 그림 1C에 나와 있으며 노즐의 미세한 명시야 그림은 그림 1D에 나와 있습니다.
12. 접착된 칩을 플라즈마 클리너에 80% 전력(80W)으로 5분 동안 넣어 미세유체 채널의 표면 친수성을 복원합니다.
13. 친수성을 유지하기 위해 즉시 칩에 Milli-Q 물을 채웁니다.
14. 사용할 때까지 칩을 Milli-Q 물에 실온에서 보관하십시오.

3. 인지질 코팅액의 제조

1. 준비된 지질 필름을 -20°C 냉동고에서 제거하고 실온에서 1시간 동안 해동합니다.
2. 지질 필름(60mg)에 예열된(55°C) 인산염 완충 식염수(PBS) 3mL를 첨가하여 최종 지질 농도 20mg/mL에 도달합니다. 바이알을 55°C 수조에 40분 동안 넣고 중간 속도로 15분마다 소용돌이치게 합니다(와류 혼합기의 레벨 3/5).
   참고: 이 단계는 단계 3.5에서 초음파 처리 전에 PBS에서 지질 성분을 미리 용해하고 균일하게 분산시키는 역할을 합니다. 이 온도는 DSPC³⁹의 상전이 온도로, 부분 가용화를 촉진하고 지질 응집을 감소시킵니다. 3.6 단계의 초음파 처리는 완전한 광학 선명도를 달성하기 위해 필요하지만 예비 열 배양은 큰 지질 응집체의 형성을 최소화하고 분산액의 균질성을 향상시킴으로써보다 효율적이고 재현 가능한 초음파 처리를 용이하게 합니다.
3. 지질 혼합물에 0.43mL의 Pluronic F68 용액을 첨가하여 10%의 몰 농도, 즉 DSPC: DPPE-PEG5000: Pluronic F68 = 81:9:10mol%에 도달합니다. 그 후 샘플은 시각적으로 흐린 솔루션인 그림 2A와 유사해야 합니다.
   참고: Pluronic F68은 단분산 미세 기포 생성 중 유착을 방지하는 데 사용되는 계면활성제입니다^16,40. Pluronic F68이 없는 경우, 이 프로토콜¹⁶에 기술된 Horizon 미세유체 장치⁽³⁷) 및 지질 제형을 사용하여 단분산 미세 기포를 형성할 수 없습니다. 이 화합물은 생성된 단분산 마이크로버블 현탁액의 단분산성 및 안정성을 모두 손상시키는 것으로 보고되었기 때문에 지질 제형에 프로필렌 글리콜을 사용하지 않았습니다³⁸.
4. 형광 표지된 단분산 미세 기포를 제조하기 위해 이 단계에서 친유성 카보시아닌 염료와 같은 지질 염료를 혼합물에 통합합니다.
5. 수온을 55°C로 유지하면서 수조에서 100% 전력으로 20분 동안 지질 혼합물을 초음파 처리합니다. 지질 용액은 20분 후에 그림 2B 와 유사해야 하며, 이는 3.4단계보다 덜 흐린 용액입니다. 그림 2C와 같이 용액이 투명해질 때까지 10분 간격으로 초음파 처리를 계속합니다.
   참고: 그림 2C의 용액의 경우 명확한 용액을 얻기 위해 30분의 초음파 처리가 필요했습니다. 지질 용액의 특성화는 예를 들어 동적 광산란체를 사용하여 리포솜 크기를 측정함으로써 수행할 수 있습니다.
6. 추가 처리하기 전에 지질 용액을 실온으로 식히십시오.

4. 마이크로버블 수집 바이알의 준비

참고: 단분산 미세 기포의 장기간 보관을 보장하려면 수집 바이알로 기밀성 의료용 바이알이 필요합니다.

1. 5mL 유리 의료용 바이알을 고무 마개로 밀봉하고 바이알에 C₄F₁₀ 가스를 채웁니다. 그런 다음 바이알 주위에 알루미늄 캡을 압착하여 기밀성을 보장합니다. 이제 수집 바이알을 사용할 준비가 되었습니다.

5. 미세유체 플랫폼의 준비

참고: 도 3A에 도시된 바와 같이, 시스템은 호라이즌 미세유체 플랫폼(³⁷ )(이하 '미세유체 플랫폼'이라고 함), 제어용 컴퓨터, 생산 공정을 모니터링하기 위한 고속 카메라, 고속 이미징 중 조명을 위한 외부 발광 다이오드(LED) 광원, 생산 중 특정 간격으로 고속 이미징을 트리거하기 위한 함수 파형 발생기로 구성된다. 마이크로버블 생산을 시작하기 전에 노즐 막힘 가능성을 줄이기 위해 장치를 청소해야 합니다. 세척 절차에는 튜브와 미세유체 칩이 모두 포함됩니다.

1. 튜빙 세척 절차
   1. 오른쪽에 있는 미세유체 플랫폼의 전원 스위치를 켭니다(그림 3A).
      알림: "전원 스위치"는 시스템의 내부 마이크로컨트롤러, 펌프 및 센서를 활성화하는 Horizon 플랫폼의 주 전원 제어 장치를 나타냅니다.
   2. 70% 에탄올로 채워진 4mL 유리 바이알을 미세유체 플랫폼의 P-펌프 챔버 왼쪽에 넣습니다(그림 3). 액체 흐름을 100μL/min으로 시작하여 액체 입구 튜브가 바이알의 70% 에탄올로 세척되도록 합니다. 5분 후에 액체 흐름을 멈추어 플러싱을 중지합니다.
      알림: P-펌프는 미세유체 시스템 내에 통합된 압력 제어 가스 전달 장치를 말합니다. 이 단계는 튜브를 청소하기 위한 것입니다. 이 단계에서 튜브를 미세유체 칩에 연결해서는 안 됩니다. 이 공정은 유체 시스템에서 에탄올 용해성 먼지와 오염 물질을 제거합니다.
   3. 에탄올로 채워진 바이알을 Milli-Q 물이 채워진 바이알로 교체합니다.
   4. Milli-Q 물로 100μL/min으로 5분 동안 튜브를 세척하여 시스템에서 잔류 에탄올을 제거합니다.
2. 칩 세척 절차
   1. 미세유체 플랫폼의 내부 LED 조명 스위치를 켭니다.
   2. PDMS 칩을 홀더에 삽입합니다.
   3. 매니폴드를 칩 위에 놓고 조정 가능한 휠을 사용하여 고정합니다.
   4. 핀셋을 사용하여 가스, 액체 및 출구 튜브를 PDMS 칩에 부착합니다. 연결 구성은 그림 3B에 나와 있습니다. 출구 튜브가 세척 과정에서 폐기물을 수집하기 위한 바이알로 연결되는지 확인하십시오.
   5. 플랫폼을 조정하여 칩의 노즐을 대물렌즈의 시야 내에 배치합니다.
   6. 1000mbar의 가스 압력과 100μL/min의 액체 유량을 사용하여 Milli-Q 물로 칩을 5분 동안 세척합니다. 먼저 가스 흐름을 시작한 다음 액체 흐름을 따릅니다.
      알림: 이 단계는 노즐 업스트림의 미세유체 칩을 청소하는 것입니다.
   7. 액체 흐름을 멈춘 다음 가스 흐름을 멈춥니다.
   8. (그림 3C)와 같이 가스 및 배출구 튜브를 다시 연결합니다.
   9. 1000mbar의 가스 압력과 50μL/min의 액체 유량을 사용하여 Milli-Q 물로 5분 동안 세척 절차를 반복합니다. 먼저 가스 흐름을 시작한 다음 액체 흐름을 따릅니다.
      알림: 이 설정은 노즐의 다운스트림에 있는 미세유체 칩을 청소합니다.
   10. 액체 흐름을 멈춘 다음 가스 흐름을 멈춥니다. PDMS 칩은 이제 마이크로버블 생산을 위한 준비가 되었습니다.

6. 고속 이미징 설정

알림: 단분산 미세 기포의 생산을 모니터링하고 제어하려면 미세 기포가 10⁵ 마이크로 기포/s 이상의 생산 속도로 생성되므로 고속 카메라를 미세 유체 플랫폼과 통합하는 것이 좋습니다. 고속 카메라를 사용하면 온칩 마이크로버블 크기와 생산 속도를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 마이크로버블 온칩 유착을 모니터링할 수 있습니다.

1. 고속 이미징 중에 미세유체 칩을 비추기 위해 장착 플랫폼 위에 LED 광원을 장착합니다(그림 3A).
2. 고속 카메라를 미세유체 플랫폼의 측면 이미징 포트에 연결합니다.
3. 외부 함수 파형 발생기를 활용하여 마이크로버블 생성 전체 기간 동안 10초 간격으로 고속 기록을 트리거합니다. 표준 BNC 케이블을 사용하여 파형 발생기의 TTL 트리거 출력을 고속 카메라의 외부 트리거 입력에 연결하여 동기화된 수집을 보장합니다. 이 모니터링은 생산 중 가스 스레드의 모양과 미세 기포의 크기 안정성을 평가하는 데 필요합니다.
   알림: 생산 중에 막힘이 발생할 수 있으므로 지속적인 모니터링이 중요합니다. 또한, 고속 이미지 시퀀스는 시간 분해 온 칩 마이크로 버블 크기 분포를 추출하는 데 사용됩니다. 이 10초 간격은 사용자 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.'

7. 단분산 미세 기포의 생산 및 특성화

1. 생산을 시작하기 전에 그림 4A와 같이 수집 바이알을 설정합니다. 한 바늘을 고무 마개에 뚫어 수집 바늘 역할을 하고, 다른 바늘을 마개에 통하여 환기 바늘로 뚫고 바늘 끝이 바이알 바닥 근처에 위치하도록 합니다. 생산 중에 cl을 사용하여 수집 바이알을 거꾸로 유지하십시오.amp.
   알림: 환기 바늘은 수집하는 동안 바이알 내부의 일정한 압력을 보장합니다. C₄F₁₀ 은 공기보다 무겁기 때문에 바이알에서 자발적으로 빠져나가지 않습니다.
2. 준비된 인지질 용액을 미세유체 플랫폼의 P-펌프에 넣습니다.
3. 칩의 노즐 부분을 대물렌즈의 시야로 이동합니다.
   참고: 미세유체 플랫폼에는 확대/축소 및 초점 조절이 가능한 내부 광학 모듈과 고속 카메라를 부착하기 위한 외부 F 마운트 커플러가 포함되어 있습니다.
4. 마이크로버블 생성을 시작하려면 가스 압력을 800mbar로 설정하고 액체 유량을 40μL/min으로 설정합니다.
   참고: 미세유체 플랫폼은 왼쪽에 1-5 μL/min, 오른쪽에 1-100 μL/min의 두 개의 흐름 제어 액체 채널과 하나의 압력 제어 가스 채널을 통합합니다. 이 프로토콜에서는 1-100 μL/min 액체 채널과 압력 제어 가스 채널이 사용되었습니다.
5. 액체가 노즐에 도달하면 가스 실이 끼어 배출구를 통해 단분산 미세 기포를 방출합니다(그림 4A).
6. 고속 기록을 ≥ 200,000fps의 프레임 속도로 설정하고 고속 기록을 사용하여 MATLAB의 imfindcircles 함수 를 통해 생성된 미세 기포의 크기를 측정합니다.
7. 가스 압력과 액체 유량을 조정하여 미세 기포 크기를 제어합니다.
   참고: 유량 및/및 가스 압력을 조정한 후 MATLAB 스크립트를 사용하여 고속 기록에서 온칩 크기 분포를 플로팅합니다. 크기 분포를 가우스 분포로 적합시키면 평균 μ 및 표준 편차 σ 를 도출할 수 있습니다. μ 은 생성된 단분산 미세 기포의 온칩 크기를 나타냅니다. 미세 기포 유착은 지질 농도를 희석하는 튜브에 잔류 Milli-Q 물로 인해 생산 초기 단계에서 발생할 수 있습니다. 이 문제는 일반적으로 희석되지 않은 지질 용액이 노즐에 도달하면 해결됩니다. 표 2는 800mbar의 일정한 가스 압력에서 여러 적용된 유량에 대한 결과 미세 기포 직경을 요약한 것입니다. 가스 압력과 액체 유량의 다양한 조합은 유사한 미세 기포 크기를 생성할 수 있지만 다른 매개변수 조합도 생산 속도에 영향을 미칩니다. 일정한 가스 유속에서, 생산 속도는 액체 유량⁽⁴¹)과 양의 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 이 프로토콜의 마이크로버블 생성 속도는 고속 기록의 프레임별 분석을 기반으로 초당 ~10⁵ 마이크로버블 정도이며, 이는 유사한 흐름 초점 형상에 대해 이전에 보고된 값과 일치합니다(³⁷).
8. 원하는 미세 기포 크기에 도달하면 출구 튜브를 수집 바이알에 연결하여 생성된 미세 기포를 수집합니다.
9. 수집하는 동안 생산 공정을 모니터링하기 위해 10초마다 트리거되도록 고속 기록을 설정합니다.
   알림: 녹음 사이의 간격은 특정 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.
10. 충분한 미세 기포 현탁액을 수집한 후 수집 바이알에서 환기 바늘과 수집 바늘을 모두 제거합니다.
11. 액체 흐름을 멈춘 다음 가스 흐름을 멈춥니다.
12. 수집된 미세 기포를 실온에서 똑바로 세워서 바이알이 기계적으로 최소한으로 교반되도록 합니다.
    참고: 마이크로버블 용액은 그림 5A와 같이 거품 층, 단분산 미세기포 층 및 하청액의 세 가지 층을 갖습니다. 이전 연구에서는 거품 관련 기포가 점차적으로 단분산 크기^16,38로 수축될 수 있다고 보고했기 때문에 바이알에 거품 층을 그대로 두는 것이 가장 좋습니다. 이 프로토콜을 사용하여 생산된 미세 기포는 규제 안전성 평가를 거치지 않았습니다. 그러나 구성 지질(DSPC, DPPE-PEG5000) 및 계면활성제(Pluronic F68)는 FDA 승인 주사 제형에 일반적으로 사용되며 생체 적합성으로 간주됩니다^42,43. 의료용 안전성을 확립하기 위해서는 추가 전임상 평가가 필요합니다.
13. 생산 후 2시간(즉, 단분산 미세 기포 생산 후 2시간), 입자 특성화 기계를 사용하여 미세 기포의 최종 크기와 농도를 특성화합니다.
    참고: 유동 초점 방법으로 생성된 단분산 미세 기포는 최종 크기⁴⁴로 안정화되는 데 약 90분이 필요합니다. 따라서 미세 기포를 사용하기 전에 최소 2시간의 안정화를 허용하는 것이 좋습니다.
14. 19G 바늘을 mL 주사기에 부착합니다(이하 '추출 주사기'라고 함).
15. 환기 바늘로 마이크로버블 바이알에 별도의 19G 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝이 바이알 상단 근처에 남아 공기가 유입되고 미세 기포 추출 중에 내부 압력을 유지하도록 합니다.
16. 바이알을 부드럽게 휘돌려 현탁액을 균질화합니다. 현탁액은 상단 폼 층, 단분산 미세 기포를 포함하는 중간 층 및 하단 수성 층의 세 가지 층으로 분리됩니다.
17. 추출 주사기를 빠르게 삽입하고 바늘 끝을 단분산 미세기포층 중앙에 조심스럽게 배치하여 거품과 하부 수성 하액층을 피합니다. 원하는 양의 마이크로버블 현탁액을 빼내고 바이알에서 추출 주사기를 제거합니다. 미세 기포 추출이 완료되면 환기 바늘을 제거합니다.

8. 청소 및 종료 절차

알림: 미세 기포 생성 후 미세유체 플랫폼과 칩을 철저히 세척하여 적절한 기능을 보장하고 칩을 재사용할 수 있도록 해야 합니다. 다음 단계에서는 청소 과정을 간략하게 설명합니다.

1. 칩의 경우 다음과 같이 진행하십시오.
   1. 지질 바이알을 Milli-Q 워터 바이알로 교체합니다.
   2. 800mbar의 가스 압력과 40μL/min의 액체 유량을 사용하여 5분 동안 미세유체 칩을 세척합니다.
   3. 먼저 액체 흐름을 멈춘 다음 가스 흐름을 멈춥니다.
   4. 미세유체 칩에서 가스 흡입구 튜브만 분리합니다.
   5. 미세유체 칩에 Milli-Q 물을 채워 내부 표면의 친수성을 유지합니다.
   6. 액체 흐름을 멈추고 칩에서 나머지 모든 튜브를 분리합니다.
   7. 나중에 사용할 때까지 칩을 Milli-Q 물에 보관하십시오.
2. 미세유체 시스템의 경우 다음과 같이 진행하십시오.
   1. 미세유체 플랫폼에서 Milli-Q 워터 바이알을 70% 에탄올 바이알로 교체합니다.
   2. 액체 흡입구 튜브를 70% 에탄올로 100μL/min의 유속으로 5분 동안 세척하여 지질 잔류물을 제거합니다.
   3. 에탄올 바이알을 P-Pump1의 Milli-Q 워터 바이알로 교체합니다.
   4. Milli-Q 물로 100μL/min으로 5분 동안 튜브를 세척하여 시스템에서 잔류 에탄올을 제거합니다. 이제 시스템이 깨끗해졌습니다.
   5. 미세유체 플랫폼과 고속 카메라 시스템을 종료합니다.

9. 문제 해결 단계

1. 노즐 막힘
   참고: 노즐의 크기(5μm)가 작기 때문에 생산 과정에서 막힘이 발생할 수 있습니다. 막힘을 제거하려면 아래 단계를 따르십시오.
   1. 즉시 액체 흐름을 멈춘 다음 가스 흐름을 멈춥니다.
   2. 그림 3B에 표시된 설정에 따라 튜브를 다시 연결합니다.
   3. P-Pump1에서 인지질로 채워진 바이알을 Milli-Q 물로 채워진 바이알로 교체합니다.
   4. 1000mbar의 가스 압력을 가하고 액체 유량을 5분 동안 100μL/min으로 설정하여 노즐을 세척합니다.
      알림: 대부분의 경우 막힌 부분은 5분 헹구면 제거됩니다. 그러나 막힘이 지속되면 PDMS 칩을 새 것으로 교체해야 할 수도 있습니다.
   5. 막힘이 제거되면 그림 3C에 표시된 대로 튜브를 다시 연결합니다.
   6. 1000mbar의 가스 압력과 50μL/min의 액체 유량을 사용하여 Milli-Q 물로 칩을 5분 동안 다시 세척하여 완전한 클리어런스를 보장합니다.
   7. P-Pump1에서 Milli-Q 물 충전 바이알을 인지질 충전 바이알로 교체하고 마이크로버블 생성을 재개합니다.
      알림: 생산 중에 막힘이 지속되면 튜브 또는 미세유체 칩의 청소가 충분하지 않음을 나타낼 수 있습니다. 이 경우 칩에서 튜브를 분리하고 5단계에 설명된 청소 절차를 따르십시오. 전체 시스템을 철저히 청소한 후에도 막힘이 계속 발생하면 미세유체 플랫폼의 내부 필터가 고장났음을 나타낼 수 있습니다. 필터를 새 필터로 교체하면 문제가 해결될 수 있습니다.
2. 원하는 경우 미세유체 칩을 재사용하십시오.
   알림: 칩을 제대로 보관하지 않으면 친수성을 잃을 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 가스 나사산의 핀치 오프가 그림 5E에 표시된 패턴과 유사할 수 있습니다. 이러한 경우 일관되고 안정적인 마이크로버블 생산을 보장하기 위해 친수성 새 칩으로 전환하는 것이 좋습니다.

결과

이 프로토콜에서 우리는 흐름 초점 미세유체 칩을 사용하여 실온에서 안정적인 단분산 미세 기포를 생성하는 방법을 제시합니다. PDMS 칩은 그림 1과 같이 마스터 금형에서 주조하여 제작됩니다. PDMS 칩을 유리 슬라이드에 접착하기 위해 플라즈마 처리가 사용됩니다. 플라즈마 처리는 PDMS 표면을 소수성에서 친수성으로 변경하므로 매우 중요합니다. 이러한 친수성은 마이크로버블 생성 중에 가스 스레드의 모양과 위치를 유지하는 데 필수적이며, 일정한 크기로 단분산 마이크로버블을 장기간 안정적으로 생성(몇 시간 정도)할 수 있습니다(그림 5D). 특히, 친수성 칩에서 가스 스레드는 모세관 힘을 통해 가스 입구 채널의 모서리에 고정되어 안정적이고 대칭적인 핀치오프 가스 스레드 형상을 유지하기 때문에 기하학적으로 안정화된 상태를 유지합니다. PDMS 표면이 친수성을 잃으면 가스 스레드(그림 5E에서 흰색 화살표로 강조 표시됨)가...

토론

이 프로토콜은 미세유체 흐름 초점 칩을 사용하여 실온에서 안정적인 단분산 미세 기포를 생산하고 저장하는 방법을 자세히 설명합니다. 단분산 마이크로버블은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 조영 증강 초음파 영상¹⁸, 비침습적 압력 감지¹⁹ 및 마이크로버블 매개 약물 전달²²에 사용될 수 있습니다.

생산 후 단분산 미세 기포의 안정화는 이전에 최소 90분이 필요한 것으로 보고되었습니다⁴⁴. 이 안정화 기간은 주로 Ostwald 숙성으로 인해 상당한 거품 층이 형성됩니다 44,47,48.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mm 생검 펀치	카이 메디컬	143831
1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸린도디카르보시아닌(DiD)	써모 피셔 사이언틱	D307	친유성 카보시아닌 염료
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜](DPPE-PEG5000)	리포이드	CAS 번호. 384835-61-4
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)	리포이드	CAS 번호. 816-94-4
100mL 유리 계량 실린더	블라우브란트
2 mL 부피 유리 플라스크	블라우브란트
250mL 유리 삼각	블라우브란트
30mL 유리 바이알	DWK 생명 과학	SCERC40752700D0C2
70% 에탄올
75 &도 C 핫 플레이트
접착 테이프
알루미늄 캡	시그마-알드리치	27016
아르곤 가스	린데 가스 베네룩스
C4F10 가스	F2 화학
클로로포름	머크 KGaA	67-66-3
임상적으로 이용 가능  초음파 조영제(즉, 마이크로버블)	Bracco, Plan-LesOuates, 스위스	소노뷰	그림 6A.
수집 및 환기 19G 바늘	100 스테리칸	4657799
쿨터 카운터 멀티사이저 3	베크만 쿨터	입자 특성화 기계
맞춤형 초음파 조영제(즉, 단분산 미세 기포)	NA	F1-10PF	그림 6A. 설명에 따라 제작: Wang, Y. et al. 실온에서 생성된 단분산 인지질 코팅 미세기포의 크기 안정성 및 음향 거동에 대한 Pluronic F68의 영향. ACS 응용 Mater. 인터페이스 2025, 17, 8976−8986. (2025).
맞춤형 초음파 조영제(즉, 단분산 미세 기포)	NA	F2-10 PF	그림 6A. 설명에 따라 제작: Wang, Y. et al. 실온에서 생성된 단분산 인지질 코팅 미세기포의 크기 안정성 및 음향 거동에 대한 Pluronic F68의 영향. ACS 응용 Mater. 인터페이스 2025, 17, 8976−8986. (2025).
데미 워터
외부 LED 조명	지스비텍	GS02370
동결 건조기	메르틴 크라이스트 GmbH	알파 1– 2 LD 플러스
함수 파형 발생기	애질런트	33220A
기밀 유리 바이알	시그마-알드리치	Z113964-288EA
유리 슬라이드	VWR	631-1552
고속 카메라	포트론	노바 S16
호라이즌 미세유체 플랫폼	영국 리즈 대학교		이 플랫폼은 상업적으로 이용 가능하며 Abou-Saleh, RH et al. Horizon: 치료용 미세 기포 및 나노기포 생산을 위한 미세유체 플랫폼. 과학 기기 검토. 92 (7), 074105 (2021).
매트랩	매스웍스	R2023a
메탄올	머크 KGaA	67-56-1
Milli-Q 물
PDMS 젤	실가드	실가르드®   184
인산염 완충 식염수(PBS 1x)	깁코	10010023
플라즈마 클리너	헤니커 사이언티픽	HPT-100 시리즈
플루로닉 F68	써모 피셔 사이언티픽	24040032
고무 마개	시그마	Z166065-100개
배관	마스터플렉스	MFLX06407-41	PTFE, 1/32" ID x 1/16" OD; 25피트
트위터
소용돌이	시그마-알드리치	Z654779
수조 초음파 발생기	이마그	에미 30HC