이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

급성 림프구성 백혈병에 대한 유도 화학 요법에 대한 백혈병 재발의 쥐 모델

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68797

⸱

2025년 10월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 유도 화학 요법에 대한 반응의 역학을 기반으로 급성 림프구성 백혈병의 재발을 생성하기 위한 마우스 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다.

초록

급성 림프구성 백혈병(ALL)은 미성숙 림프구 전구 세포의 신생물이며 가장 흔한 소아 악성 종양 중 하나입니다. 소아 ALL의 치료율은 90%에 육박하지만 재발 및 약물 내성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 이러한 맥락에서 생체 내 암 생물학을 연구하는 것이 필수적이며, 이를 위해 쥐 모델을 이용한 환자 유래 이종이식편(PDX)이 널리 사용되고 있습니다. 그러나 재발된 샘플의 PDX는 또는 진단 샘플과 비교하여 재발 시작 및 진행의 메커니즘을 완전히 평가하지 않습니다. 이 프로토콜은 마우스에서 B-ALL PDX 재발을 생성하는 데 의존하여 약물 내성을 획득하는 과정 전반에 걸쳐 백혈병 세포를 수집할 수 있습니다. B-ALL PDX 세포로 생착된 동물은 ALL 요법에 일반적으로 사용되는 4가지 약물의 조합으로 치료되며, 이는 서로 다른 작용 메커니즘을 나타내며, 덱사메타손, 빈크리스틴, L-아스파라기나제 및 다우노루비신입니다. 4주간의 관해 유도 단계 후, 휴식 기간 동안 동물의 재발을 모니터링합니다. 재발 시간이 단축될 때까지 치료와 재발의 주기를 반복하여 생체 내 약물 내성 증가의 대용자 역할을 합니다. 재발 및 내성의 기저에 있는 메커니즘을 탐색하기 위해 표현형 및 유전자 분석을 위해 각 치료 주기 전후에 백혈병 세포를 수집합니다. 모델을 검증하기 위해 코르티코스테로이드 요법 7일 후 말초 혈액의 모세포 존재와 15일, 33일 및 78/96일에 최소 잔존 질환(MRD)으로 평가한 양호한 반응자와 나쁜 반응자를 모두 포함하여 다양한 소아 ALL 샘플을 테스트했습니다. 마우스에서 관찰된 결과는 환자 데이터와 일치하여 화학 요법에 대한 임상 반응을 모방하는 모델의 정확성을 확인했습니다. 이 접근 방식을 통해 B-ALL의 재발 및 약물 내성에 대한 동적 연구가 가능해 기계론적 조사와 새로운 치료 전략 개발이 지원됩니다.

서론

급성 림프구성 백혈병(ALL)은 어린이에게 가장 흔한 암입니다. 최근 수십 년 동안 고소득 국가에서 5년 전체 생존율이 90%에 도달하는 높은 완치율1 과 새로운 치료 전략을 찾기 위한 주요 노력에도 불구하고 선진국에서는 환자의 15%-20%가 질병에서 재발하며, 생존율은 진단 후 초기(18개월 미만) 또는 이후(36개월)에 발생하는지에 따라 30%-60% 사이에서 다양합니다2, 3. 이를 고려할 때 불응성 및 재발성 모두는 극복해야 할 과제로 남아 있습니다. 진단 측면에서 불응성 ALL은 화학 요법에 대한 민감도가 낮다는 점에서 재발과 구별되는 반면, 재발성 ALL은 일정 기간 관해 후 질병이 재발하는 것이 특징입니다. 다른 암과 마찬가지로 ALL은 이수성, 염색체 재배열, 다양한 치료 반응 및 재발 위험과 관련된 다양한 유전자 돌연변이를 포함한 유전적 이상을 특징으로 합니다4. ALL 재발은 이미 최대 강도 화학 요법을 받은 고위험 환자에서 더 자주 발생하기 때문에 약물 용량 또는 조합에 대한 추가 조정만으로는 충분하지 않을 것입니다. 대신 약물 내성과 재발의 기저에 있는 메커니즘을 식별하는 데 노력을 기울여야 합니다.

이에 비추어 연구자들은 화학 요법에 의해 가해지는 선택 압력이 저항성 세포의 출현에 어떻게 기여하는지 이해하려고 시도했습니다. 대부분의 기존 문헌은 진단 당시 이미 존재했던 내성 악성 하위 클론의 전파로 재발합니다5. 그러나 최근 연구에서는 전사 프로그램을 조절하는 후성유전학적 변형과 같은 대체 메커니즘의 존재를 시사하며, 이는 재발에도 기여할 수 있습니다6.

모든 재발을 연구하기 위해 정확한 생체 내 모델을 만드는 데 상당한 노력을 기울였습니다. 면역결핍 마우스는 ALL 생착에 성공적으로 사용되어 원래의 질병 특성을 보존하여 7,8 환자 유래 이종이식편(PDX)의 개발로 이어졌습니다. 이 모델은 호환 가능한 미세 환경에서 원래의 종양/백혈병 세포의 생착 및 증식을 허용합니다. 주요 장점 중 하나는 화학 요법에 대한 이식된 ALL 세포의 반응을 평가할 수 있다는 것입니다9.

PDX 모델은 또한 ALL 재발을 모방하고 연구하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, Samuels et al.10 이 개발한 프로토콜은 유도 유사 화학 요법에 대한 내성 메커니즘을 조사하기 위해 환자 백혈병 세포를 이식한 비만이 아닌 당뇨병/중증 복합 면역결핍(NOD/SCID) 마우스를 사용했습니다. 저자는 빈크리스틴, 덱사메타손, L-아스파라기나제 및 다우노루비신(VXLD)을 사용한 치료에 대해 설명하고 치료 주기 수와 재발 시기의 예를 제공했습니다. 그러나 이 모델은 치료 직후 세포(초기 치료에서 살아남은 세포)를 분석하는 데 중점을 두었으며 재발보다는 최소 잔존 질환(MRD)을 나타낼 가능성이 높습니다.

보다 최근의 연구에서는 ALL 이식 NOD의 단기 치료 여부를 평가했습니다. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid gamma 또는 NSG) 면역결핍 마우스는 해당 환자의 재발을 예측할 수 있습니다11. 재발 환자와 비재발 환자 모두의 중간 위험 ALL 샘플을 마우스에 이식하고 빈크리스틴, 덱사메타손 및 L-아스파라기나제(VXL)로 구성된 유도 유사 요법으로 치료했습니다. 생착까지의 시간과 치료 후 재발을 측정하고 비교했습니다. 결과는 이 PDX 모델이 환자 결과를 예측하기 위한 예후 도구 역할을 할 수 있음을 시사했습니다. 이 발견은 ALL 재발의 생물학을 연구하는 데 있어 PDX 마우스 모델의 유용성을 뒷받침합니다. 예를 들어, 재발의 기저에 있는 메커니즘을 밝히기 위해 재발 세포를 다른 시점에서 검사할 수 있었습니다.

이 원고에서 우리는 B-ALL 재발을 연구하기 위한 PDX 마우스 모델의 개선 사항을 제시합니다. 우리는 유도 화학 요법에 의한 형성 후 질병 재발과 재발 세포의 특성을 연구하는 것을 목표로 합니다. 빈크리스틴, 덱사메타손, L-아스파라기나제 및 다우노루비신의 4가지 약물 유도 유사 요법이 NSG 마우스 균주를 사용하여 표준화되었습니다. 이 균주는 Prkdcscid 돌연변이와 유전 독성 스트레스에 대한 민감도 증가로 인해 반복되는 화학 요법 주기를 견디는 데 한계가 있는 것으로 알려져 있습니다12. 따라서 동물의 체중을 치료 독성의 지표로 모니터링했습니다. B-ALL 재발 모델은 세 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다: (1) 말초 혈액에서 0.2-1% 인간 CD45⁺ 세포의 생착 역치를 목표로 하는 ALL 세포를 마우스에 이식하는 것; (2) 4주간의 화학 요법 치료 후 첫 번째 재발(R1)까지 휴식 기간; (3) R1 검출 시 1주간의 유도형 치료 주기를 반복합니다. 후속 재발(R2, R3... RN)이 발생할 수 있으며 치료와 재발 사이의 간격(Δt)이 기록됩니다. Δt의 점진적인 단축은 후천적 약물 내성의 징후로 해석됩니다. 재발 메커니즘에 대한 보다 심층적인 조사의 일환으로 B-ALL 세포는 프로토콜의 여러 단계 전후에 수집될 수 있습니다. 재발 발생과 세포 회복 사이의 시간에 따라 이 현상의 고유한 메커니즘이 보존되지 않을 수 있음을 강조하는 것이 중요합니다. 이를 고려할 때, 재발 확인 후 재발 세포를 신속하게 채취하는 것이 매우 중요합니다. 수집된 세포는 세포 주기 역학, 세포 이동, 백혈병 개시 세포 빈도, 염색체 변화 및 후성유전학적 변형 등의 평가를 포함하여 향후 표현형 및 유전적 분석에 사용될 수 있습니다.

이 기사에서는 재발 마우스 모델을 설명하는 데 중점을 둘 것입니다. 이식, 첫 번째 재발까지의 치료(R1), 다중 재발까지의 주기적 치료(R2, R3...)의 세 가지 실험 단계에 대한 자세한 정보가 제공됩니다. 우리는 이 모델을 통해 연구자들이 다양한 아형에서 화학 요법 내성 B-ALL 세포를 생성하여 재발과 관련된 세포 및 분자 변화에 대한 심층적인 조사를 가능하게 하기를 바랍니다. 궁극적으로 이는 저항 메커니즘에 대한 더 나은 이해에 기여하고 보다 효과적이고 개인화된 치료법 개발을 촉진할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 동물 실험은 Centro Infantil Boldrini(CEUA/Boldrini 0047-2024)의 Comissão de Ética no Uso de Animais의 규정 및 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 백혈병 샘플은 정보에 입각한 동의서를 통해 세포 사용을 허용한 Centro Infantil Boldrini에서 치료받은 환자의 바이오뱅크 바이알에서 얻었습니다. 이 프로젝트는 기관 윤리 위원회(CAAE 34601120.7.0000.5376)의 승인을 받았습니다.

1. 백혈병 세포 이식 및 생착 모니터링

  1. 마우스 이식을 위한 백혈병 샘플 준비
    1. 환자의 골수 흡인액에서 채취한 ALL 세포의 이전에 냉동 보존된 샘플을 해동합니다. 37°C로 설정된 수조를 사용하십시오. 냉동 튜브를 원을 그리며 움직여 샘플을 해동합니다.
    2. 해동된 샘플을 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1x 멸균 PBS 14mL를 샘플에 첨가하여 세포를 세척하고 동결 보존 용액을 제거합니다. 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거합니다.
  2. 이식 용액의 준비
    1. 해동된 세포를 멸균 1x PBS에 재현탁합니다. 이식할 각 동물에 대해 100μL의 PBS 부피에 5-10 x 106 개의 생존 세포를 사용합니다. 이식할 때까지 이식 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 세포는 반자동 방법13에 따라 계수되었습니다.
  3. 마우스 이식
    1. 2개월 된 수컷 또는 암컷 NOD를 선택합니다. 백혈병 이식을 위한 Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스.
      참고: 동물 성별 간섭이 없는 균질한 실험 설계를 유지하기 위해 ALL 샘플을 마우스 성별 모두에 이식하여 모든 양호한 백혈병과 나쁜 반응자 백혈병이 남녀 모두에서 동등하게 대표되도록 했습니다. 그 결과, 암컷 마우스가 수컷 마우스보다 더 빨리 생착하는 것을 발견했습니다. 이를 고려하여 향후 분석(예: 생착 동역학)에서 마우스 성별의 간섭 가능성을 피하기 위해 동일한 백혈병 샘플로 작업할 때 하나의 마우스 성별만 사용하는 것이 좋습니다. 한 성별을 다른 성별보다 우선적으로 선택하기 위해 다른 매개변수는 사용되지 않았습니다.
    2. 동물을 적절하게 격리할 수 있도록 한 번에 한 마리의 쥐를 안전하고 승인된 쥐 덫에 넣으십시오. 동물의 꼬리가 트랩 외부에 있고 이식을 위해 쉽게 접근할 수 있는지 확인하십시오.
      참고: 백혈병 세포는 정맥(i.v.) 주사에 의해 마우스에 이식됩니다. 확립된 프로토콜은 이러한 목적을 위해 꼬리의 측면 정맥을 사용합니다11.
    3. 적절한 정맥 확장을 보장하기 위해 적외선을 사용하십시오. 멸균되고 날카로운 일회용 주사 바늘을 사용하여 이식 용액 100μL를 주입합니다. 이식된 마우스를 병원균이 없는 특정 시설에 보관하십시오. 15일 동안 쉬게 하십시오.
      1. 적외선을 사용하려면 이미 구속된 동물을 케이지 밖에 두고 빛에서 30cm 떨어진 곳에 두십시오. 잠재적인 광력에 따라 노출 시간을 조정하십시오. 중간 전력 조명을 사용할 때 정맥 확장을 보장하려면 5분이면 충분합니다. 꼬리를 장기간 노출시키면 동물에게 화상과 스트레스를 줄 수 있습니다.
      2. 주사의 경우 바늘이 부착된 인슐린 주사기를 사용하며, 용량은 1mL이고 바늘 크기는 12.7mm x 0.33mm입니다. 사용된 바늘의 사양은 재료표에서 확인할 수 있습니다. 마우스를 12시간/12시간 빛/암순 주기 요법으로 유지합니다. 또한 이 연구에 사용된 동물을 환경적으로 풍부한 고압멸균 가능한 반투명 호박색 폴리카보네이트 케이지에 보관하여 둥지를 만듭니다.
  4. 말초 혈액 채취
    1. 접종 2주 후 및 그 이후에는 매주 각 마우스로부터 50μL 말초 혈액 샘플을 수집합니다.
    2. 왼손으로 동물을 수동으로 제지하여 머리가 단단히 고정되도록 합니다. 오른손으로 멸균되고 날카로운 일회용 란셋을 사용하여 동물의 턱밑 신경총의 안면 정맥에 구멍을 뚫습니다.
      참고: 이것은 마우스에게 잠재적으로 유해한 절차이므로 신중하게 수행해야 합니다.
      1. 구속 중에 동물이 쉽게 숨을 쉴 수 있는지 확인하십시오. 호흡수의 변화(숨가쁨)와 입 색깔의 변화(보라색이나 진한 파란색으로 변하지 않아야 함)를 관찰하십시오. 턱밑 신경총에 제대로 구멍이 뚫리지 않으면 외이도 천자로 인해 귀 출혈이 발생할 수 있습니다. 미래의 실험자를 안내하기 위해 신경총의 적절한 위치를 보장하기 위해 보충 그림 1 을 사용할 수 있습니다.
        참고: 대안으로 꼬리 정맥 출혈을 사용하여 혈액 샘플을 수집할 수도 있습니다.
    3. 수집 후에는 동물을 방치하지 마십시오. 활동적이고 무해해야 합니다. 쥐가 떨어지고(머리 또는 몸) 움직이지 않는 징후를 보이면 안락사시켜야 합니다. 더 많은 양의 혈액이 동물을 사망시킬 수 있으므로 50μL를 초과하지 마십시오.
    4. 샘플 응고를 방지하기 위해 수집된 혈액 샘플을 8μL의 50mM EDTA가 들어 있는 1.5mL 원심분리기 튜브에 보관합니다.
      참고: 여기에서는 이전에 준비된 EDTA 용액을 항응고제로 사용했습니다. 원하는 경우, 채혈을 위한 상업적으로 이용 가능한 소용량 EDTA 튜브도 이 단계에서 사용할 수 있습니다. 혈액 샘플은 당일 처리해야 합니다.
  5. 처리를 위한 말초 혈액 샘플 준비
    1. EDTA로 혈액을 균질화합니다. 혼합물 50μL를 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.
    2. 항-마우스 CD45 항체(mCD45), 항-인간 CD45 항체(hCD45), 항-인간 CD19 항체(hCD19) 및 희석제로 멸균 1x PBS로 구성된 각 샘플에 첨가할 항체 혼합물을 준비합니다.
  6. 혈액 샘플 처리
    1. 각 혈액 샘플에 항체 혼합물 10μL를 첨가합니다. 검지로 가볍게 두드려 균질화합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 세포분석기의 사용 가능한 채널을 고려하여 위에서 설명한 적절한 항체를 선택하십시오. 샘플당 사용되는 항체의 양을 결정하려면 각 항체에 대해 적정 곡선을 수행하는 것이 좋습니다. 본 연구에 사용된 항체, 형광색소 및 샘플에 대해 선택된 부피는 보충 표 1에 나열되어 있습니다. 항체 카탈로그 번호 및 클론 이름에 대한 전체 설명은 재료 표에 나열되어 있습니다.
    2. 각 샘플에 상업용 1x 적혈구(RBC) 용해 용액 1mL를 추가합니다. 검지로 격렬하게 균질화합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 배양합니다.
      참고: 이 단계에서 사용되는 용해 용액은 시중에서 판매되는 10x RBC 용해 용액입니다. 다른 시약을 사용하는 경우 용해를 위한 1x 작업량을 조정해야 합니다.
    3. 첫 번째 세척 단계를 위해 각 샘플에 멸균 1x PBS 2mL를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 200 x g (스윙 로터에서)에서 샘플을 원심분리합니다. 상청액을 뒤집어 부드럽게 버리고 종이 타월로 부드럽게 닦아내어 튜브 상단에 남아 있는 액체를 말립니다.
      참고: 세척 단계에서 백혈병 세포는 세포 분석기 튜브 바닥에 펠릿화되고 나머지 액체는 폐기됩니다. 어떤 경우에는 펠릿을 식별하지 못할 수 있으므로 샘플을 취급할 때 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 펠릿의 무결성을 보장하려면 시료를 흔들면 손실될 수 있으므로 시료를 흔들지 마십시오.
    4. 1.6.3단계를 반복합니다. 검지로 세포 분석 튜브를 부드럽게 두드려 200μL의 멸균 1x PBS로 백혈병 세포를 재현탁합니다. 샘플은 유세포 분석으로 분석할 준비가 되었습니다. 생착 모니터링은 채혈과 같은 날에 수행되어야 합니다.
  7. 유세포 분석을 통한 생착 모니터링
    1. 표준 유세포 분석 방법론 9,14를 사용하여 마우스 CD45+ 세포(% hCD45+)에 비해 말초 혈액에서 인간 CD45+ 세포의 백분율을 결정합니다.
    2. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 전체 CD45 세포(hCD45+ 플러스 mCD45+)에 대한 hCD45+의 백분율을 후속 분석하기 위해 유세포 분석으로 생성된 데이터를 수집합니다.
      참고: 생착을 적절하게 모니터링하려면 다음 분석 단계를 같은 날에 수행해야 합니다. 이 일일 순서는 월요일부터 시작하는 것이 제안되는 향후 치료 일정의 시작을 고려할 때 특히 중요합니다. 월요일에 시작할 수 없는 경우 말초 혈액의 hCD45+%(0.2%-1%) 달성에 따라 요일 중 언제든지 치료를 시작할 수 있습니다.
  8. 유세포 분석 데이터 분석을 위한 환경 준비
    1. 유세포 분석 소프트웨어를 출시합니다. 수집된 데이터를 가져오고 도구에서 인식할 때까지 기다립니다.
    2. 초기 샘플의 데이터를 열어 림프구로 표시된 게이트를 만듭니다. 축 설정 확인: X축은 FSC-A 를, Y축은 SSC-A 를 선택합니다. 상단 게이트 생성 패널에서 폴리 라이너 도구를 선택하고 주 세포 집단의 윤곽을 그립니다.
      참고: 림프구는 일반적으로 X축에서 50,000-100,000개, Y축에서 0-50,000개 사이에 나타납니다. 각 백혈병의 특성에 따라 값이 달라질 수 있습니다.
    3. Gated Population을 더블클릭하여 새 게이트를 생성합니다. 셀 이중선을 제외하려면 X축에 FSC-A를, Y축에 FSC-H를 설정합니다. 폴리라이너 도구를 사용하여 1차 세포 집단을 분리합니다. X축을 따라 멀리 있는 이벤트를 제외하고 인구 주위에 게이트를 가깝게 그립니다.
      참고: 이 단계는 개별 셀 이벤트를 구분합니다.
  9. 세포 집단을 구별하기 위한 세포 분석 패널 만들기
    1. 선택한 모집단을 두 번 클릭하여 인간과 마우스 CD45 세포를 구별합니다. X축을 mCD45 형광단으로, Y축을 SSC-A로 설정합니다. 모양 도구를 사용하여 mCD45 음성 모집단 주위에 정사각형을 그립니다.
    2. 결과 모집단을 두 번 클릭하여 hCD19+ 및/또는 hCD45+ 세포를 구별합니다. X축을 hCD19 형광단으로, Y축을 hCD45로 설정합니다. 게이트 생성 패널에서 수직선을 선택하여 고유한 모집단을 구분합니다.
      참고: 대안으로, 연구자는 hCD45 및 mCD45 세포를 구별하기 위한 게이트 또는 가능성을 사용할 수 있습니다. 이 가능성은 사건의 합계를 100%로 간주하여 모집단을 식별하기 위한 보다 정확한 전략을 만듭니다.
  10. 생성된 패널에 통계 적용
    1. 모든 획득 사건에 대한 각 분리된 세포 집단의 백분율을 계산합니다. 기본 소프트웨어 창에서 각 샘플의 기본 그래프에서 파생된 하위 그래프 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 통계 생성을 선택합니다. 열린 창에서 빈도를 클릭하고 단일 셀을 선택합니다. 각 하위 그래프에 대해 이 단계를 개별적으로 수행합니다.
    2. 모든 표본에 게이팅 전략 및 관련 통계를 적용하기 위해 수행된 모든 수정 사항을 선택합니다. 그런 다음 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 선택한 수정 사항을 기본 소프트웨어 창의 모든 샘플 옵션으로 드래그합니다.
    3. 기본 창에서 테이블 편집기 를 클릭하여 계산된 모든 빈도가 포함된 테이블을 생성합니다. 팝업 창에서 .xls 파일 형식을 선택하고 대상 폴더를 지정한 다음 테이블 만들기를 클릭합니다.
      참고: 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 수행된 모든 단계는 보충 그림 2에서 시각화할 수 있습니다. 이 단계에서 생성된 최종 표에는 시간 경과에 따른 생착 진행을 분석하기 위해 그래프를 생성하는 데 필요한 hCD45+의 백분율이 포함되어 있습니다.
  11. 생착 진행 플로팅
    1. 그래프 플로팅 및 분석 소프트웨어를 실행합니다. XY 테이블 형식을 선택합니다. 기본 창에서 Enter 또는 Import Data into a New Table을 선택하고 X를 Numbers로 설정하고 Y를 Enter replicate values in side-by-side 하위 열로 설정합니다.
    2. 열린 표에서 열 제목을 구성합니다: X 열의 경우 생착 일수를 입력하고 Y 하위 열의 첫 번째 그룹에 대한 PB의 % hCD45+를 입력합니다. 생착 모니터링을 위해 채혈 일수에 해당하는 주사 후 일수로 X 열을 작성합니다. 각 마우스에 대해 주간 수집된 hCD45+ 데이터의 백분율을 Y 하위 열에 수동으로 입력합니다.
    3. 소프트웨어 메뉴의 패밀리 하위 집합에서 데이터 1을 선택합니다. 팝업 창에서 오차 막대가 있는 점 및 연결 선이라는 두 번째 그래프 옵션을 선택하고 평균 및 오차 막대 플로팅을 활성화합니다.
    4. 그래프 축을 원하는 범위로 조정합니다. 메뉴의 오른쪽 상단 모서리에 있는 내보내기를 클릭하여 최종 그래프를 다운로드합니다.
      참고: 단일 ALL을 사용한 실험 중에 수집된 모든 데이터는 실험 시작 이후 시간 경과에 따른 분석을 용이하게 하기 위해 동일한 그래프에 표시되어야 합니다. 그래프 플로팅의 설명 예는 보충 그림 3에서 찾을 수 있습니다.

2. 생쥐의 치료

  1. 약물 작업 솔루션의 준비
    1. 1mg/mL 농도로 빈크리스틴 작업 용액을 준비합니다. 덱사메타손 작동 용액을 4mg/mL로 준비합니다. L-아스파라기나제 작업 용액을 2,000 IU/mL로 준비합니다. 다우노루비신 작업 용액을 2mg/mL로 준비합니다.
      참고: 이 프로토콜에 사용된 약물은 환자15의 임상 치료에 사용되는 약물과 동일합니다. 덱사메타손 작동 용액 비히클은 크레아티닌, 구연산나트륨 이수화물, 수산화나트륨, 중아황산나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 및 주사용 물로 구성됩니다. 빈크리스틴 작용 용액 차량은 만니톨, 황산, 수산화나트륨 및 주사용수로 구성됩니다. L-아스파라기나제와 다우노루비신은 동결건조 형태로 자주 제공됩니다. 이러한 경우 재구성을 위해 권장되는 비히클은 주사용 멸균수이며, 이는 올바른 농도를 달성하기 위해 사용해야 합니다. 반복적인 해동 주기로 인한 약물 활성 손실을 방지하기 위해 약물은 3배 이하로 사용되는 작업 분취량으로 나누어야 합니다.
  2. 백혈병이 발견되었을 때 체중을 측정하는 동물
    1. 마우스의 말초 혈액에서 hCD45+ 세포의 백분율이 0.2%에서 1% 사이의 중앙값 범위에 도달하는 지점에서 치료를 시작합니다. 도달하면 이식된 쥐를 치료를 받는 그룹과 대조군 역할을 하는 두 그룹으로 나눕니다.
    2. 설정된 임계값에 도달하면 백혈병 진행에 대한 매주 모니터링을 지속하십시오. hCD45% 데이터를 지속적으로 수집하여 치료에 대한 반응성, 재발 발생 및 약물 내성 검출을 모니터링합니다.
    3. 치료할 동물의 무게를 잰다. 가중치의 산술 평균을 사용하여 그룹에 투여할 각 약물의 용량을 확인합니다. 대조군 동물의 무게를 측정하여 그룹 간의 체중 증가/감소를 비교합니다.
      1. 다음 약물 용량을 사용하십시오: 빈크리스틴, 0.15mg/kg; 덱사메타손, 5mg/kg; L-아스파라기나제, 1,000 IU/kg; 및 다우노루비신, 1.2mg/kg. 모든 동물의 체중을 일주일에 최소 3회(월요일, 수요일, 금요일)로 측정하십시오. 가중치를 사용하여 약물의 치료 용량을 조정하고 치료 독성 수준을 모니터링합니다.
  3. 작업 용액 분취량에서 약물 투여 용액의 준비
    참고: 약물 투여 용액은 희석제로서 멸균 1x PBS와 매일 투여되는 정확한 부피(동물의 체중에 따라)의 작동 약물 용액(멸균수는 주사용이 아닌 재구성에만 사용됨)으로 구성됩니다. 복강 내 투여되는 약물은 동일한 용액에 결합될 수 있습니다. 그러나 약물을 정맥 주사하는 경우 개별 용액에 넣어야 합니다. 각 동물에게 투여되는 약물 투여액의 부피는 100μL입니다.
    참고: 위에서 설명한 단계에서 바늘이 부착된 멸균 인슐린 주사기(1mL, 바늘 치수 12.7mm X 0.33mm)가 사용되었습니다. 주사기에 대한 전체 설명은 재료 표에서 찾을 수 있습니다.
    1. 월요일에 덱사메타손, 빈크리스틴, PBS로 구성된 약물 투여 용액을 준비합니다. 약물을 복강 내 투여합니다.
    2. 화요일과 목요일에 덱사메타손, L-아스파라기나제, PBS로 구성된 약물 투여 용액을 준비합니다. 약물을 복강 내 투여합니다.
    3. 수요일에 덱사메타손과 PBS로 구성된 약물 투여액을 준비하여 복강 주입합니다. 다우노루비신과 PBS로 구성된 두 번째 약물 투여 용액을 준비합니다. 정맥 주사하십시오.
    4. 금요일에 덱사메타손과 PBS로 구성된 약물 투여 용액을 준비합니다. 약물을 복강 내 투여합니다.
    5. 주말에는 동물들이 쉬도록 하십시오. 4주 동안 치료 주기를 반복합니다.
      참고: 포괄적인 치료 일정은 보충 표 2에서 찾을 수 있습니다. 마우스 치료를 위해 이미 확립된 다른 프로토콜이 테스트되었지만 NSG 균주에 대해 높은 수준의 독성을 초래했다는 점을 명확히 하는 것이 중요합니다. 따라서 제안된 치료 일정은 독성 감소를 위한 표준화 프로세스에 먼저 제출되었으며, 그 결과 이 프로토콜에 제시된 용량 및 투여 빈도가 탄생했습니다. 치료군의 hCD45+ 비율은 치료 투여로 인해 대조군의 hCD45+ 비율에 비해 감소할 것으로 예상됩니다.
  4. 약물 투여 및 백혈병 반응성 모니터링
    1. 복강 내 약물을 투여하기 위해 왼손으로 동물을 수동으로 제지합니다. 복부 부분이 위로 향하도록 동물을 유지하십시오. 복부 부분에서 오른쪽 하단 사분면을 찾습니다.
    2. 오른손으로 멸균되고 날카로운 일회용 주사 바늘을 사용하여 100μL의 약물 투여 용액을 마우스의 오른쪽 하단 사분면에 주입합니다.
      알림: 동물을 제지할 때 주의하십시오. 생쥐에게 해로운 절차가 되어서는 안 됩니다. 채혈과 마찬가지로 호흡기 합병증에 유의하십시오. 복강내 주사의 경우 장기 뚫기를 피하기 위해 항상 바늘을 수직으로 잡으십시오.
    3. 백혈병 세포를 이식하는 데 사용되는 것과 동일한 지침을 따라 약물을 정맥 주사하십시오. 치료 투여 4주 후 ALL 세포가 다시 나타날 때까지 마우스를 쉬게 합니다.
      참고: 투여 경로의 차이에도 불구하고 정맥 주사는 복강 내 주사와 동일한 부피를 사용합니다.
  5. 백혈병 반응성 모니터링 및 첫 번째 재발 감지(R1)
    1. 치료 또는 휴식 단계에서 백혈병에 대한 주간 유세포 분석 모니터링을 중단하지 마십시오.
      참고: 주 5일 치료를 고려할 때 주 초에 모니터링을 수행하는 것이 좋습니다. 우리 연구에서는 항상 월요일에 혈액 수집, 샘플 처리 및 분석을 수행했습니다.
    2. 1.4 - 1.11단계에 따라 모니터링에 필요한 혈액 수집 및 후속 절차를 수행합니다.
      참고: 주어진 휴식 기간 후, R1 세포는 마우스의 말초 혈액에서 hCD45+ 비율의 급격한 증가에 의해 검출됩니다. 치료 종료와 재발 발생 사이의 기간은 다양하며 선별된 각 백혈병에 따라 구별될 수 있습니다. R1이 검출되면 제안된 재발 마우스 모델의 세 번째이자 마지막 단계를 수행해야 합니다. 모니터링 및 반응 분석을 개선하기 위해 Randall et al. (2024)16.

3. 내성 세포가 출현할 때까지 반복되는 치료 주기

  1. 첫 번째 재발 감지
    1. 백혈병 재발(R1로 명명됨)이 있는 마우스, 즉 말초 혈액에서 0.2% hCD45+의 임계값에 도달했을 때 일주일 동안 유도형 치료를 시행합니다. 월요일부터 금요일까지 1주일 동안 4주간의 유도형 치료에 사용되는 약물 투여 일정을 따릅니다.
      참고: 이 시점에서 단 1주일의 치료 투여는 백혈병 세포가 화학 요법에 대한 내성을 얻었는지 여부를 생체 내에서 테스트하는 동시에 결국 화학 요법 압력 하에서 시간이 지남에 따라 백혈병 진행을 연속적인 재발로 유도하는 것을 목표로 합니다. 우리는 과도한 독성과 동물의 손실을 피하기 위한 수단으로 두 번째 4주 일정을 관리하지 않기로 결정했습니다.
    2. 약물 투여의 전체 주가 끝날 때 마우스를 쉬게 하십시오. 1.4 - 1.11단계에 따라 유세포 분석법으로 백혈병 반응의 주간 모니터링을 계속합니다.
      참고: 이 시점에서 백혈병 세포는 치료에 계속 반응할 것으로 예상됩니다. 결과적으로, 백혈병을 모니터링할 때 마우스의 hCD45+ 비율은 감소하고 일정 기간 동안 음성을 유지해야 합니다.
  2. R2 외관 모니터링
    1. 재발 R2가 나타날 때까지 기다립니다(hCD45+ 세포 ≥ 0.2%). 나타나면 치료 종료와 R2 출현 사이의 경과 시간을 계산합니다. 이 기간을 Δt1이라고 부릅니다.
    2. 유도형 치료 투여의 두 번째 주를 진행합니다. 이 일정의 첫 번째 관리와 동일한 지침을 따릅니다.
    3. 치료가 끝나면 마우스를 쉬게 하십시오. 백혈병 모니터링을 계속하십시오.
  3. R3 외관 모니터링
    1. 재발 R3이 나타날 때까지 기다립니다. 3.2.1단계와 같은 방식으로 시간을 계산합니다. Δt2라고 부릅니다.
    2. Δt1과 Δt2를 비교하십시오. 위의 단계를 N회 반복하여 다발성 백혈병 재발(R1, R2... RN) Δt 기간이 동일하게 유지되는 경우. Δt 기간이 단축되면 치료 주기를 중지합니다.
      참고: 재발에 대한 Δt의 감소는 백혈병 세포에 의해 획득된 약물 내성의 표시입니다. 이 결과는 화학 요법 내성 ALL 세포를 생성하는 재발 마우스 모델의 능력을 강화합니다.
    3. 아래 4단계에 설명된 대로 백혈병 세포를 회수합니다. 냉동 보존 또는 의도된 후속 분석과 호환되는 방부제를 사용하여 산 채로 보관하십시오.
      참고: 백혈병 세포의 회복을 위한 권장 사건은 최근 문헌16에 기술된 바와 같이 말초 혈액에서 hCD45+의 최대 25%입니다.

4. 장기 적출을 통한 백혈병 세포 회복

  1. 화학 마취제 과다 복용으로 생쥐 안락사
    1. 화학 마취제의 과다 투여에 의해 마우스를 안락사시킨 후 아래에 설명된 대로 안락사 확인을 위해 자궁경부 탈구를 시행합니다.
    2. 심부 마취를 위해 멸균 1x PBS에 희석된 3가지 마취제를 포함하는 혼합물을 준비합니다. 안락사시킬 각 동물에 대해 150μL의 상업용 아세프로마진 말레산염, 50μL의 상업용 자일라진, 80μL의 상업용 케타민 및 220μL의 PBS를 사용합니다.
    3. 준비된 혼합물 500μL를 복강내 주사로 투여합니다. 2.4단계에서 설명한 것과 동일한 구속 및 주입 지침을 따릅니다.
    4. 화학 마취제의 과다 복용의 영향으로 생쥐는 케이지 바닥에 눕게 됩니다. 몇 분 후, 쥐가 호흡 정지 상태인지 관찰하십시오. 그렇다면 호흡 노력이 멈출 때까지 기다리십시오. 안락사 절차가 효과적인지 확인하려면 동물의 뒷다리 중 하나에 압력을 가하여 비자발적 반사의 존재를 확인하십시오. 안락사를 확인하려면 자궁경부 탈구로 진행하십시오.
  2. 자궁경부 탈구
    1. 몸의 뒤쪽을 케이지 사료 화격자에 대고 동물을 잡습니다. 왼손의 검지와 엄지손가락을 사용하여 핀셋 모양을 만듭니다. 핀셋 모양의 손가락을 동물의 머리 바로 아래에 놓습니다. 척추의 경추 부분을 단단히 누르십시오.
    2. 오른손으로 동물의 꼬리를 잡습니다. 동물의 머리가 몸의 나머지 부분과 분리될 때까지 단단하고 꾸준한 동작으로 다시 당깁니다.
      참고: 자궁경부 탈구는 안락사를 확인하기 위해 허용되는 방법 중 하나입니다 17,18,19. 호흡 정지 후 최소 15분 동안 CO2에 계속 노출되는 것과 같은 다른 방법을 대안으로 사용할 수 있습니다.
  3. 장기 적출을 위한 동물 준비
    1. 쥐의 몸 전체에 70% 알코올을 발라 소독합니다. 동물의 몸을 설치류용 수술 플랫폼 위에 복부 부분이 위로 향하도록 놓습니다. 몸의 복부 부분을 면도하십시오.
      참고: 설치류를 위한 수술용 수술 플랫폼에 대한 전체 설명은 재료표에서 찾을 수 있습니다.
  4. 비장 수확
    1. 멸균 수술용 가위와 핀셋으로 복부 피부에 작은 절개를 합니다. 복부에서 제거하여 복막을 노출시킵니다.
    2. 복막에 작은 절개를 합니다. 복부에 있는 장기에 완전히 접근할 수 있을 때까지 자릅니다.
    3. 동물의 위 바로 아래에 있는 비장을 찾으십시오. 비장을 제거하십시오. 추가 처리를 위해 멸균 1x PBS가 들어 있는 수용자에 넣습니다.
  5. 대퇴골 채취
    1. 동물의 뒷다리에 접근하기 위해 복막강을 엽니다.
    2. 대퇴골을 찾으십시오. 골반 뼈와 경골 및 비골과 결합하는 관절을 절단하여 제거합니다. 양쪽 대퇴골에 대해 이 과정을 수행합니다.
    3. 남아 있는 근육, 피부 또는 조직을 제거하여 뼈를 청소하십시오. 추가 처리를 위해 멸균 1x PBS가 들어 있는 수용자에 넣습니다. 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 동물의 사체를 버립니다.
      참고: 연구의 목적에 따라 간, 중추신경계, 흉선, 림프절 등에서 ALL 세포를 수집할 수도 있습니다. 이 원고에서는 예를 들어 비장과 골수에서 모든 세포를 수집하는 방법을 설명합니다.
  6. 장기 처리 준비
    1. 50mL 멸균 원심분리기 튜브 1개, 1mL 멸균 주사기 2개, 멸균 25mm x 0.6mm 피하 주사 바늘 1개, 멸균 70μm 세포 여과기 2개를 모으십시오.
  7. 비장 처리
    1. 열린 50mL 원심분리기 튜브 상단에 하나의 세포 스트레이너를 놓습니다. 비장을 세포 스트레이너 표면에 놓습니다. 많은 부분이 보이지 않을 때까지 주사기 플런저의 평평한 부분으로 장기를 침용합니다.
    2. 침용된 비장에 멸균 1x PBS를 추가합니다. 세포 여과를 보장하기 위해 주사기 플런저의 평평한 부분으로 원을 그리며 움직입니다.
      알림: PBS 붓기는 점진적으로 수행할 수 있습니다. 그러나 최종 사용량은 6mL를 초과할 수 없습니다. 비장 처리가 완료되면 세포 스트레이너는 깨끗하고 잔류 조직이 없어야 합니다. 셀 스트레이너가 포화된 경우 대체 셀 스트레이너를 사용할 수 있습니다. 초기 스트레이너의 내용물을 두 번째 스트레이너로 옮길 수 있으며 처리를 계속할 수 있습니다. 이 기관 내의 종양 부담에 접근하기 위해 조직병리학적 평가를 위해 비장의 일부를 분리할 수 있습니다.
  8. 골수 처리
    1. 골수 처리를 위한 새로운 세포 여과기를 이미 사용된 원심분리기 튜브에 통합합니다. 골수 구멍에 접근할 수 있을 때까지 대퇴골의 가장자리를 자릅니다. 피하 주사 바늘을 새 주사기에 삽입합니다. 1mL의 멸균 1x PBS를 주사기에 추가합니다.
      참고: 연구 목적에 따라 비장과 골수에서 얻은 모든 세포를 별도로 수집해야 합니다. 이 경우 각 조직에 대해 별도의 원심분리기 튜브를 사용해야 합니다. 이 기관 내의 종양 부담을 평가하기 위한 조직병리학적 평가를 위해 대퇴골의 일부를 분리할 수 있습니다.
    2. 세포 스트레이너 위로 골수 플러시를 실행합니다. 바늘 끝을 골수 구멍의 한쪽에 삽입합니다. 주사기 플런저를 단단하고 일정한 움직임으로 밀어 넣으십시오. 다른 대퇴골에 대해 절차를 반복합니다.
    3. 바늘을 분리합니다. 주사기의 평평한 부분을 활용하여 세척된 골수를 침지합니다. 멸균 1x PBS를 침용된 골수에 첨가합니다. 세포 여과를 보장하기 위해 주사기 플런저의 평평한 부분으로 원을 그리며 움직입니다. 처리 절차가 완료되면 50mL 원심분리기 튜브에는 PBS로 희석된 비장 및 골수 세포의 혼합물로 구성된 총 부피 10mL가 포함됩니다.
      알림: PBS 주입 공정은 점진적으로 실행할 수 있습니다. 그러나 사용되는 최종 부피가 2mL를 초과하지 않도록 하는 것이 중요합니다.

5. 구배 원심분리에 의한 백혈병 세포의 분리

  1. 백혈병 세포 분리를 위한 준비
    1. 15mL 원심분리기 튜브 1개, 멸균 일회용 파스퇴르 피펫, 처리된 장기가 들어 있는 50mL 원심분리기 튜브, 림프구 분리용 밀도 구배 배지를 모으십시오.
      참고: 배지는 원심분리를 통해 밀도 구배를 생성하여 단핵 세포의 분리를 용이하게 합니다. 단핵 세포(림프구, 단핵구 및 ALL 세포)는 배지와 혈장 사이의 경계면에 층을 형성합니다.
  2. 백혈병 세포 분리
    1. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 림프구 분리를 위한 밀도 구배 배지 5mL를 15mL 원심분리기 튜브에 추가합니다. 비장 및 골수 세포의 혼합물 10mL를 배지 층 위에 점차적으로 추가합니다. 튜브를 약 30° 이하의 얕은 각도로 잡고 밀도 매체 층이 교란되지 않도록 튜브 벽을 따라 셀 혼합물을 천천히 추가합니다.
      참고: 이 과정에서 세포가 밀도 배지와 혼합되지 않도록 주의하십시오. 이 과정 중 교란은 원심분리 중 밀도 구배 형성의 실패로 이어질 수 있습니다.
    2. 형성된 상을 방해하지 않도록 스윙 버킷 로터에서 420 x g 의 15mL 튜브를 가속 및 중단 없이 30분 동안 원심분리합니다.
      참고: 백혈병 세포는 밀도 매질과 수성 상 사이에 층을 형성할 것입니다.
    3. 멸균 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 상단 수성상을 제거하고 폐기합니다. 멸균 일회용 파스퇴르 피펫으로 형성된 백혈병 세포 층을 수집합니다. 새 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
      참고: 저밀도 배지 층 중 일부가 백혈병 세포와 함께 피펫팅되더라도 걱정하지 마십시오.
  3. 백혈병 세포 세척
    1. 15mL의 한계에 도달할 때까지 수집된 세포가 들어 있는 튜브에 멸균 1x PBS를 추가합니다.
    2. 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 최대 가속 및 제동을 복원합니다. 상청액을 제거하고 버립니다. 세포를 새로운 멸균 냉기 1x PBS에 재현탁합니다.5.3.3.세포 및 세포 생존력 검사를 진행합니다. 표준 세포 계수 절차 지침13을 따릅니다. 세척된 세포는 항-마우스 CD45 항체(mCD45), 항-인간 CD45 항체(hCD45) 및 항-인간 CD19 항체(hCD19)로 염색한 후 세척 단계 및 데이터 수집을 거친다.
      참고: 다른 원심분리관에서 비장 세포와 골수 세포를 처리하는 경우, 이러한 샘플의 일부를 유세포 분석을 통해 이러한 기관 내의 종양 부담에 접근하는 데 사용할 수 있습니다.
  4. 백혈병 세포 동결보존
    1. 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿으로 내려갑니다. 상청액을 버리십시오. 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 90% 멸균 냉소 태아 혈청(FBS)과 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 구성된 냉동 배지를 준비합니다. 각 냉동 보존 바이알에 이 용액 1mL를 사용하십시오.
    3. 얼음 위에서 준비된 용액에 2 x 107 cells/mL의 농도로 세포를 재현탁합니다. 세포를 냉동 보존 튜브에 분취합니다. 표준 세포 배양 동결 보존 지침에 따른 동결 보존 세포20.
      참고: 이 셀은 추가 분석에 사용할 수 있습니다. 생존 가능한 세포를 동결하는 대신 후속 DNA, RNA, 단백질 및 대사산물 분석을 위해 세포를 분취하여 다양한 방부제로 보존할 수도 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

본 연구의 맥락에서 전구체 B 세포 ALL 샘플은 두 개의 환자 그룹에서 선택되었습니다: 하나는 15일, 33일 및 78/96일에 말초 혈액에 백혈병 세포가 없고 골수에 잔류 백혈병 세포가 없음에 의해 결정된 바와 같이 유리한 반응을 보였습니다. 다른 그룹은 표 1과 같이 최소 잔존 질환(MRD)에 의해 평가된 임상 반응이 좋지 않은 환자로부터 얻은 이전 그룹의 분자 하위 그룹과 일치하는 ALL에 의해 형성되었습니다.

선택된 ALL 샘플을 꼬리 정맥을 통해 NSG 마우스에 이식하고 말초 혈액의 유세포 분석을 통해 매주 모니터링했습니다. 유세포 분석기의 데이터는 1.7 내지 1.10 단계에 설명된 대로 유세포 분석 분석 소프트웨어를 사용하여 처리되었습니다. 단계 1.11에서 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

신생물성 질환의 기저에 있는 생물학적 메커니즘을 이해하는 것은 보다 효과적인 치료법을 개발하고 환자 결과를 개선하는 데 필수적입니다. 소아 급성 림프구성 백혈병과 같은 상태에서 이러한 조사 접근법은 치료율 증가와 관련이 있을 뿐만 아니라 표준 치료가 치료 강도 및 내약성의 한계에 도달한 환자에게도 특별한 가치를 지닙니다. 재발 및 치료 저항성 상황에서는 더 이상 화학 요법 요법을 조정하는 것만으로는 문제를 해결할 수 없습니다. 대신, 현재의 한계를 극복할 수 있는 새로운 치료제 개발에 정보를 제공할 수 있는 내성의 분자 및 세포 메커니즘을 밝혀내야 합니다.

재발과 치료 저항성의 기저에 있는 메커니즘을 밝히기 위해서는 강력하고 생리학적으로 관련된 실험 모델의 개발이 필수적입니다. 이 중 동물 모델, 특히 쥐 시스템은 생체 내 미세 환경 내에서 백혈병 진행을 조사할 수 있는 고유한 플랫폼을 제공하여 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

Centro Infantil Boldrini와 연구를 위해 샘플을 기증해 주신 모든 환자들에게 감사드립니다. Manuella M. Hoff는 상파울루 연구 재단(FAPESP, 2024/03383-2)으로부터 COORDENAÇÃO de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)으로부터 펠로우십을 받았습니다. José A. Yunes는 National Counsel of Technological and Scientific Development(CNPq, 308399/2021-8)로부터 생산성 펠로우십을 받았습니다. 이 작업은 PRONON 프로그램(Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45)의 브라질 보건부의 연구 자금 지원으로 지원되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL & nbsp; 주사기BD #309628장기 적출
주사용 멸균수 10mL할렉스 이스타르 인듀아케르; stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/약물 재구성
10배 적혈구 용해 용액바이오레전드#420302쥐 혈액 샘플 처리
5채널 셀 분석기BD 생명과학658226R1유동세포계 및 nbsp;
70 μM 셀 스트레이너팔콤#352350장기 적출
아세프로마진 말레산 Inj 베트닐 LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1쥐 마취
APC 항인간 CD45 - 아이소타입 마우스 IgG1 - HI30 클론바이오레전드#304037림프구 염색
아스파라기나제 10000 U아기나제/메닥#88660100쥐 처리
브릴리언트-바이올렛 605 안티마우스 CD45 - 아이소타입 마우스 IgG2 - 30-F11 클론바이오레전드#103139림프구 염색
다우노루비신파르마린#116880025쥐 처리
덱사메타손아크&에아케이트;#00000066쥐 처리
디메틸 설폭사이드시그마-올드리치#589569림프구 냉동 보존
일회용 바늘 - 0.60 x 25 mm (23G x 1' ’)BD#300388장기 적출
에스테릴 일회용 란셋  옌청 후이다 의료기기  https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/쥐 혈액 채취
에틸렌디아미네테트아세트산생명체 기술#15576-O28EDTA 해법
태아 소 혈청컬틸랩#F083림프구 냉동 보존
유세포계 소프트웨어 분석 - 버전 10.10.0BD 생명과학https://www.flowjo.com/유동 세포분석
그래프 및 플롯 소프트웨어 분석 - 버전 9.5.1닷매틱스https://www.graphpad.com/features그래프 플롯 및 분석
바늘이 부착된 인슐린 주사기 1mL FX 12.7 mm X 0.33 mm데스카팩e0342101쥐 이식 및 약물 투여
케타민 인지세스포 인드&쿠아케테; stria e Comé RCIO LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/쥐 마취
설치류를 위한 다기능 수술 플랫폼켄트 사이언티픽 코퍼레이션https://www.kentscientific.com/products/surgisuite/쥐 수술 절차
PE 항인간 CD19 - 아이소타입 마우스 IgG1 - HIB19 클론바이오레전드#302208림프구 염색
염화칼륨시그마-올드리치P3911-1KGPBS 솔루션
인산칼륨 이염기시그마-올드리치P0662-1KGPBS 솔루션
림프구 분리를 위한 시약시티바#17-1440-02, 6개짜리 및 시간; 100  mL적출된 장기에서 림프구 분리
소금시그마-올드리치S9888-1kgPBS 솔루션
인산나트륨 이염산염산[nbsp;시그마-올드리치S9763-1KGPBS 솔루션
멸균 해부학 해부 핀셋 - 12 cm ABC 0170연구소 Lí 데르120수술용 쥐 수술
멸균 가위 12cm - ABC 0321연구소 Lí 데르136수술용 쥐 수술
빈크리스틴립스#7896094208483쥐 처리
자일라진 인지세스포 인드&쿠아케테; stria e Comé RCIO LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/쥐 마취

참고문헌

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

급성 림프구성 백혈병에 대한 유도 화학 요법에 대한 백혈병 재발의 쥐 모델
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.