중간경적 전세포 뇌 지도화를 위한 주사 전자현미경 호환 광학 영상 방법

Summary

우리는 광학 다층 간섭 단층촬영(OMLIT)이라는 새로운 영상 기술을 도입했는데, 이는 뇌 표본의 모든 세포를 중간 규모에서 편향 없이 촬영할 수 있게 하며, 동일한 샘플에 대한 테이프 기반 직렬 주사 전자현미경의 영상 워크플로우에 원활하게 통합할 수 있게 합니다.

Abstract

뇌의 복잡한 신경망 내 구조적·기능적 관계를 이해하려면 넓은 시야와 세포 내 해상도를 모두 가진 뇌 지도집을 구축해야 합니다. 하지만 현재의 광학 및 전자현미경 영상 방법들은 각각 한계가 있어 단일 표본 내 모든 세포를 영상화하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 이 프로토콜은 광학 다층 간섭 단층촬영(OMLIT)이라는 영상 기술을 도입하여, 전자현미경 샘플 준비 후 생성된 뇌 표본의 모든 세포를 무차별적으로 광학 영상화하여 모든 신경 세포의 완전한 뇌 아틀라스를 재구성합니다. 또한 OMLIT 영상은 자동 테이프 수집 초음파 주사 전자현미경(ATUM-SEM)의 영상 워크플로우와 원활하게 통합될 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 전자현미경 영상 전에 세포의 중규모 구조 정보를 얻을 수 있어, 관심 영역의 정밀한 선택이 용이해지고 고해상도 전자현미경(EM) 영상에 필요한 면적과 데이터 용량을 크게 줄일 수 있습니다. 우리는 성체 마우스 대뇌 피질에서 실제 샘플을 사용하여 이 방법의 정확성과 호환성을 검증하여, 다중 규모 뇌 아틀라스 구축에 대한 광범위한 적용 가능성을 입증하였습니다.

Introduction

신경회로를 세포 및 세포 내 해상도로 포괄적으로 매핑하는 것은 뇌의 구조와 기능을 밝히는 데 필수적입니다. 전통적인 광학 영상 기법인 2광자 현미경¹, 형광 미세 광학 단층촬영(fMOST)^2,3,4, VISoR 시스템⁵는 중규모 신경 영상과 생체 내 기능 영상을 가능하게 했습니다. 하지만 표지가 드문드문에 의존하기 때문에 전체 세포 집단을 포착하지 못합니다. 반면, 기능적 광음향현미경(fPAM)^6,7, 광학 코히런스 단층촬영(OCT)⁸, 정량적 위상 현미경⁹와 같은 라벨 없는 광학 영상 기법은 시야 내 모든 뉴런을 동시에 시각화할 수 있는 잠재력을 지니고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법들은 일반적으로 낮은 축 해상도와 얕은 영상 깊이로 인해 제한되며, 하드웨어 복잡성 때문에 뇌 아틀라스 구축에 널리 적용되는 데 어려움을 겪고 있습니다. 반면, 직렬 단면 전자현미경(ssEM) 기법으로는 직렬 블록 면 SEM(SBF-SEM)^10,11, 집광 이온 빔 SEM(FIB-SEM)12,13,14, 자동 테이프 수집 초음파 미세절 SEM(ATUM-SEM)15,16,17 등이 있습니다는 나노미터 해상도의 밀집된 시냅스 연결성을 밝혀내어 고해상도 커넥토믹스에 필수적인 도구를 제공합니다. 하지만 이러한 기법들은 낮은 처리량, 긴 획득 시간, 제한된 시야각, 높은 데이터 처리 및^{하드웨어 비용 문제를} 겪습니다.

위의 한계를 극복하기 위해 우리는 광학 다층 간섭 단층촬영(OMLIT)이라는 영상 기법을 개발했으며, 이는 초박막 절면의 모든 세포를 무차별적이고 고대비, 광시야로 촬영할 수 있는 저비용과 고처리량 솔루션을 제공하며, 넓은 조직 영역에서 서브마이크론 해상도를 달성합니다. 동시에 OMLIT는 직렬 단면 SEM 워크플로우와도 본질적으로 호환됩니다: 고해상도 전자현미경 이전에 OMLIT은 동일한 단면에 대한 구조 정보를 제공하여 정밀한 ROI 탐색을 가능하게 하고 이후 전자현기 영상에 필요한 면적과 데이터 부피를 크게 줄입니다. OMLIT은 중규모 영상 수준에서 독특한 이점을 제공하며, 서로 다른 공간 규모에 걸쳐 신경 구조 지도를 연결하는 중요한 다리 역할을 합니다. 비파괴적 특성 덕분에 샘플 준비 및 영상에 오스뮴 저항성 형광 단백질¹⁹ 를 사용하는 등 특정 표지 전략과 미래에 통합될 가능성을 유지합니다. 이 방법은 선택된 뇌 영역의 중규모 영상을 가능하게 하여 신경 형태, 양, 분포 및 밀도를 빠르게 파악할 수 있게 합니다. 또한 서로 다른 뇌 영역 내 신경세포 간 축삭 투사와 수상돌기 분포의 정량적 특성 분석도 용이하게 합니다. 영상 결과에서 관심 있는 특정 영역에 대해서는 현장 초음파 세부 정보를 전자현미경을 통해 더 자세히 조사할 수 있습니다.

OMLIT의 영상 원리는 Hao Fan²⁰의 연구에서 설명되었습니다. 간단히 말해, 영상 촬영 과정에서 초박막, 코팅층, 집수 테이프, 전도성 테이프, 웨이퍼가 다층 박막 구조를 형성합니다. 평면파가 이 구조와 상호작용할 때, 반사파가 다양한 계면에서 생성되고 검출 공간에서 겹쳐지며, 재료 간 반사율, 굴절률, 흡수 차이로 인해 광학적 간섭이 발생합니다. 이 원칙을 바탕으로 개발된 MATLAB 기반 시뮬레이션 프로그램은 실험 결과와 합리적인 일치를 보여주었습니다.

OMLIT 영상 방식은 테이프 처리 전략에 따라 두 가지 유형으로 분류할 수 있습니다. 첫 번째는 Cr, Cu, Al, Ag 같은 금속을 사용해 테이프 표면을 코팅하는 고반사 전략으로, 세포질 영역과 수지로 채워진 혈관 내면에서 주변 영역보다 더 높은 광학 강도를 제공합니다. 두 번째는 코팅되지 않은 캅톤 테이프, D-50 테이프, 또는 CNT 코팅된 PET 테이프를 사용하는 저반사 전략입니다. 이 경우 광학 영상 결과는 첫 번째와 반대로, 수지가 풍부한 막이 없는 영역(예: 세포질 및 혈관 내강)이 낮은 강도로 나타납니다.

우리는 두 가지 서로 다른 영상 전략에 맞춘 표준화된 프로토콜을 체계적으로 요약하고 확립합니다. 여기서 제시된 프로토콜은 포괄적이고 상세한 실험 절차를 제공합니다. 또한 실험 중 흔히 겪는 문제점과 제안된 해결책이 요약되어 있습니다. 우리는 저반사율 전략(805 × 857.5 × 11.66 μm³)을 사용하여 획득한 쥐 피질 데이터셋을 제시하는 데 중점을 두며, OMLIT 영상 접근법의 독특한 특징과 장점을 보여줍니다.

Protocol

모든 동물 시술은 중국과학기술대학교의 기관 지침과 관련 국가 규정에 따라 수행되었습니다. OMLIT 영상 샘플 준비는 기존 EM에서 사용되는 것과 동일한 프로토콜을 따르며, 우리가 사용한 구체적인 절차는 다른 곳에서 설명된²¹. 간단히 말해, 마취 후 쥐들은 순차적으로 나트륨 카코딜레이트 완충제, 인공 뇌척수액(ACSF), 그리고 마지막으로 글루타알데히드와 파라포름알데히드가 포함된 고정제를 경관류했습니다. 뇌는 조심스럽게 제거되었고, 약 1× 1 × 1 mm³ 크기의 뇌 조직 블록이 절개되었습니다. 샘플들은 화학적으로 고정되고, 연속 중금속 염색을 거친 뒤 탈수 처리한 후 수지에 삽입되었습니다. 프로토콜의 일반적인 워크플로우는 그림 1에 제시되어 있습니다.

그림 1: 워크플로우 개요. (A) 프로토콜에 언급된 수집 테이프 (왼쪽부터 오른쪽: 폴리이미드, D-50, CNT 코팅 PET). (B) 절단된 샘플의 연속 절획 및 채취. (C) 수집된 단면을 포함한 리본을 원형 실리콘 웨이퍼에 장착하는 것. (D) 광학 현미경 영상, 100 μm 스케일 바. (E) 탄소 코팅. (F) 전자현미경 영상은 그림 1D에 표시된 영역과 일치하며, 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

1. 테이프 준비

참고: 먼지로 인한 테이프 오염을 방지하기 위해 클린룸에서 다음 절차를 수행해야 합니다.

1. 고반사 전략
   1. Kapton(이하 폴리이미드 테이프, 두께 50 μm) 또는 Panlite 필름(이하 D-50, 두께 50 μm)을 선택하여 모터 구동 권선 시스템에 장착합니다. 여기서는 폴리이미드 테이프를 예로 들고 있습니다.
      참고: 이 연구에는 아두이노 보드를 통해 제어되는 스테퍼 모터로 구동되는 모터 구동 권선 장치가 사용되었으며, 이는 스퍼터 플라즈마 콘을 통해 한 릴에서 다른 릴로 테이프를 연결하는 장치였습니다. 드라이브 릴에 테이프가 쌓여 테이크업 릴 직경이 커지면서 테이프 이동 속도가 증가하는 것을 보상하기 위해, 매 360° 회전 후 테이크업 릴의 각속도를 연속적으로 조율하는 프로그램이 작성되었습니다.
   2. 마그네트론 스퍼터 시스템(더블헤드 스퍼터)을 사용해 테이프 표면에 균일한 Cr(또는 Al, Ag, Cu 등 다른 금속)의 얇은 막을 증착합니다. 최적의 증착을 위해 테이프를 스퍼터 타겟에서 80mm 떨어진 곳에 위치시키세요. 공정은 직류 전원과 99.99% 아르곤 가스로 조절된 1.0 Pa 압력에서 진행됩니다.
   3. 테이프 감기 속도를 0.6 mm/s로 설정하여 금속 코팅 두께를 50nm로 만듭니다. 증착 후에는 코팅 응력을 최소화하기 위해 챔버를 고진공 상태에서 천천히 실온(RT)까지 냉각합니다.
      참고: 동일한 테이프에 대한 최적의 코팅 두께는 사용되는 금속 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 테이프의 번역 속도를 조절하여 50, 70, 100, 150, 200 nm 등 다양한 코팅 두께를 달성할 수 있도록 합니다.
   4. 스타일러스 프로파일러, 원자력 현미경, 주사 전자현미경을 사용하여 코팅의 두께와 균일성을 평가합니다.
   5. 80W 출력의 플라즈마 클리너를 사용해 테이프를 친수성으로 청소하고 7 mm/s 이동 속도로 변환하세요. 처리 후 테이프 표면에 떨어진 물방울은 빠르게 얇은 막으로 퍼져야 합니다(그림 2A).
2. 저반사율 전략
   참고: 이 프로토콜은 D-50 테이프 또는 상업용 탄소 나노튜브(CNT) 코팅된 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 테이프 중 하나를 사용할 수 있게 합니다. 전자현미경 영상 중 배경 잡음을 일부 유발할 수 있으므로(강하지는 않지만) 전자현미경 이미지의 분할에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 다음 설명에서는 여전히 D-50 테이프를 예시로 사용합니다.
   1. D-50 필름을 준비하고 전체 시트를 약 7mm 너비의 테이프로 자릅니다. 노출된 한쪽은 조각을 채취하고, 다른 쪽은 긁힘과 오염을 방지하기 위해 무광 필름으로 보호하세요. 다음 실리콘 웨이퍼 장착 단계에서 무광 필름을 제거하세요.
   2. 더 많은 구간을 만들려면 D-50 테이프의 서로 다른 구간을 연결하세요. 테이프 세그먼트 사이의 이음새는 양면 접착 테이프로 고정하세요.
      참고: 테이프 구간을 부착할 때는 리드 테이프가 양면 테이프를 통해 위에서 아래로 이어지는 테이프와 겹치도록 하세요. 접착 면적을 최소화하고 테이프 가장자리에 여유를 남겨 테이프를 감는 과정에서 접착제가 짜여 나가 테이프를 오염시키는 것을 방지하세요(그림 2B).
   3. 플라즈마 클리너를 사용해 테이프를 친수성으로 청소하고 같은 과정을 거치며 앞서 설명한 것과 같은 효과를 얻으세요.
      참고: 금속 코팅과 탄소 스퍼터 단계를 제외하면, 두 전략의 다른 단계는 동일합니다.

2. 직렬 초박 단면 및 테이프 기반 수집

1. 작은 연삭기나 유사한 절단 도구를 사용해 샘플이 있는 쪽의 수지를 거칠게 다듬고, 주변의 빈 수지를 제거하여 샘플 영역을 노출시킵니다.
2. 수지가 박힌 블록을 샘플 홀더에 넣고, 홀더의 손잡이를 조여 블록을 단단히 고정하세요.
3. 샘플 홀더를 마이크로토거의 이동식 팔에 장착하세요. 유리칼이나 다이아몬드 트리밍 나이프(45° 각도로)를 칼홀더에 설치하세요. 현미경 아래에서 샘플 표면을 피라미드 모양으로 다듬고 표면을 매끄럽게 만든다.
   참고: 트리밍된 샘플 블록의 앞뒤 가장자리는 가능한 한 평행해야 합니다( 그림 2C 참조).
4. 샘플 블록의 네 면을 다듬고 매끄럽게 다듬어 가장자리의 과도한 수지를 제거하여 다이아몬드 나이프와의 충돌을 방지하세요. 트림된 블록의 앞뒤 가장자리가 수평으로 정렬되도록 노브를 돌리세요.
5. 트리밍 나이프를 제거하고 45° 각도로 장착한 다이아몬드 나이프로 교체하세요. 미세토름 베이스의 기울기 각도를 6°로 설정하세요. 나이프 홀더를 노브로 천천히 움직여 다이아몬드 칼의 앞 가장자리가 샘플 표면에서 1-2mm 떨어질 때까지 움직입니다.
6. 샘플 표면과 칼날 사이의 밝은 띠를 관찰하고, 띠가 위에서 아래, 그리고 좌우로 균형을 이루도록 기울임 각도를 조절하세요. 이렇게 하면 첫 번째 섹션에 모서리가 아닌 전체 샘플 표면이 포함되도록 할 수 있습니다.
7. 다이아몬드 나이프의 홈에 증류수를 주입하여 액체 수준이 올라가게 하고 칼날이 젖도록 합니다. 그 후 주사기로 물을 일부 제거해 액체 수준이 내려가면 반사가 은빛으로 보입니다.
8. 제어 장치에서 단면 두께(이사), 절단 속도, 절단 창을 설정하세요. 단면 속도를 0.6 mm/s로 조절하고 단면 두께를 60 nm로 설정하세요(비시 속도와 두께는 샘플 품질에 따라 다릅니다).
9. 섹션 진단 시작. 미세토움이 안정적으로 작동하고 균일한 절편이 나오면 절편 절단 과정을 잠시 멈추세요. 잘린 부분과 이물질을 가는 붓으로 제거하세요.
10. 코팅된 테이프 릴과 빈 테이크업 릴을 자동 초박 단면 수집 시스템에 설치하세요. 잠금 메커니즘을 고정하고 테이프가 일정한 속도로 부드럽게 움직이고 빈 릴에 제대로 수집되도록 시험 작업을 수행하세요.
11. 테이프 수집 장치의 수집 헤드를 다이아몬드 나이프의 물에 담가. 샘플 슬라이스 길이의 1.5배 거리에서 수집 헤드의 위치를 칼날과 평행하게 조정하여 절단 단면이 테이프에 부드럽게 수집되도록 합니다. 수집 장치를 안전하게 확보하고 동시에 테이프 수집 장치를 가동하면서 구획 작업을 재개하세요.
12. 충분한 연속 단면을 모으면 단면 작업을 잠시 멈추세요. 섹션이 모이지 않은 구역에서 테이프를 자르고, 남은 테이프가 모두 스풀에 모일 때까지 테이프 수집 장치를 계속 작동시킵니다.
13. 수집된 조각이 담긴 실타래를 제거하여 전자 건조 오븐에 넣으세요. 테이프 수집 장치와 미크토름을 청소하고, 모든 부속품을 제자리에 돌려놓으세요.

그림 2: 절획 전 준비 과정. (A) 친수성 처리 전후의 D-50 테이프 표면에 있는 물방울. (B) D-50 테이프 접합 영역의 상단 및 측면 회로도. 파란색: D-50 테이프; 주황색: 양면 접착제; 초록 화살표: 이동 방향을 표시하세요. (C) 샘플을 절단한 후 정면, 평행한 상단과 하단 가장자리를 보여줍니다. (D) 자동 테이프 수집 장치. a: D-50 테이프 피드 아웃용 테이프 스풀; b: 테이프 회수용 테이프 스풀; 빨간 화살표: 테이프 이동 방향. (E) 자동 테이프 수집 장치의 수집 헤드 위치. 오른쪽 하단의 노란색 상자는 기기가 수집할 신선한 절단 구역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 실리콘 웨이퍼에 장착

참고: 다음 단계에서 작업 공간이 깨끗한지 확인하여 테이프가 먼지로 오염되지 않도록 하세요.

1. 4인치 원형 실리콘 웨이퍼를 미리 세척하고 가수필라이즈된 플라즈마 처리 시스템(80W 출력, 3분)에서 사용하세요.
2. 깨끗한 장갑을 끼고, 실리콘 웨이퍼를 평평한 표면에 올려놓고, 양면 전도성 탄소 테이프를 적절한 길이(양쪽 끝에 2-3cm 돌출부)로 잘라내세요. 양면 전도성 테이프 한쪽 면의 흰색 보호층을 떼어내고, 위에서 아래로 실리콘 웨이퍼에 적용하세요.
   참고: 전도성 테이프의 양면은 약 2mm 간격으로 배치되어야 하며, 테이프의 가장자리가 실리콘 웨이퍼에 보여야 합니다. 25mm 폭의 양면 전도성 테이프의 경우, 4인치 실리콘 웨이퍼 한 장에 세 개의 테이프 구간을 적용할 수 있습니다.
3. 작업대 위에 4인치 실리콘 웨이퍼의 윤곽선을 그리고, 웨이퍼에 적용할 각 테이프 구간의 대략적인 길이를 표시하세요. 구획을 모은 테이프를 이전에 표시된 길이에 맞게 잘라내세요.
   참고: 절단 테이프는 실리콘 웨이퍼의 가장자리를 넘지 않아야 하며, 단면을 절단하지 않습니다.
4. 양면 전도성 테이프에서 투명 보호막을 떼어내고, D-50 테이프의 경우 이 지점에서 테이프 뒷면의 보호막을 제거합니다. 테이프를 양면 전도성 테이프와 평행하게 붙이세요. 양면 전도성 테이프 한 조각에 최대 세 구간의 테이프를 붙입니다.
   참고: D-50 테이프가 어긋나거나 먼지에 오염될 위험을 줄이기 위해, 이전에 벗겨진 투명 필름으로 전도성 테이프 일부를 덮고, D-50 테이프 끝을 부착할 때 전도성 테이프의 일부만 노출되도록 하세요. 이로 인해 테이프의 방향을 더 쉽게 조정할 수 있습니다. 그 후 남은 투명 필름을 천천히 떼어내어 나머지 D-50 테이프가 부드럽게 떨어져 전도성 테이프에 붙도록 합니다.
5. 테이프가 장착된 후에는 테이프와 전도성 테이프 사이에 공기 방울이 생길 수 있어 이후에 영상 작업을 방해할 수 있습니다. 실리콘 웨이퍼를 진공 챔버(또는 기타 진공 장비)에 넣고 진공을 가하세요. 진공 과정이 끝난 후에는 기포가 사라졌는지 확인하세요.

4. 스테인팅 후

1. 4% 우라닐 아세테이트와 3% 시트레이트 납을 준비하고, 물욕 냄비로 50°C까지 예열하세요.
   주의: 우라닐 아세테이트는 방사능을 띠며 간과 신장에 심각한 독성을 가집니다. 시트레이트 납은 납 중독을 일으킬 수 있으며, 신경계, 신장, 조혈계에 영향을 미칩니다. 이 시약들을 다룰 때는 연기 후드에서 수행해야 하며, 실험실 가운, 니트릴 장갑, 마스크, 안전 고글 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 피부나 눈이 마주치면 즉시 충분한 양의 물로 씻고, 실험실 안전 담당자에게 보고하며, 의료진의 진료를 받으세요.
2. 기포가 없는 실리콘 웨이퍼를 진공 처리한 플라즈마 수소친화 시스템에 넣어 수소친화와 세척을 진행합니다.
3. 바늘을 제거한 10mL 주사기를 사용해 0.22 μm 주사기 필터를 부착하고 4% 우라닐 아세테이트를 걸러냅니다. 용액을 해당 섹션에 떨어뜨려 실리콘 웨이퍼 전체 표면이 덮일 때까지 기다린 후 3분간 기다립니다.
4. 증류수로 3분간 세척하고, 3번 반복한 후 질소로 샘플 표면을 드라이하세요.
5. 바늘을 제거한 10mL 주사기를 사용해 0.22 μm 주사기 필터를 부착하고 3% 시트레이트 납을 걸러냅니다. 용액을 해당 섹션에 떨어뜨려 실리콘 웨이퍼 전체 표면이 덮일 때까지 사용한 후 5분간 기다립니다.
6. 증류수로 3분간 세척하고, 3번 반복한 후 질소로 샘플 표면을 드라이하세요.

5. 데이터 수집

1. 광학 현미경
   참고: 이 섹션에서는 광학 현미경의 예시로 연구 슬라이드 스캐너(VS200, 올림푸스)를 사용합니다. Axio Imager.A2 Vario(독일 자이스)와 같은 다른 현미경들도 여기서 설명한 광학 이미징에 적합합니다. 다른 광학 현미경의 절차도 대체로 동일합니다.
   1. 실리콘 웨이퍼를 광학 현미경 스테이지 위에 올려놓고 잔류 없는 접착 테이프로 고정합니다.
   2. 5배 대물렌즈를 사용해 실리콘 웨이퍼, 테이프, 샘플의 개요 이미지를 얻으세요.
   3. 개요 이미지에서 각 섹션을 윤곽선으로 정리하고 정렬한 후, 초점 포인트와 노출 포인트를 추가해 전체 실리콘 웨이퍼 전체에 걸쳐 20배 또는 50배 배율로 자동 이미징을 수행합니다.
   4. 이미징이 완료된 후 이미지를 저장한 후 화질을 확인하세요. 초점이 맞지 않거나 화질이 좋지 않은 이미지가 있으면 다시 초점을 맞추고 다시 이미지를 재배치하세요.
2. 전자현미경
   참고: 여러 종류의 전자현미경이 실리콘 웨이퍼 위에 놓인 초박막 단면의 연속 이미징을 수행할 수 있습니다. 여기서는 멀티빔 505(자이스)를 예로 들었습니다.
   1. 탄소 두께 5.7nm의 고진공 스퍼터 코팅기를 사용하여 샘플 표면에 탄소 코팅을 수행합니다.
      참고: 고반사 전략으로 금속 코팅이 된 테이프나 저반사 전략으로 탄소 나노튜브(CNT)로 코팅된 테이프는 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
   2. 광학 현미경(Axio Imager.A2 Vario, Zeiss)을 사용하여 실리콘 웨이퍼의 광학 내비게이션 맵을 포착하세요.
   3. 실리콘 웨이퍼를 SEM의 시료 챔버에 넣고, 시료 스테이지에 중첩된 두 개의 L자형 마커를 순차적으로 식별하여 광학 내비게이션 지도를 전자현미경 이미지와 연동시킵니다.
   4. 현미경 소프트웨어(v3.2, 64비트)의 SAT 모듈을 사용하여 광학 내비게이션 지도에서 절면 위치와 영상 영역을 반자동으로 식별하세요.
   5. 이미지 픽셀 크기를 4nm, 머무는 시간(dwell time)을 0.8 μs, 초점 지점과 위치, 저장 위치로 설정하세요.
   6. 연속 영상 촬영 시작.

6. 데이터 처리

참고: OMLIT 이미지의 2D 스티칭은 소프트웨어에 의해 자동으로 수행됩니다. 대규모 3D 등록 및 OMLIT 이미지의 분할을 위해서는 더 강력한 AI 알고리즘이 존재합니다. 여기서는 대부분의 실험실이 공정을 검증할 수 있도록 Fiji(v1.54p, 64비트)와 VAST(v1.5.0, 64비트)를 이용한 스티칭, 등록, 세분화를 시연합니다.

1. 피지에서 이미지 데이터셋을 열어 모든 이미지 파일이 담긴 폴더를 피지 인터페이스로 드래그한 후, 버튼이 뜨면 Virtual Stack 을 선택하세요.
2. Rectangle Tool을 사용해 관심 지역(ROI)을 선택한 후 Image > Crop으로 데이터셋을 자르세요.
3. Register Virtual Stack Slices 플러그인(Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices)을 사용해 이미지 스택을 정렬하세요.
4. 정렬된 데이터셋을 TIFF 형식으로 저장하세요 (파일 > Save As > TIFF).
5. TIFF 이미지 스택을 VAST²² 에 가져오기 > 이미지 볼륨 가져오기 → 이미지 → → → VSV 파일.
   참고: 더 자세한 튜토리얼은 웹사이트를 참고하시기 바랍니다: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
6. 외부 태블릿을 연결하여 Draw Segment 모드 의 브러시 도구를 사용해 수동 세그먼트 및 트레이싱을 시작하세요(이미지 슬라이스 간 빠른 탐색은 단축키 A 와 Z 사용).
7. Window > 3D 뷰어> View > Update를 사용하여 세분화된 구조를 3D로 시각화하세요.
8. 세분화 결과를 저장하려면 파일 > 세분화 저장.

Results

프로토콜의 전체 워크플로우(그림 1)는 다양한 수집 테이프를 준비하는 것에서 시작됩니다. 그림 1은 프로토콜에서 언급된 세 가지 테이프 유형(왼쪽부터 오른쪽: Kapton, D-50, CNT 코팅 PET)을 보여주며, 동일한 배경 기판에 놓았을 때 뚜렷한 광학적 특성을 보입니다. 샘플 준비와 블록 트리밍 후, 먼저 몇 개의 단면을 수집하여 전자현미경 영상을 통해 준비가 기대에 부합하는지 확인해야 합니다. 자동화된 테이프 수집 시스템을 사용하면 수천 개의 단면을 수집하여 금속 코팅 테이프 또는 코팅되지 않은 테이프에 부착할 수 있습니다. 이 테이프들은 4인치 실리콘 웨이퍼 위에서 특정 방식으로 배열되어 섹션 배열을 형성합니다(그림 1B, C). 사후 염색 후에는 시료를 광학 현미경 ...

Discussion

여기서 우리는 OMLIT이라는 광학 영상 접근법을 개발했으며, 이는 중간경 영상을 가능하게 하고 테이프 기반 직렬 주사 전자현미경 워크플로우와 호환됩니다. OMLIT 방법을 사용하면 광학 현미경을 통해 뇌 샘플에서 혈관, 세포체, 핵, 주요 수상돌기 가지, 그리고 일부 큰 미엘린 축삭 등 중간경적 구조적 특징을 포착할 수 있습니다. 또한 OMLIT은 직렬 SEM 파이프라인에 원활하게 통합되어 전자현미경 영상 전에 구조 정보를 제공하고, 이후 전자현미경 획득을 위한 관심 영역을 식별하는 데 가이드 역할을 합니다. 우리는 OMLIT 영상 과정의 구체적인 단계를 시연하고, 마우스 피질 샘플에서 그 효과를 검증했습니다.

OMLIT 영상 방식은 고반사율 전략과 저반사율 전략으로 분류할 수 있습니다; 두 작품 모두 테이프를 신중하게 선택하고 다루어야 합니다. 고반사율 전략에서는 OMLIT 영상 효과가 주로 다층 필름 구조의 간섭에...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
접착 테이프	3M	B5005094008	양면 접착제
원자력현미경	브루커	차원 아이콘
자동 초박쇄 절단 수집 시스템	레화	오토컷츠 II
전도성 접착 테이프	테드 펠라	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	브루커	DektakXT
절단용 다이아몬드 나이프	규조	DUJ3530	다이아토메 점보 나이프
다듬기 위한 다이아몬드 나이프	규조	DTB90	유리 칼
전자현미경	자이스	멀티SEM505	대안: 제미니SEM 300, 자이스
FIJI (v1.54p, 64비트)	오픈 소스	https://fiji.sc
유리 장식용 칼	자수성가
납 시트레이트	라이카	T534/2
광학 현미경	올림푸스	VS200	대안: Axio Imager. A2 바리오, 자이스
광각 현미경	자이스	그리고 nbsp; Axio Imager.A2 Vario
플라즈마 클리너	이돈 테크놀로지스	하이드로-S4	대안: Ted Pella Pelco 또는 다른 벤치탑 플라즈마 클리너
폴리머 테이프	멜튼	캅튼	회사 웹사이트는 더 이상 접속할 수 없습니다. 우리는 연구자들이 지역에서 구할 수 있는 KAPTON 테이프를 시도해볼 것을 권장합니다.
폴리머 테이프	테이진	애완동물	https://www.teijin.com/
폴리머 테이프	테이진	D-50	https://www.teijin.com/
실리콘 웨이퍼	사이치	912303	웨이퍼는 한쪽 면이 광택 처리되어 있습니다.
스퍼터 코터와 nbsp;	라이카	ACE600	대안: 더블헤드 스퍼터, 유지에
울트라미세토름	라이카	UC7	대안: RMC PT-PC
우라니아세테이트	응급의료 서비스	22400
VAST (v1.5.0, 64비트)	하워드 휴즈 의학 연구소	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1:D32Lite는 대규모 3D 현미경 데이터셋의 수동 주석 및 분할을 위한 무료 도구입니다.
ZEN 소프트웨어 (v3.2, 64비트)	자이스	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html