방법 논문

PCR 형광 프로브 기반 아스페르길루스 속, 크립토코쿠스 네오포름, 폐자자체의 검출

DOI:

10.3791/68819

⸱

2026년 5월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

이 논문에서

요약

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여기서는 Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jirovecii의 동시 검출을 위한 PCR 형광 탐침법을 기반으로 한 임상 시험 프로토콜을 제시합니다.

초록

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이 프로토콜은 PCR 형광 프로브 기반 핵산 검출 키트를 사용하여 임상 가래 샘플에서 Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jirovecii 의 정성적 검출을 위한 표준화된 절차를 설명합니다. 이 절차는 임상 샘플 채취, 알칼리성 액화 전처리, 자동 핵산 추출, 다중 실시간 PCR 검출을 포함합니다. Aspergillus 속, C. neoformans, P. jirovecii 는 각각 표적 특이적 형광 탐침(FAM, VIC, CY5 채널)을 사용하여 검출되며, 품질 보증을 위해 내부 대조군(ROX 채널)이 통합되어 있습니다. 분석의 유효성과 샘플 결과 해석은 정의된 사이클 임계값(Ct) 컷오프 값을 기반으로 합니다. 양성 대조군은 모든 채널에서 Ct ≤ 33.7의 S자형 증폭 곡선을 보여야 하며, 음극 대조군은 증폭이 없어야 합니다. 임상 샘플의 경우, FAM 채널에서 Ct 값이 33.7≤면 Aspergillus spp. 양성을, VIC 또는 CY5 채널에서 Ct 값이 36≤면 각각 C. neoformans 또는 P. jirovecii에 대해 양성임을 나타냅니다.

서론

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Aspergillus 속, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jirovecii와 같은 침습성 곰팡이 감염은 면역 저하 환자에게 심각한 위협을 가하며, 높은 이환율과 사망률로 이어집니다. 적절한 항진균 치료를 시작하고 임상 결과를 개선하는 데 있어 시기적절하고 정확한 진단이 매우중요합니다. 배양, 현미경, 항원 검출 등 기존 진단 방법들은 뚜렷한 한계가 있습니다. 배양은 시간이 많이 걸리고 감도가 낮으며, 현미경은 종 수준의 식별이 부족하고 조작자에 의존적이며, 항원 분석법(예: 갈락토만난, β-D-글루칸)은 교차 반응성과 일관성 없는 성능을 보일 수 있습니다. 분자 진단, 특히 실시간 PCR은 더 빠른 처리 시간과 높은 민감도와 특이성 가능성을 제공하여 이러한 격차를 일부 보완할 수 있습니다. 다중화 PCR의 발전은 단일 샘플에서 여러 병원체를 동시에 검출할 수 있게 하여 진단 효율성을 향상시킵니다.

이 프로토콜은 인간 가래 샘플에서 Aspergillus spp., C. neoformans, P. jirovecii의 DNA를 18S rRNA 유전자(Aspergillus spp.), ITS 유전자(C. neoformans), mtLSU rRNA 유전자(P. jirovecii)의 보존된 영역을 표적으로 삼아 정성적으로 검출하기 위한 다중화 형광 프로브 PCR 분석법을 설명합니다. 이 방법의 주요 특징은 정의된 분석 민감도입니다: Aspergillus 속, C. neoformans, P. jirovecii의 검출 한계는 1,500 사본/mL입니다; 프라이머/프로브 특이성: 표적 특이적 프라이머와 프로브는 인간 DNA 또는 다른 일반적인 군집과의 교차반응을 최소화합니다; 견고한 오염 통제: dUTP-UDG(우라실-DNA 글리코실라아제) 시스템의 도입은 이전 PCR 증폭체에서 인한 오염 전이 방지를 효과적으로 방지하며, 이는 임상 실험실 환경에서 분석의 신뢰성을 유지하는 데 중요한 특징입니다2; 통합 공정 제어: 인간 RP(리보솜 단백질) 유전자를 표적으로 하는 내인성 내부 대조균을 ROX 형광포어로 표지하여 핵산 추출 무결성을 모니터링하고 PCR 억제 가능성을 식별하여 위음성 결과를 줄입니다. 이 접근법은 분자 진단 품질 보증을 위한 확립된 지침에 의해 뒷받침됩니다 4,5. 이 프로토콜은 주로 혈액종양학 환자나 이식 수혜자와 같은 고위험군의 호흡기 샘플(가래/BALF)에 적용됩니다. 환경 오염으로 인한 거짓 양성이나 과도한 샘플 희석으로 인한 감도 저하 등 잠재적 한계와 완화 전략도 논의됩니다.

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프로토콜

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임상 샘플 사용은 적절한 윤리 위원회(승인 번호: ZYS-GCP-2025006)의 승인을 받았습니다. 모든 참가자는 연구 중 자신의 데이터와 표본 사용에 대해 폭넓은 사전 동의를 제공했습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약과 소모품은재료 능력 목록에 나열되어 있습니다.

1. 샘플 채취

  1. 멸균 용기에 3–5mL의 가래 또는 기관지폐조 세척액을 채취하여 신속하게 검사를 받으세요.

2. 시약 준비

참고: 이 단계들은 시약 준비실에서 수행되었습니다.

  1. -28 °C 냉동고에서 감지 키트를 꺼내 상온(25–30 °C)에서 30분간 완전히 해동하세요.
  2. 총 반응 수(N): N = 시험 샘플 수 (n) + 양성/음성 대조군 (2) + 1
  3. 반응 혼합물을 멸균 마이크로 원심분리관에서 준비하세요. 단일 반응의 경우: 핵산 증폭 혼합물 35 μL + 프라이머-프로브 혼합물 5 μL, 완전히 소용돌이 처리, 그리고 잠시 원심분리.
  4. 각 PCR 튜브에 반응 혼합액 40μL을 알리코트(키트 제조사 프로토콜에 따라)하여 샘플 처리실의 통과 창으로 옮깁니다.

3. 샘플 처리

참고: 이 단계들은 샘플 처리실에서 수행되었습니다. 폐기물 처리: 3.2.2단계의 상청액과 NaOH가 포함된 기타 액체 폐기물을 지정된 화학 폐기물에 버립니다.

  1. 액화
    1. 50mL 스크류캡 튜브에 가래/기관지 치조 세척액(BALF)을 투여하세요.
    2. 가래 점도에 비해 4% NaOH 소화액 1–2부피를 추가합니다.
      주의: NaOH는 부식성이 있습니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하세요.
    3. 캡을 조이고 1분간 소용돌이 상태로 보관한 후, 실온의 생체 안전 캐비닛에서 15분에서 20분간 배양하세요.
  2. 풍부화
    1. 원심분리기는 3,000rpm에서 샘플을 5분간 액화시켰습니다.
    2. 피펫으로 상청액을 버리며, 1,000 μL의 침전물을 남깁니다.
    3. 퇴적물을 완전히 소용돌이로 돌리세요.
  3. 용해
    1. 500 μL 침전물을 용해관으로 옮깁니다. 10분간 소용돌이 후 잠시 원심분리기를 사용했습니다.
  4. 추출
    참고: 폐기물 처리: 생물학적 샘플과 접촉한 사용한 추출판, 팁, 튜브는 승인된 생물학적 위험 폐기물 용기에 폐기되어야 합니다.
    1. 모든 용해액 상청액과 100 μL 양성/음성 대조군을 추출판 2번 열로 옮깁니다.
    2. 지정된 프로그램6을 사용하여 자동화된 핵산 추출 시스템을 사용하여 핵산 추출을 수행합니다.
  5. 샘플 로딩
    1. 추출한 핵산(6번 칼럼)과 대조제 10 μL을 PCR 튜브로 옮깁니다. 잠시 원심분리기를 하고 증폭실 통과 창문으로 옮기세요.

4. 핵산 증폭

참고: 이 단계들은 증폭실에서 수행되었습니다.

  1. PCR 튜브를 자동 핵 증폭 기기에 적재하고 적절한 증폭 템플릿을 선택하세요.
  2. 탐지 채널 할당: Aspergillus 속: FAM 채널; C. 네오포먼스: VIC 채널; P. jirovecii: CY5 채널; 내부 통제: ROX 채널7, 8, 9.
  3. 샘플 이름을 설정하고 프로그램을 실행하세요.

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결과

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이 다중화 형광 프로브 PCR 분석법을 사용하여 얻은 대표적인 증폭 곡선은 그림 1 과 그림 2에 나와 있습니다. 검사 타당성은 미리 정의된 대조 기준을 바탕으로 결정되었습니다. 유효한 실험에서 양성 대조군은 FAM, VIC, CY5, ROX 채널에서 특징적인 S자형 증폭 곡선을 생성했으며, 모든 검출 채널에서 사이클 임계값(Ct) 값은 33.7≤ 나타났습니다(그림 1A). 음성 대조군에서는 어떤 채널에서도 S자형 증폭 곡선이 없었고, Ct 값을 "미결정"으로 보고했습니다(그림 1B). 두 가지 대조 조건이 모두 충족되어야 실험 수행이 유효하다고 인정되었습니다.

임상 샘플 해석을 위해 병원체 특이적 형광 신호...

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토론

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본 연구에서 확립된 다중 실시간 PCR 프로토콜은 임상 가래 샘플에서 세 가지 주요 침습성 진균(Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jirovecii)을 동시에 신속히 검출하는 표준화된 절차를 제공합니다. 이 방법은 임상 표본에서 병원체 DNA를 직접 검출할 수 있게 합니다. 배양, 현미경, 혈청학적 항원 검사와 같은 전통적인 진단 접근법과 달리, 이 분자 방법은 배양에 따른 처리 시간이 길어지고, 현미경의 민감도와 조작자 의존성, 항원 분석에서의 교차 반응성 가능성 등 이러한 기술의 고유한 한계에 노출되지 않습니다.

이 프로토콜의 성공적인 구현은 여러 중요한 단계에서 엄격한 품질 관리에 달려 있습니다. 고품질 곰팡이 DNA를 얻기 위해서는 알칼리성 액화 및 원심분리를 포함한 적절한 샘플 전처리가 필수적입니다. 불완전한 액상화는 세포벽 파괴를 저해하고 핵산...

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공개 사항

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저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포산 산수이 구 인민병원 임상실험실과에 장비와 기술 지원을 제공해 주신 것에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 & 뮤; L 필터 팁 멸균 확장 피펫 팁 (racked)샤오루이 바이오테크놀로지S20221126
1000 & mu; L 멸균 피펫 팁장쑤성 신강 의료기기 유한회사241101
200 & mu; L 확장 필터 멸균 피펫 팁샤오루이 바이오테크놀로지241001
용해관베이징 ZC 생명과학 및 테크놀로지 컴퍼니F1040
Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jirovecii 핵산 검출 키트베이징 ZC 생명과학 및 테크놀로지 컴퍼니CT8143-48T
핵산 추출 시약베이징 ZC 생명과학 및 테크놀로지 컴퍼니CN8053-B40T
샘플 희석 버퍼베이징 ZC 생명과학 및 테크놀로지 컴퍼니SP7065

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

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