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방법 논문

유리체 콜라겐 섬유 네트워크를 시각화하기 위한 공초점 반사 현미경을 위한 돼지 눈 준비

648 조회수

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DOI:

10.3791/68823

⸱

2025년 10월 17일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Utah, 2Department of Biomedical Engineering, University of Utah, 3Department of Chemistry, University of Utah, 4Department of Mechanical Engineering, University of Utah

이 논문에서

요약

이 방법은 공초점 반사 현미경을 사용하여 유리체에서 콜라겐 섬유의 천연 구조를 시각화합니다.

초록

유리체는 수정체와 망막 사이의 공간을 채우는 투명한 젤입니다. 그 구조는 점탄성 특성에 영향을 미치고 망막 질환에 기여할 가능성이 있는 콜라겐 섬유 네트워크에 의해 지지됩니다. 그러나 이 콜라겐 네트워크의 구성은 유리체를 원래 상태로 이미징하는 것이 어렵기 때문에 제대로 특성화되지 않았습니다. 유리체에 적용되는 많은 이미징 기술은 탈수 및 왜곡을 유발하며, 염료 기반 방법은 아티팩트 또는 비특이적 표지를 도입하여 콜라겐 네트워크를 연구하기 어렵게 만들 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 다음을 간략하게 설명합니다: 1) 이미징을 위해 돼지 눈을 해부하는 방법; 2) 도립 현미경에 눈을 장착하는 전략; 3) 공초점 반사 현미경을 사용하여 자연 상태의 유리체 콜라겐 네트워크를 이미징하기 위한 지침; 4) 네트워크 기능의 정량적 이미지 분석 지침. 우리는 일반적인 함정을 강조하고 주요 기술적 포인트를 강조합니다. 우리는 유리체에 대한 공초점 반사 현미경의 적용을 보고합니다. 이전의 유리체 이미징 전략과 비교하여 이 접근법은 외인성 염료나 탈수 인공물 없이 유리체 콜라겐 섬유의 기본 구조, 방향 및 분포를 보존합니다. 공초점 반사 현미경은 건강과 질병에서 유리체 겔 강성의 구조적 기초를 조사할 수 있습니다.

서론

유리체는 눈의 수정체와 망막 사이의 세포외 기질입니다. 망막에 대한 유리체로부터의 견인은 망막 박리, 황반 구멍 및 유리체 황반 견인과 같은 질병의 시력 상실에 중요한 역할을 합니다 1,2,3,4. 망막에 견인력을 전달하는 유리체의 능력은 젤 강성에 의해 결정되며, 이는 주요 구성 요소인 콜라겐과 히알루론산의 특성에 따라 달라집니다5. 유리체의 겔 강성은 인공 콜라겐 겔의 강성이 밀도, 정렬 및섬유 폭과 같은 네트워크 특성에 의해 결정되기 때문에 콜라겐 섬유 네트워크의 특징에 의해 영향을 받을 가능성이 높습니다6.

유리체 콜라겐 섬유 네트워크는 수분 함량이 높고 콜라겐 농도가 낮기 때문에 이미지화가 어렵습니다.7, 현미경 또는 투과 전자 현미경을 위해 처리하는 동안 인공적 왜곡이 발생합니다. 전통적인 조직학 및 투과 전자 현미경은 얇은 절편을 위해 유리체를 경화시키는 처리가 필요합니다. 조직학적 포매에 필요한 탈수는 유리체 섬유가 벌집 모양으로 응집하게 하고8, 동결 중 얼음 결정 형성은 세포외 기질9의 기공 크기를 증가시킵니다. 플라스틱 포매(8 )와 급속 냉동(10 )은 인공물을 최소화하기 위해 유리체에 적용되었지만, 일부 잔류 인공물이 남아 있을 가능성이 높다. 위상차 현미경은 절편이 필요하지 않고 유리체에 적용된 방법이지만 눈에서 유리체의 작은 조각을 제거해야 하므로 네트워크(11)의 원래 위치와 방향을 잃습니다. 보다 최근에는 정량적 편광 현미경을 사용하여 육안적으로 절편된 돼지 눈을 가로질러 섬유의 평균 방향을 매핑했지만 개별 섬유는 해결할 수 없었습니다12. 또한 염료 기반 표지 접근법(예: 트리판 블루, 피크로시리우스 레드, 5-(4,6-디클로로트리아지닐) 아미노플루오레세인)은 아티팩트 또는 비특이적 표지를 도입할 수 있으므로 천연 콜라겐 네트워크를 보존하기 위해 피했습니다.

우리는 Filas et al. 편광 현미경 연구, 즉 아가로스 블록12의 육안적 해부를 위해 사용한 샘플 준비 방법을 채택하고 이전에 유리체에 적용되지 않은 공초점 반사 현미경을 사용하여 표본을 이미지화했습니다. 이 방법을 사용하여 수화되고 생리학에 가까운 상태의 유리체 콜라겐 섬유 네트워크의 이미지를 획득했습니다. 이는 동결 파괴 또는 탈수 기반 접근법에 비해 인공물 감소를 포함하여 이전 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다10,13. 이 프로토콜에는 최소 30배 배율의 침지 대물렌즈, 0.9보다 큰 개구수 및 200μm보다 큰 작동 거리를 가진 도립 공초점 현미경이 필요합니다. 섬유의 명확한 해상도를 용이하게 하기 위해 샘플 준비 및 이미지 획득에 대한 주요 지침을 포함합니다. 유리체 콜라겐 기질의 거의 천연 상태를 유지함으로써 이 접근 방식을 통해 연구자들은 유리체 경직과 병리학적 변화를 이해하는 데 중요할 수 있는 섬유 방향, 밀도 및 공간 분포 매개변수를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 이 기술은 유리체 콜라겐 네트워크, 그 구조 및 유리체 망막 질환의 병인에 관심이 있는 연구자에게 특히 적합합니다.

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프로토콜

1. 조직 준비 및 해부

참고: 이 연구는 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 우리 기관에서는 생체 외 돼지 눈에 대한 실험을 수행하기 위해 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인이 필요하지 않았습니다.

  1. 육류 가공 공장에서 생체 외 돼지 눈을 얻으십시오. 사망 후 48시간 이내에 눈을 사용하십시오.
    참고: 유리체 모양은 사후 시간이 길어져도 변하지 않지만 망막과 맥락막은 분해되어 해부 중에 세포 및 색소 파편이 분산됩니다. 이 파편은 섬유 이미징 및 분석을 방해할 수 있습니다.
  2. 지구에서 과도한 근육과 결합 조직을 제거합니다.
  3. 초대형 실리콘 얼음 조각 몰드와 같은 큐브 몰드 바닥에 3구 받침대를 놓습니다(그림 1A 및 그림 2).
  4. 지구본을 세 갈래 받침대에 놓고 윤부가 갈래에 놓이도록 배치합니다.
  5. 증류수 100mL에 범용 아가로스 3g을 첨가한 다음 용액이 녹을 때까지 가열하여 3% 아가로스 겔을 만듭니다. 용액이 약 37°C로 식으면 눈이 아가로스에 잠길 때까지 틀에 붓습니다.
    참고: 이렇게 하면 해부를 위해 눈을 안정화하기 위해 아가로스 젤에 눈을 삽입합니다.
  6. 아가로스 큐브를 최소 4시간 동안 식힙니다.
    참고: 이렇게 하면 젤이 눈에 접착력이 증가하고 해부 중에 눈이 움직이지 않도록 합니다
  7. 식힌 후 틀에서 아가로스 큐브를 꺼냅니다. 그런 다음 큐브에서 받침대를 제거합니다(그림 1B).
  8. 1 x 8 레고 브릭, 플레이트 및 타일의 조합을 사용하여 아가로스 큐브와 동일한 치수의 3면 프레임을 만듭니다(그림 3).
    알림: 이렇게 하면 큐브가 제자리에 고정되고 해부 중에 블레이드에 대한 가이드가 제공됩니다. 레고 프레임의 높이에 따라 눈이 잘릴 위치가 결정됩니다. 이것은 반투명 아가로스 겔을 통해 시각화할 수 있습니다.
  9. 식힌 아가로스 큐브를 레고 프레임에 넣습니다. 하이 프로파일 마이크로톰 블레이드의 뭉툭한 가장자리를 잡고 블레이드를 레고 프레임 상단에 맞춥니다. 큐브 상단에 부드럽게 아래쪽 압력을 가하고 미크로톰 블레이드를 전체 큐브와 내장된 눈을 통해 앞뒤로 부드럽게 드래그합니다(그림 1C).
    참고: 이렇게 하면 아가로스에 내장된 안구 조직 섹션이 생성되며, 이를 "안구"라고 합니다.

2. 이미징용 샘플 장착

  1. 마이크로톰 블레이드를 사용하여 큐브의 전체 절단면에서 약 1mm의 아가로스를 잘라냅니다(그림 4A).
    알림: 이렇게 하면 아가로스 큐브의 절단면 위로 확장되는 아이 캡의 작은 부분이 남습니다
  2. 티슈 물티슈 또는 작은 삼각형 셀룰로오스 스펀지를 사용하여 아가로스 큐브의 절단면, 특히 아이 캡의 경계 근처를 건조시킵니다.
  3. 작은 플라스틱 샌드위치 백에 다용도 실리콘 코크를 약 1티스푼 넣고 가방의 하단 모서리 중 하나에 3mm 구멍을 뚫어 코크용 짤주머니를 만듭니다.
  4. 짤주머니를 사용하여 아이 캡의 가장자리를 따라 아가로스 큐브의 절단면에 얇은 코크 구슬을 도포하여 샘플 주위에 방수 테두리를 만듭니다(그림 4B). 이렇게 하면 유리체 젤이 안대에서 누출되는 것을 방지할 수 있습니다.
  5. 아이 캡 위에 큰 커버슬립 유리를 놓고 아이 캡의 절단면이 갇힌 공기나 유체 없이 커버슬립과 접촉하도록 아래로 누릅니다(그림 4C). 실리콘 비드가 커버슬립과 연속적으로 밀봉되는지 확인합니다.
    알림: 실리콘 코크가 연속적인 밀봉을 형성하지 않으면 유리체액이 누출되어 공기가 유입될 수 있습니다.amp르. 공기에 노출되면 유리체가 수축하여 섬유가 더 밝고 밀도가 높아지고 섬유가 없는 액체 영역이 생성됩니다. 유리체가 커버슬립과 접촉하지 않으면 이미지화가 어렵습니다.
  6. 아가로스 큐브를 잡고 샘플을 뒤집어 도립 현미경에서 이미징하기 위해 대형 커버슬립 어댑터에 놓습니다(그림 4D 및 그림 5).

3. 이미지 획득

  1. 회전 디스크 유형이 아닌 도립 공초점 현미경을 사용하십시오. 물 대물렌즈(물 또는 안구 윤활제 젤를 커플러로 사용) 또는 최소 0.90 개구개, 배율 30x-60x 및 작동 거리가 최소 200μm인 오일 대물렌즈를 사용하십시오.
  2. 반사율 이미지를 얻기 위해 공초점 현미경의 광경로 설정을 조정합니다. 여기광의 방향을 바꾸고 형광 이미징을 위해 방출된 빛을 투과시키는 데 사용되는 이색성 거울 대신 조명 레이저의 일정 비율을 방향을 바꾸고 반사된 빛의 일정 비율을 투과하는 빔 분할 거울이 있는지 확인하십시오.
    참고: 유리체 콜라겐 섬유의 반사율 신호는 다소 약하므로 배경 소음은 섬유를 이미지화하는 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 473nm의 파장에서 향상된 신호 대 잡음비가 관찰되었지만 405nm에서 635nm 범위의 파장으로 유리체 콜라겐 섬유를 이미지화할 수 있었습니다.
  3. 조명 레이저의 파장을 포함하도록 감지 파장을 설정합니다.
  4. 샘플 내에서 Z 위치의 방향을 지정하려면 레이저 출력을 가능한 가장 낮은 설정으로 낮추고 커버슬립에서 반사된 빛의 플래시를 식별합니다. 이것은 커버슬립의 하단과 상단에서 발생합니다(그림 6).
    참고: 커버슬립 근처에는 배경에 상당한 반사 신호가 있습니다. 커버슬립에서 멀어지면 콜라겐 섬유에서 반사된 빛의 신호가 감소합니다.
  5. z 위치가 커버슬립 상단 위와 샘플 내에 위치하도록 조정합니다.
  6. 레이저 출력을 형광 응용 분야에 일반적으로 사용되는 것보다 높은 수준으로 높입니다.
    참고: 이미징 필드의 중앙에 반사 링 아티팩트가 있습니다. 이미징 필드를 확대하고 중심을 낮추는 조합은 이 아티팩트를 배제하는 데 도움이 될 수 있습니다(그림 7).
  7. 공초점 현미경에서 신호 대 잡음비를 높이는 표준 방법인 이미지 획득 설정에서 라인 평균화를 사용하고 픽셀 체류 시간을 늘립니다.

4. CT-FIRE 14를 이용한 섬유폭의 이미지 분석

  1. 이 웹 사이트의 지침에 따라 CT Fire를 설치하십시오: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki/Downloads-and-Installation-(CTF).
    참고: 여기에 사용된 버전은 "CT-FIRE V3.0 BetaWindows64-2018b"와 MATLAB 런타임 "MCR-2018b-win64"입니다. 소프트웨어가 작동하려면 둘 다 다운로드해야 합니다.
  2. 이미지를 8비트 tif로 변환하고 CT-FIRE에서 8비트 tif 이미지를 엽니다.
  3. 소프트웨어가 오른쪽 상단 모서리에서 CT-Fire 로 설정되어 있는지 확인한 다음 실행을 선택합니다.
  4. CT-FIRE는 원본 이미지와 동일한 폴더에 있는 "ctfireout"이라는 폴더에 분석 결과를 자동으로 업로드합니다. "OL_ctFIRE"라는 이름으로 시작하는 파일을 원본 이미지와 비교하여 추출 품질을 검사합니다. 이 프로토콜을 따르려면 이미지 분할(즉, 광섬유 식별)에 대해 다음 기본 설정을 사용하십시오. thresh_im2: 5; s_xlinkbox: 8; thresh_ext: 70; thresh_dang_L: 15; thresh_short_L: 15; s_fiberdir: 4; thresh_linkd: 15; thresh_linka: -150; thresh_flen: 15
    1. 광섬유가 정확하게 식별되지 않으면 오른쪽 상단 모서리에 있는 매개변수 섹션 아래에 있는 업데이트 버튼을 클릭하여 매개변수를 조정합니다.
      알림: 매개변수 조정 방법에 대한 지침은 CTFIRE 응용 프로그램 폴더에 있는 CT-FIRE 설명서의 "20 참고 사항" 섹션의 3페이지에서 찾을 수 있습니다. 추가 팁은 Liu et al. 섹션 3.5.215.
  5. 원하는 경우 출력 설정을 조정하여 출력 이미지에 나타나는 광섬유를 제한합니다. 이 프로토콜을 따르려면 다음 기본 설정을 사용하십시오. 최소 광섬유 길이[픽셀]: 30; 이미지 해상도 [dpi]: 300; 섬유 선폭 [0-2]: 0.5; 최대 섬유 너비[픽셀]: 15
  6. 너비 단위를 픽셀에서 μm로 변환하려면 피지에서 원본 이미지를 엽니다. 디스플레이 창의 왼쪽 상단 모서리에 픽셀과 μm 모두로 표시되는 이미지의 크기를 사용하여 비율을 계산합니다.

5. TWOMBLI16을 이용한 섬유 밀도, 곡률, 정렬, 공백, 균사 성장 단위 및 프랙탈 차원의 이미지 분석

  1. https://github.com/wershofe/TWOMBLI 에서 TWOMBLI를 다운로드하세요.
  2. "설치 및 종속성" 아래의 TwombliDocumentation 파일의 지침을 따릅니다.
  3. TWOMBLI_v1/programs 폴더를 열고 AnamorfProperties.xml 파일을 AnamorfPropertiesEH.xml 파일(보충 파일 1)으로 바꿉니다.
  4. TWOMBLI_v1/programs 폴더에서 Twombli_v1.ijm 파일을 Twombli_v2.ijm 파일(보충 파일 2)으로 바꿉니다.
  5. 그 안에 "test HDM", "test masks", "HDM" 및 "masks"라는 빈 폴더가 있는 폴더를 만듭니다.
  6. 이미지를 8비트 tif로 변환합니다.
  7. "테스트 세트 입력" 폴더에 3-5개의 이미지를 넣습니다.
  8. 분석할 모든 이미지를 "적격"이라는 하위 폴더 없이 단일 폴더에 넣습니다.
  9. 피지에서 플러그인 | 매크로 | 실행 | twombli/Programs에서 Twombli_v2.ijm을 선택합니다.
  10. 프롬프트에 따라 TWOMBLI를 실행합니다. 이 프로토콜을 따르려면 다음 매개변수를 사용하십시오. 대비 채도, 0.35; 최소 선 너비, 3; 최대 선 너비, 3; 최소 곡률 창, 40; 최대 곡률 창, 40; 최소 가지 길이, 10; 최대 디스플레이 HDM, 100; 최소 간격 지름, 0
    알림: 이미지의 매개변수를 조정해야 할 수 있습니다. 소프트웨어는 사용자에게 매개변수 선택을 안내하며 추가 지침은 프로그램과 함께 제공된 파일 TwombliDocumentation.docx에서 찾을 수 있습니다.

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결과

세 마리의 젊은 성인 돼지(생후 4개월 암컷, 5개월 생후 수컷, 6개월 생후 암컷)의 한쪽 눈은 하윤부를 통해 축면으로 눈을 절편한 후 영상화되었습니다. 6개의 이미징 위치를 X-Y 절편 평면에서 4mm 간격으로 획득했습니다. 각 이미징 위치에서 70μm x 70μm 이미지의 인접한 4 x 4 그리드를 얻었습니다(그림 8). 각 돼지에 대해 각 이미지를 여러 매개변수에 대해 개별적으로 분석했습니다(표 1).

섬유의 밀도는 두 가지 방법으로 측정되었습니다: 1) 선형 구조의 분할 후 섬유의 총 길이; 2) 임계값 후 신호가 차지하는 픽셀의 비율. 섬유의 총 길이는 세 마리의 돼지 모두에 대해 유사했지만(일원 분산 분석에 의해 p = 0.19)(그림 9A), 신호가 차지하는 픽셀의 비율은 세 마리의 돼지 간에 달랐습니다(p < 0.0001)...

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토론

이전의 유리체 이미징 방법은 인공적인 섬유 응집13, 섬유 조직, 방향 및 위치의 손실(17)을 보여주거나 더 작은 시야로 훨씬 더 높은 해상도에 의존하여 섬유 분포에 대한 통찰력을 제한했습니다10. 생체 외, 육안적으로 절편된 신선한 조직의 공초점 반사 현미경은 자연 섬유 조직, 방향 및 위치를 보존하면서 유리체 콜라겐 섬유의 미크론 규모 이미지를 제공합니다. 우리 손에서는 염료 기반 염색 접근법(예: 트리판 블루, 피크로시리우스 레드, 5-(4,6-디클로로트리아지닐) 아미노플루오레세인)은 아티팩트 또는 비특이적 표지를 도입했기 때문에 천연 콜라겐 네트워크를 보존하기 위해 사용되지 않았습니다.

이 프로토콜의 성공적인 구현을 보장하기 위한 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 샘플을 준비하는 동안 ...

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공개 사항

모든 저자는 관련 이해 상충이 없다고 보고합니다.

감사의 글

국립보건원 핵심 보조금 EY014800; 실명 예방을 위한 연구, 뉴욕, 유타 대학교 안과 및 시각 과학과에 대한 무제한 보조금; NIH NEI K08 EY034549; 초등 어린이 병원 재단; E. 마틸다 지글러 재단; 돼지 눈을 주신 Guillaume L. Hoareau 박사와 M. Austin Johnson 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가로즈 1세VWR0710-500G
다목적 실리콘 1 코킹, 투명GE2795576
셀룰로오스 스펀지 (Weck-Cel Eye Spear)비버 - 비지텍000865
커스텀 3프롱 받침대  NANA
대형 커버슬립 유리 장착용 맞춤 어댑터NANA
대형 커버슬립 글라스, 1.42" x  2.36" 1위테드 펠라260460-100
레고 (클래식 베이스플레이트, 1 x 8 타일, 1 x 8 브릭, 1 x 6 플레이트)레고11023, 3008, 3666, 4162
미세토임 블레이드(고프로파일) 리에카 바이오시스템즈14035838926
올림푸스 UPlanSApo 30x 실리콘 대물렌즈올림푸스UPLSAPO30XS
실리콘 대형 얼음 트레이 (Samuelworld)아마존713243280060
티슈 (Kimwipes)와 nbsp;킴벌리 클라크34120

참고문헌

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