방법 논문

폐암에서 시스플라틴 내성을 억제하기 위한 β-엘레멘 매개 LINC00511 조절 메커니즘 조사

DOI:

10.3791/68825

⸱

2025년 8월 19일

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1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시스플라틴(DDP) 내성은 폐암에서 화학 요법 효능을 제한합니다. 본 연구는 β-엘레메(β-Ele)이 LINC00511를 하향 조절하여 A549/DDP 세포의 내성을 어떻게 역전시키는지 밝히는 것을 목표로 했습니다. 시험관 내 및 RNA-seq 분석은 이 조절이 호기성 해당작용 및 Wnt/β-카테닌 신호 전달을 억제하여 화학 저항성을 극복할 수 있는 잠재적인 전략을 제공하는 것으로 나타났습니다.

초록

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시스플라틴 내성은 비소세포폐암에서 화학요법의 효능을 크게 제한하므로 이러한 장벽을 극복하기 위한 새로운 전략의 개발이 필요합니다. 이 시험관 내 연구는 β-Ele이 LINC00511 매개 해당작용 및 Wnt/β-카테닌 신호 전달 경로를 통해 폐 선암종 세포에서 시스플라틴 내성을 역전시키는 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 했습니다. LINC00511 과발현 또는 녹다운을 갖는 시스플라틴 내성 인간 폐 선암종 세포주(A549/DDP)는 플라스미드 형질감염을 통해 확립되었습니다. 형질감염 효율은 LINC00511 발현 수준을 검출하기 위해 qRT-PCR(Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)을 사용하여 평가되었습니다. 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU) 분석을 통한 평가는 A549/DDP 세포 증식에 대한 상당한 β-Ele 매개 억제를 나타냈습니다. 추가 RNA-seq 분석에서 시스플라틴 내성에 대한 β-Elemene의 억제 효과는 세포 해당작용의 간섭 및 Wnt/β-카테닌 신호 전달 경로 활성화의 억제와 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 포도당 수송체 1(GLUT1), 피루베이트 키나아제 M2(PKM2), 젖산 탈수소효소 A(LDHA), β-카테닌 및 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK-3β)를 포함한 주요 단백질의 웨스턴 블롯 분석은 β-엘레멘이 호기성 해당작용을 억제하고 LINC00511의 하향 조절을 통해 Wnt/β-카테닌 신호 전달 경로의 활성화를 차단함으로써 시스플라틴 내성을 역전시켰습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 β-Elemene이 LINC00511 및 관련 호기성 해당작용/Wnt/β-카테닌 경로를 표적으로 삼아 폐암에서 시스플라틴 내성을 극복한다는 것을 보여줍니다. 이는 잠재적인 치료 표적을 밝히는 동시에 향후 전임상 및 임상 조사를 위한 이론적 틀을 확립합니다.

서론

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전 세계 악성 종양 중에서 폐암은 기관지 상피 세포의 악성 변형 및 침습적 성장을 특징으로 하는 매우 높은 발병률과 치사율을 나타냅니다 1,2. 조직병리학적 특징에 따라 폐암은 비소세포암종(NSCLC) 또는 소세포암종(SCLC)으로 분류됩니다3. NSCLC가 전체 폐암 사례의 약 85%를 차지한다는 점은 언급할 가치가 있습니다 4,5. NSCLC의 1차 화학요법 표준으로서 시스플라틴(DDP)은 임상적으로 필수 불가결합니다6. 그러나 임상 관찰에 따르면 종양 세포는 주로 면역 탈출 경로의 활성화, 약물 표적 유전자의 돌연변이 및 약물 대사 경로의 조절 장애를 포함하는 여러 메커니즘을 통해 약물 내성을 발생할 수 있습니다 7,8,9.

긴 비암호화 RNA(lncRNA)는 단백질 코딩 능력이 부족한 200개의 뉴클레오티드(nt)> 전사체를 나타냅니다10. 축적된 증거는 lncRNA가 miRNA를 스폰지하고 표적 유전자를 방출하는 경쟁 내인성 RNA(ceRNA)로 기능하는 것과 같은 여러 메커니즘을 통해 종양 세포의 시스플라틴 저항성을 역전시킬 수 있음을 나타냅니다11, 세포사멸 신호 전달 경로조절 12, DNA 손상 복구참여 13 및 세포 자가포식조절 14. 또한, 종양 대사 재프로그래밍에 대한 연구가 발전함에 따라 lncRNA가 이 과정에서 중요한 조절 역할을 한다는 실질적인 증거가 나타났습니다. 호기성 해당작용을 나타내는 Warburg 효과는 악성 세포의 근본적인 대사 특성을 구성합니다15. 이는 빠른 세포 증식을 위한 에너지를 공급할 뿐만 아니라 생합성의 전구체 역할을 하는 중간 대사산물을 생성하여 악성 종양 성장의 요구를 충족시키기 위해 단백질 및 지질 합성을 지원합니다16. 폐암에서 lncRNA는 호기성 해당작용 경로를 조절하여 종양 진행 및 화학요법 내성에 유의한 영향을 미치는 것으로 확인되었습니다17,18.

이 중 최근 몇 년 동안 널리 연구된 lncRNA 분자인 LINC00511는 다양한 악성 종양의 시작 및 발달과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었습니다19. 이러한 발견은 종양 대사 재프로그래밍에 lncRNA 관여의 특정 메커니즘을 밝힐 뿐만 아니라 lncRNA 표적 종양 치료 전략에 대한 이론적 기초를 제공하여 잠재적인 치료 경로를 열어줍니다.

Curcuma zedoaria의 뿌리줄기에서 추출한 β-Ele은 항종양 효능이 확립된 생리 활성 세스퀴테르페노이드입니다. 우리의 이전 연구에서는 β-Ele이 PI3K/Akt/mTOR 신호 전달 경로의 선택적 억제제 역할을 하고 종양 대사를 표적으로 삼아 시스플라틴과 시너지 효과를 생성한다는 것을 입증했습니다. NSCLC 마우스 이종이식 모델20에서 종양 성장을 유의하게 억제했습니다. 후속 조사는 miR-301a-3p/AMPKα 신호 전달 축의 조절 을 통해 NSCLC 세포에서 호기성 해당작용을 약화시켜 종양 정지 결과를 초래하는 β-Ele의 능력을 입증합니다21. 이전 연구 결과를 바탕으로 우리는 LINC00511가 폐암에서 시스플라틴 내성을 약화시킨다는 것을 확인했습니다. 그럼에도 불구하고 정확한 분자 작용 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다.

종양 대사 재프로그래밍에서 호기성 해당작용의 중추적인 역할과 종양 발달 및 진행에서 LINC00511의 중요한 역할을 고려하여 본 연구는 β-Ele이 LINC00511 매개 호기성 해당작용 경로를 조절하여 폐암에서 시스플라틴 저항성을 역전시킬 수 있는지 여부를 조사하는 것을 목표로 합니다.

이전 증거에 따르면 β-Ele은 세포사멸 경로22를 활성화하고, 엑소좀 분비를 조절하고, 세포 주기를 정지시킴으로써 시스플라틴 내성을 역전시키고 항종양 효과를 향상시킬 수 있습니다24. 그러나 이러한 알려진 메커니즘은 일반적으로 광범위한 효과를 나타내고 특정 분자 표적에 대한 정확한 조절이 부족하여 임상적 번역 가능성을 제한합니다. 따라서 보다 표적화되고 메커니즘이 잘 정의되어 있으며 시스플라틴 내성을 극복하기 위한 임상 번역의 강력한 잠재력을 입증하는 새로운 전략을 탐색하는 것이 시급합니다. β-Ele의 즉각적인 생물학적 작용을 강조하는 이전 연구와는 달리, 이 연구는 lncRNA 매개 분자 경로의 조절을 통해 A549/DDP 세포의 Warburg 대사 및 Wnt/β-catenin 신호 전달 경로에 대한 β-Ele의 영향을 특성화하여 폐암에서 화학감작의 역전의 기본 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 합니다. 이 기사는 β-Ele이 lncRNA를 표적으로 삼아 화학 저항성을 역전시키는 새로운 접근 방식을 밝힐 뿐만 아니라 폐암의 임상 관리를 위한 새로운 이론적 기초와 잠재적인 개입 표적을 제공합니다. 이러한 발견은 특정 분자 표적(LINC00511)과 주요 신호 전달 경로(Warburg 및 Wnt/β-catenin)에 대한 자세한 설명을 통해 크게 향상된 임상 번역 잠재력을 보여줍니다. 이는 폐암 환자의 화학요법 민감도를 개선하고 삶의 질을 향상시키며, 폐암에 대한 정밀 치료 전략 개발을 발전시키기 위한 견고한 과학적 근거를 제공할 것으로 기대됩니다.

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프로토콜

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1. 용매 준비

  1. A549/DDP 세포용 배지 용액의 제조: 10% 소 태아 혈청(FBS, 자세한 내용은 재료 표 참조), 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(P/S, 자세한 내용은 재료 표 참조) 및 2μg/mL 시스플라틴(DDP, 자세한 내용은 재료 표 참조)을 보충한 Ham의 F-12K 완전 배지(자세한 내용은 재료 표 참조)에서 A549/DDP 세포를 배양합니다.
    1. 완전 배지 용액 준비: Ham's F-12K 배지 500mL에 FBS 50mL와 P/s 5mL를 첨가한 후 완전히 혼합하여 완전 배지 용액을 준비합니다.
    2. 시스플라틴을 함유하는 완전 배지 용액의 제조: 시스플라틴 분말 1mg(DDP, 자세한 내용은 재료 표 참조)의 무게를 계량하고 이중 증류수 1mL(ddH2O)에 녹여 원액을 준비합니다. 200μL의 원액을 100mL의 완전 배지(1.1.1단계에 따라 준비)에 첨가하고 완전히 혼합하여 2μg/mL의 시스플라틴을 포함하는 완전 배지의 작업 용액을 준비합니다.
      알림: 시스플라틴은 세포독성 물질이므로 흄 후드 또는 생물 안전 캐비닛에서 모든 절차를 수행하고 장갑, 실험실 가운 및 고글과 같은 보호 장비를 착용하십시오.
  2. β-Ele 투여액: 본 연구에 사용된 약물 농도는 우리 연구팀이 수행한 이전 실험 결과를 기반으로 합니다20,21. 1mg의 β-Ele(자세한 내용은 재료 표 참조)을 20μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO, 자세한 내용은 재료 표 참조)에 용해시켜 원액을 준비합니다. 완전 배지를 사용하여 원액을 25mL로 희석하여 40μg/mL β-Ele 작동 용액을 얻습니다.
    알림: DMSO는 피부를 통한 다른 물질의 흡수를 향상시킬 수 있으므로 흄 후드 또는 생물 안전 캐비닛에서 모든 작업 단계를 수행하고 장갑, 실험실 의류 및 고글과 같은 보호 장비를 착용하십시오.

2. 세포 배양 

  1. 이 연구에서 인간 폐 선암종 시스플라틴 내성 세포주(A549/DDP, Procell, 자세한 내용은 재료 표 참조)를 사용합니다. 이 세포주가 짧은 탠덤 반복(STR) 분석으로 식별되었고 ATCC 및 기타 데이터베이스의 표준 계통과 성공적으로 일치하는지 확인합니다.
    1. STR 분석 방법의 경우 약 1 x 106 세포를 수집하고 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
    2. DNA 타이핑에 적합한 검증된 다중 STR 시스템을 사용하여 성별 결정 유전자좌와 함께 20개의 STR 유전자좌를 증폭합니다. 다음과 같은 열 순환 조건에서 PCR 증폭을 수행합니다: 95°C에서 2분 동안 초기 변성, 94°C에서 30초 동안 29회 변성, 59°C에서 45초 동안 어닐링, 72°C에서 45초 동안 확장, 72°C에서 10분 동안 최종 확장 단계.
    3. 제조업체 지침에 따라 자동 유전자 분석기를 사용하여 모세관 전기영동 을 통해 생성된 PCR 산물을 분석합니다. 여기서, 대립유전자 유형은 단편 분석 소프트웨어(자세한 내용은 재료 표 참조)를 사용하여 수행되었으며, 피크 검출 임계값은 150 상대 형광 단위(RFU)로 설정되었습니다.
      참고: 생성된 20-유전자좌 STR 프로파일은 공개 데이터베이스에서 사용할 수 있는 A549/DDP 세포주의 참조 프로파일과 비교되었습니다. 80%를 초과하는 일치율은 상동성을 나타내는 것으로 간주되었습니다. 외부 대립유전자 피크의 부재는 교차 오염이 없음을 더욱 확인했습니다.
  2. 액체 질소에서 세포를 회수하여 액체가 완전히 녹을 때까지 빠르게 해동하기 위해 37°C 수조에 넣습니다. 세포 현탁액을 5mL 원심분리기 튜브로 옮기고 두 부피의 완전 배지 용액을 추가한 다음 혼합물을 부드럽게 재현탁합니다. 원심분리(358× g, 5분, 실온) 후 상청액을 조심스럽게 버립니다.
    알림: 액체 질소로 만든 세포 동결 보존 튜브를 사용할 때는 동결 방지 장갑과 고글 또는 안면 마스크를 착용하고 튜브 입구를 향하지 마십시오.
  3. 부드러운 피펫팅으로 세포 펠릿을 1mL의 완전 배지에 재현탁한 다음 9mL의 완전 배지를 추가하여 현탁액을 10mL로 희석합니다. 세포를 100mm 세포 배양 접시에 시드하고 인큐베이터(자세한 내용은 재료 표 참조)에서 37°C 및 5% CO2에서 배양합니다. 세포 계대 비율은 1:2에서 1:3 사이로 유지되었습니다.
    참고: 시스플라틴은 세포독성이 있는 백금 화학요법 약물입니다. 이 방법에서는 A549/DDP 세포를 시스플라틴을 함유한 배지로 배양합니다. 따라서 시스플라틴이 함유된 폐배양배지를 특수 폐액통에 모아 정기적으로 유해폐기물 처리업체에 보내 전문적인 처리를 받으십시오.

3. 플라스미드 형질감염 

  1. LINC00511 과발현을 위한 플라스미드 구조물과 세포 형질감염을 위한 유전자 특이적 siRNA 표적 LINC00511(유전자 ID: 400619; 전사체 ID: NR_033876.1)를 사용합니다. 활용된 siRNA 서열은 표 1에 나와 있다.
siRNA 서열
이름센스 5'-3'안티센스 5'-3'
LINC00511호모-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUUATT 카그쿠가아쿠쿠우아트
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

표 1: siRNA 서열 목록

  1. 소생술 후 3세대로 계대된 A549/DDP 세포를 무작위로 선택하여 1 x 105 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 균일하게 접종합니다. 각 우물에는 무작위로 번호가 매겨졌고, 우물은 이러한 난수를 기반으로 실험 그룹에 할당되었습니다.
  2. 밀도가 약 70%에 도달하면 형질감염 시약(자세한 내용은 재료 표 참조)을 사용하여 세포를 형질감염시킵니다.
    1. siRNA 형질감염 용액을 준비합니다.
      1. 250 μL의 최적화된 최소 필수 배지(Opti-MEM, 자세한 내용은 재료 표 참조)를 5 μL의 형질감염 시약과 혼합하고 균질성을 보장하기 위해 부드럽게 3-5배 소용돌이치고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      2. 5 μL의 siRNA(50 nM)를 250 μL의 Opti-MEM에 희석하고 부드럽게 3-5배 소용돌이치면서 완전히 혼합합니다. 희석된 형질감염 시약을 siRNA 용액과 결합하고 실온에서 20분 동안 배양하여 siRNA 형질감염 복합체를 형성합니다.
    2. 플라스미드 형질감염 용액을 준비합니다.
      1. 250 μL의 Opti-MEM과 5 μL의 형질감염 시약을 혼합하고 균질성을 보장하기 위해 부드럽게 3-5배 소용돌이치고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      2. 250μL의 Opti-MEM에 2μg의 플라스미드를 희석하고 3-5배 부드럽게 소용돌이치게 하여 완전한 혼합을 보장합니다. 희석된 형질감염 시약을 플라스미드 용액과 결합하고 실온에서 20분 동안 배양하여 플라스미드 형질감염 용액을 준비합니다.
      3. siRNA 형질감염 용액과 플라스미드 형질감염 용액을 각각 6웰 플레이트에 추가합니다. 각 웰에 1,500 μL의 완전 배지를 추가합니다. 균일한 분포를 보장하기 위해 첨가 전후에 세포 플레이트를 부드럽게 혼합하십시오. 분석 전에 형질감염 후 24시간 동안 플레이트를 37°C, 5% CO2에서 배양합니다.

4. qRT-PCR(Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)에 의한 형질감염 효율 검출

참고: 다음 절차에 따라 qRT-PCR 검출을 위해 3.3단계에서 24시간 동안 형질감염 후 세포를 채취합니다. 모든 실험은 3개의 독립적인 생물학적 반복실험(n = 3)에서 수행되었습니다.

  1. RNA 추출
    1. 초순수 RNA 추출 키트를 사용하십시오(자세한 내용은 재료 표 참조). 키트 지침에 따라 6웰 플레이트의 배지를 버리고 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 500μL의 페놀-구아니딘 기반 용해 시약 용액을 첨가하고 건 끝으로 세포를 부드럽게 불어 완전히 현탁시킨 다음 혼합물을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 샘플의 완전한 용해를 보장하기 위해 5분 동안 그대로 둡니다.
    2. 페놀-구아니딘 이소티오시아네이트 용해 시약 100μL를 넣고 15초 동안 급하게 흔든 후 실온에서 2분 동안 그대로 둔다. 마지막으로, 상부 수성상을 조심스럽게 흡인하여 흡착 컬럼으로 옮기고 4°C에서 10분 동안 13,400 x g 으로 원심분리합니다.
    3. RNA를 실리카겔 멤브레인에 결합합니다. Buffer RW1 및 Buffer RW2로 세척하여 단백질을 제거합니다. 그런 다음 DNase I을 첨가하여 잔류 DNA를 분해하고 Buffer RW2로 2차 세척을 수행하여 불순물을 완전히 제거합니다. 마지막으로, RNA를 RNase가 없는 물로 용출하고 13,400 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 RNA 샘플을 수집합니다.
  2. RNA 농도를 측정합니다.
    1. 각 1.5μL의 샘플 RNA 용액을 마이크로 핵산 검출기에 넣고(자세한 내용은 재료 표 참조) A260/A280 값을 읽습니다.
      참고: 측정된 A260/A280 값이 1.8 내지 2.0 범위 내에 있고 RNA 농도가 20 ng/μL에서 200 ng/μL 사이인 경우 이는 RNA 품질이 허용 가능하고 후속 실험에 사용할 수 있음을 나타냅니다.
    2. 측정값을 기반으로 RNA 용액을 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 물로 희석하여 측정된 최소 RNA 농도를 벤치마크로 사용하여 모든 샘플에 대해 일관된 RNA 농도를 보장한 다음 PCR 실험을 수행합니다.
  3. RNA의 역전사
    1. 추출된 총 RNA를 주형으로 사용하고 역전사 키트 지침에 따라 cDNA를 합성합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 키트 요구 사항에 따라 반응 시스템을 준비합니다.
    2. 추출된 RNA 용액과 반응 시스템을 8열 튜브에 추가하고 각 그룹에 2개의 반복 웰을 설정합니다. 순차적 조건으로 반응을 시작합니다: 37°C에서 15분 배양, 85°C에서 5초 열 변성, 4°C에서 5분 냉각.
  4. PCR 반응
    1. SYBR Green 기반 사전 혼합 PCR 마스터 믹스(자세한 내용은 재료 표 참조)를 사용하여 실시간 형광 정량 PCR 시스템(자세한 내용은 재료 표 참조)에서 PCR 증폭을 수행합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 표 2 에 나열된 프라이머 서열과 함께 GADPH를 참조 유전자로 사용하고 다음과 같이 반응 혼합물을 준비합니다: 0.4μL의 해당 프라이머, 2μL의 cDNA 주형 및 반응 혼합물을 8웰 스트립 튜브에 순차적으로 첨가하여 최종 반응량을 얻습니다.
    2. PCR 증폭 실행: 95°C 30초(1사이클), 95°C 5초(40사이클), 60°C 20초(40사이클). 2-ΔΔCt 방법25를 사용하여 표적 유전자의 상대적 발현 수준을 계산합니다. 데이터의 신뢰성을 보장하기 위해 모든 실험을 독립적으로 세 번 반복합니다.
      알림: 실험 과정에서 발생하는 화학 폐기물은 지정된 유해 폐기물 용기에 수거하고 기관 정책에 따라 인증된 유해 폐기물 관리 서비스에서 폐기해야 합니다.
프라이머 서열
입문서시퀀스(5'-3')
인간-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
인간-LINC00511-RTCCCTTCTCCCTCGGTCA
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH-RAAATGAGCCCCAGCCTTCT

표 2: PCR 분석을 위한 프라이머 서열

5. EdU 감지

  1. EdU 분석 키트를 사용하여 A549/DDP 세포의 증식에 대한 변경된 LINC00511 발현의 효과를 평가합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
    1. 소생술 후 3세대로 계대된 A549/DDP 세포를 무작위로 선택하고 2 x 104 세포/웰의 밀도로 24웰 플레이트에 균일하게 접종합니다.
      참고: 여기에서 모든 실험은 3개의 독립적인 생물학적 반복(n = 3)에서 수행되었습니다.
    2. 각 웰에 무작위로 번호를 매기고 이러한 난수를 기반으로 4개의 실험 그룹 중 하나에 웰을 할당합니다: 대조군, β-Ele 그룹, β-Ele + LINC00511 과발현(β-Ele + OV-LINC00511) 그룹 및 β-Ele + LINC00511 녹다운(β-Ele + si-LINC00511) 그룹.
  2. 세포 밀도가 약 70%에 도달하면 3.3단계에 따라 플라스미드 형질감염 및 간섭 처리를 수행한다. 형질감염 24시간 후, 원래의 배지를 버리고 β-Ele(40μg/mL)을 함유한 배지 용액 1mL를 약물 처리군의 각 웰에 첨가한다.
  3. 40μg/mL의 β-Ele로 24시간 동안 처리한 후 라벨링을 위해 세포를 EdU와 함께 배양합니다. 그런 다음 세포를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하고 0.5% Triton X-100으로 투과화합니다.
  4. 클릭 반응 용액(키트에서 제공하는 클릭 첨가제 시약 1바이알을 1.3mL의 탈이온수에 완전히 혼합하여 준비)을 어둠 속에서 넣고 어두운 곳에서 30분 동안 반응을 유지합니다. 반응이 완료된 후 PBS로 세포를 세척한 후 5분 동안 Hoechst 염색을 합니다. 마지막으로 형광 현미경을 사용하여 결과를 관찰합니다(그림 1 및 그림 2).
    참고: DMSO는 투과성이 높고 가연성 액체입니다. 이 계획에서 β-Ele 투여 용액에는 DMSO가 포함되어 있습니다. 따라서 β-Ele 투여액은 사용 후 특수 폐액통에 모아 유해 폐기물 처리 회사에 전달하여 정기적으로 전문적인 폐기하십시오.

6. 포도당 함량 검출 

참고: 모든 실험은 3개의 독립적인 생물학적 반복(n = 3)에서 수행되었습니다.

  1. 소생술 후 3세대로 계대된 A549/DDP 세포를 무작위로 선택하여 1 x 105 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 균일하게 접종합니다. 각 웰에 무작위로 번호를 매기고 이러한 난수를 기반으로 웰을 실험 그룹에 할당합니다.
  2. 세포 밀도가 약 70%에 도달하면, 단계 3.3에 설명된 대로 플라스미드 형질감염 및 간섭을 진행한다. 형질감염 24시간 후, 처리군의 세포를 40μg/mL의 β-Ele로 처리합니다.
  3. 약물 처리 24시간 후, 세포에서 상부 배양 배지를 수집하고 1000 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 수집합니다. 포도당 테스트 키트의 지침(자세한 내용은 재료 표 참조)에 따라 반응 용액을 준비하고 상청액과 완전히 혼합합니다.
  4. 샘플을 그룹당 5개의 복제 웰이 있는 96웰 플레이트에 넣습니다. 플레이트를 부드럽게 흔들고 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 505nm 파장의 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 흡광도를 측정하고 테스트 키트에 제공된 공식을 사용하여 포도당 함량을 계산합니다.
    figure-protocol-1
    여기서 C표준 = 5.55mmol/L, N = 희석 계수입니다.
    알림: 실험 과정에서 발생하는 화학 폐기물은 지정된 유해 폐기물 용기에 수거하고 기관 정책에 따라 인증된 유해 폐기물 관리 서비스에서 폐기해야 합니다.

7. 젖산 함량 검출 

참고: 모든 실험은 3개의 독립적인 생물학적 반복(n = 3)에서 수행되었습니다.

  1. 소생술 후 3세대로 계대된 A549/DDP 세포를 무작위로 선택하여 6웰 플레이트(1 × 105 세포/웰)에 균일하게 접종합니다. 각 웰에 무작위로 번호를 매기고 이러한 난수를 기반으로 웰을 실험 그룹에 할당합니다. 세포 밀도가 약 70%에 도달하면, 단계 3.3에 설명된 대로 플라스미드 형질감염 및 간섭을 진행한다. 형질감염 24시간 후, 40μg/mL의 β-Ele로 처리된 그룹의 세포를 처리합니다.
  2. 약물 처리 24시간 후, 세포에서 상부 배양 배지를 수집하고 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 수집합니다. 젖산 테스트 키트의 지침(자세한 내용은 재료 표 참조)에 따라 반응 용액을 준비하고 상청액과 완전히 혼합합니다.
  3. 96웰 플레이트의 각 웰에 총 250μL의 샘플을 추가하고 각 그룹에 대해 5개의 반복 웰을 설정합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들고 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 530nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하고(자세한 내용은 재료 표 참조) 테스트 키트에 제공된 공식을 사용하여 젖산 함량을 계산합니다.
    figure-protocol-2
    여기서 C표준 = 3mmol/L, N = 희석 계수.
    알림: 실험 과정에서 발생하는 화학 폐기물은 지정된 유해 폐기물 용기에 수거하고 기관 정책에 따라 인증된 유해 폐기물 관리 서비스에서 폐기해야 합니다.

8. 벌크 RNA-seq

  1. 샘플 데이터베이스 설정
    1. 실험을 위해 A549/DDP 세포를 선택하고 대조군, DDP 그룹, β-Ele(40μg/mL) + DDP(48μM) 그룹, β-Ele+ DDP + OV-LINC00511 그룹 및 β-Ele + DDP +si-LINC00511 그룹. 각 그룹에 3개의 샘플을 포함합니다.
    2. 각 세포군에서 총 RNA를 추출합니다. 마그네틱 비드 기반 mRNA 분리 키트(자세한 내용은 재료 표 참조)를 사용하여 올리고(dT)로 코팅된 비드가 A-T 염기 쌍 을 통해 mRNA의 폴리(A) 꼬리에 선택적으로 결합하는 진핵 mRNA를 농축합니다. 단편화 완충액(1μL/μg의 RNA, 자세한 내용은 재료 표 참조)을 추가하고 94°C에서 7분 동안 배양하여 mRNA를 짧은 세그먼트로 단편화합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 무작위 육사질체 프라이머를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 진행합니다. 2가닥 cDNA 합성의 경우 적절한 양의 반응 완충액, RNase H 및 DNA 중합효소 I을 첨가하여 공정을 완료합니다.
    4. 이중 가닥 cDNA에서 25°C에서 30분 동안 배양하고(말단 복구), 직후 72°C에서 30분 동안 배양(A-테일링)하여 이중 가닥 cDNA에 대해 말단 복구 및 A-테일링을 수행합니다. 말단 복구된 단편에 대한 시퀀싱 어댑터를 연결합니다.
    5. 카르복실 변형 자성 실리카 비드를 사용하여 결찰된 생성물을 정제하고 크기를 선택합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 마지막으로 PCR 증폭에 의해 시퀀싱 라이브러리를 구성합니다.
    6. 샘플 준비 후 DNBSEQ-T7 플랫폼에서 시퀀싱 라이브러리를 분석합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 시퀀싱을 위해 샘플을 패턴화 된 어레이 마이크로어레이 칩에 로드합니다.
      참고: 기기는 개별 염기의 서열 정보를 결정하기 위해 고해상도 이미징 시스템을 사용하여 광 신호를 수집, 읽기 및 식별했습니다. 그 후, 추가 시퀀싱 주기를 수행하여 다음 염기의 서열을 얻습니다. 여러 주기 후에 원시 시퀀싱 데이터가 생성되었습니다.
  2. 생물정보학 분석
    1. 머신에서 샘플을 시퀀싱하여 오프 머신 데이터라고도 하는 원시 데이터를 얻습니다. 또한 fastp(v 0.21.0)를 사용하여 시퀀싱 데이터를 처리합니다. 3' 어댑터 시퀀스가 포함된 판독을 제거하고 기본 필터링 기준의 일부로 평균 품질 점수가 Q20 미만인 저품질 판독을 제거합니다. 정리된 고품질 데이터를 기반으로 모든 다운스트림 분석을 수행합니다.
      참고: fastp를 사용하여 시퀀싱 데이터의 초기 필터링을 수행합니다. 특정 명령줄 매개변수는 전사체 데이터 세트(https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing)에 대한 공식 문서를 참조하세요.
    2. FastQC(v 0.12.0)를 사용하여 세척된 시퀀싱 데이터의 품질을 평가합니다. 품질 요구 사항은 다음과 같습니다: 염기의 90% 이상은 Q20보다 높은 품질 점수를 가져야 하며 나머지 어댑터 서열의 비율은 1%를 초과해서는 안 됩니다. 이러한 기준을 충족하는 데이터는 적격한 것으로 간주되며 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.
      참고: 공식 지침(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)에 따라 FastQC를 사용하여 세척된 시퀀싱 데이터의 품질을 평가합니다.
  3. 유전자 발현 분석
    1. DESeq2 소프트웨어를 사용하여 두 비교 그룹 간의 차등 발현 분석을 수행합니다.
      1. 먼저 데이터를 소프트웨어에 입력하여 DESeq DataSet을 구성합니다. 그런 다음 모든 샘플에서 총 수가 10개 미만인 유전자를 걸러냅니다.
      2. 마지막으로 차등 유전자 분석을 수행하고 결과를 추출합니다. 차등적으로 발현된 유전자를 스크리닝하기 위한 조건은 다음과 같습니다: 발현의 배수 변화 |log2FoldChange| > 1이고 유의 PADJ≤ 0.05입니다.
        알림: DESeq2 소프트웨어의 자세한 작동 단계는 공식 웹 사이트의 자세한 단계를 참조하십시오: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. 웨스턴 블롯(WB)에 의한 단백질 발현 수준 변화 검출 

참고: 모든 실험은 3개의 독립적인 생물학적 반복(n = 3)에서 수행되었습니다.

  1. 웨스턴 블로팅을 수행하여 세포 단백질 발현 수준을 정량화합니다.
    1. 소생술 후 3세대로 계대된 A549/DDP 세포를 무작위로 선택하여 1 x 105 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 균일하게 접종합니다.
    2. 각 웰에 무작위로 번호를 매기고 이러한 난수(Control, β-Ele, OV-LINC00511, si-LINC00511, β-Ele + OV-LINC00511 및 β-Ele + si-LINC00511)를 기반으로 6개의 실험 그룹 중 하나에 웰을 할당합니다.
    3. 세포 밀도가 약 70%에 도달하면, 단계 3.3에 설명된 대로 플라스미드 형질감염 및 간섭을 수행한다. 형질감염 24시간 후, 대조군에 신선한 배지를 제공하면서 처리군을 β-Ele(40μg/mL)에 노출시킵니다. 추가 24시간 동안 두 그룹을 배양합니다.
    4. 그 후, 1675 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다. 각 세포 그룹을 얼음 위에 1mM PMSF를 함유하는 500μL의 RIPA 용해 완충액으로 30분 동안 용해합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
  2. 세포 용해물을 13,400 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 수집합니다. BCA 단백질 농도 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 동일한 양의 단백질 샘플을 10% SDS-PAGE로 분리하고 전기영동 을 통해 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮깁니다.
  3. 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 차단 용액(5% 탈지유/0.1% Tween-20(TBST)이 포함된 트리스 완충 식염수)에 담그고 GLUT1, PKM2, LDHA, β-카테닌, GSK-3β(1:1000) 및 β-액틴(1:2000, 자세한 내용은 재료 표 참조)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다.
    1. 다음날, 멤브레인을 TBST로 실온에서 부드럽게 흔들면서 각각 5분씩 세 번 세척합니다.
  4. 다음날, 멤브레인을 2차 항체 용액(HRP 표지 염소 항토끼 IgG, 1:2000)과 함께 배양하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔듭니다.
  5. 마지막으로, 0.1mL/cm2의 상업적으로 이용 가능한 ECL 발색 용액을 첨가하여 PVDF 멤브레인을 완전히 덮습니다. 노출되기 전에 실온에서 1분 동안 배양합니다. 향상된 화학발광 시스템을 사용하여 밴드를 시각화하고 분석합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 그림 4C 와 그림 5B를 참조하십시오.
    알림: 실험 과정에서 발생하는 화학 폐기물은 지정된 유해 폐기물 용기에 수거하고 기관 정책에 따라 인증된 유해 폐기물 관리 서비스에서 폐기해야 합니다.

10. 통계적 분석 

참고: 모든 실험은 3개의 독립적인 생물학적 반복(n = 3)에서 수행되었습니다.

  1. 실험 데이터를 그룹별로 정리하여 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 8.0.2, 자세한 내용은 재료 표 참조)에 입력합니다. 소프트웨어 지침에 따라 데이터 시각화 및 통계적 유의성 분석을 수행합니다. 측정 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현되었습니다. 그룹 간의 통계적 차이는 η²(eta-제곱) 효과 크기 계산을 통한 일원 분산 분석을 사용한 다음 Tukey의 다중 비교 검정26을 사용하여 평가되었습니다. **P < 0.01을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-Ele은 A549/DDP 세포의 증식을 유의하게 억제합니다.

본 실험에서는 β-Ele과 DDP의 투여 농도를 이전 연구 결과에 기초하여 결정하였다(20,21). A549/DDP 세포는 DDP 화학 저항성에 미치는 영향을 분석하기 위해 단독으로 또는 DDP와 병용하여 β-Ele로 처리되었습니다. EdU 분석(그림 1)은 24μM 및 48μM 농도의 DDP가 블랭크 그룹에 비해 A549/DDP 세포의 증식을 유의하게 억제하는 것으로 나타났습니다(P < 0.01, d = 23.52).

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토론

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이 연구는 폐암에서 시스플라틴 내성의 중요한 임상 문제에 초점을 맞췄습니다. 전 세계적으로 가장 많은 암 사망자를 차지하는 폐암은 계속해서 5년 생존율이 20% 미만입니다.29,30. 백금 기반 화학요법 약물의 초석인 시스플라틴은 DNA 복제를 억제하여 항암 효과를 발휘하는 효율적인 광범위한 항암제입니다31. 그러나 환자의 약 절반이 장기간 임상 사용 중에 후천성 약물 내성을 발생시켜 치료 실패 및 질병 진행을 초래하는 것으로 관찰되었습니다16. 따라서 시스플라틴에 대한 폐암의 민감성을 향상시키기 위한 효과적인 전략을 식별하는 것은 환자 생존율과 예후를 개선하는 데 매우 중요합니다. lncRNA는 종양 다제내성의 다기능 조절자로 기능하며, 최근 연구에서는 폐암 세포의 약물 내성 메...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구를 위한 자금은 지린성 자연과학재단(Jilin Provincial Natural Science Foundation)에서 수상 번호로 제공했습니다. YDZJ202401058ZYTS.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
A549/DDP 셀프로셀CL-0519URL:https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
매우 깨끗한 작업대쑤저우 안타이 에어텍SW-CJ-2FDURL:http://www.sz-antai.com
BCA 단백질 농도 분석 키트솔라바이오PC0020URL:https://www.solarbio.com
벤치탑 원심분리기열피코17URL:https://www.thermofisher.com
세포 배양 챔버열3111URL:https://www.thermofisher.com
세포 배양 접시바이오필TCD000100URL:http://www.biofil.com.cn
화학발광 분석기Qinxiang 악기 4300網址:https://www.clinx.cn/about_us
시스플라틴알라딘C295225-250mgURL:https://www.aladdin-e.com/
DNBSEQ-T7 유전자 염기서열 분석 기기(주)MGI TechT7網址:https://www.mgitech.cn/
이지퓨어  마이크로 게놈 DNA 키트트랜스젠 바이오텍EE181-01URL:https://www.transgen.com/
ECL 발색 용액솔라바이오PE0010URL:https://www.solarbio.com
EDU 검출 키트비요타임C0071SURL:https://www.beyotime.com
효소 표지 기기Detie 장비HBS-1096A홈페이지:https://www.detiebio.cn/
태아 소 혈청 FBS)클락FB15015URL:https://zn.clarkbio.com/
파편/프라임 버퍼 예센11277ES홈페이지:https://www.yeasen.com/products/detail/2151
유전자 매퍼  소프트웨어  6열버전 6조각 분석 소프트웨어. URL:https://www.thermofisher.cn/   
GenReader 플랫폼베이징 Yuewei 유전자 기술 Co., Ltd.https://yyigou.com/product/detail/0000037250.html모세관 전기영동에 사용되는 자동 유전자 분석기
혈당 테스트 키트젠청 바이오A154-1-1URL:http://www.njjcbio.com
GLUT1 다클론 항체프로틴테크 그룹21829-1-APURL:https://www.ptglab.com
그래프패드 프리즘GraphPad 소프트웨어버전 8.0.2URL:https://www.graphpad.com
GSK-3&베타; 항체선호도AF5016URL:https://www.affbiotech.com
햄의 F-12K프로셀PM150910URL:https://www.procell.com.cn/
Hieff NGS DNA 선택 비드예센12601ES網址:https://www.yeasen.com/products/detail/939
HieffNGS mRNA 분리 마스터 키트예센12603ZHURL:https://www.yeasen.com/products/detail/1119
HRP 표지 염소 항토끼 IgG서비스바이오GB23303網址:https://www.servicebio.cn
젖산 테스트 키트젠청 바이오A019-2-1URL:http://www.njjcbio.com
LDHA 특이적 다클론 항체프로틴테크 그룹19987-1-APURL:https://www.ptglab.com
라이트 사이클러 96로슈LC96URL:https://lifescience.roche.com
리포펙타민 2000인비트로젠11668-019URL:https://www.thermofisher.com/invitrogen
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페니실린-스트렙토마이신(P/S)바이오샤프BL505A網址:https://www.biosharp.cn/
PKM2 특이적 다클론 항체프로틴테크 그룹15822-1-APURL:https://www.ptglab.com
PMSF 비요타임ST506URL:https://www.beyotime.com
PrimeScript RT 시약 키트(Perfect Real Time)타카라RR037AURL:https://www.takarabio.com
RIPA 용해물비요타임P0013BURL:https://www.beyotime.com
시퀀싱 플랫폼BGIDNBSEQ-T7 시리즈URL:https://www.bgi.com/global
TB 그린 프리믹스 Ex Taq타카라RR420AURL:https://www.takarabio.com
미량 핵산 검사기Aosheng 악기나노-100URL:http://www.hzaosheng.com
트리존 파이캔백스 바이오텍CW0597SURL:https://www.canvaxbiotech.com
트립신바이오샤프BL501A網址:https://www.biosharp.cn/
초순수 RNA 키트(DNase I)캔백스 바이오텍CW0597SURL:https://www.canvaxbiotech.com
β-액틴 항체프로틴테크 그룹60008-1-IGURL:https://www.ptglab.com
&베타;-카테닌 항체 선호도DF6794URL:https://www.affbiotech.com
&베타;-엘레메네시그마63965-25MGURL:https://www.sigmaaldrich.com

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