이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

재현 가능한 무세포 단백질 합성을 위한 OnePot PURE 및 조류 리보솜 생산 개선

1.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68826

⸱

2025년 8월 22일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

이 논문에서

요약

우리는 배치 간 변동을 최소화하기 위해 세포 성장을 제어하는 데 중점을 두고 무세포 단백질 합성을 위한 OnePot '재조합 요소를 사용한 단백질 합성'(PURE) 시스템 및 조 리보솜의 생산을 위한 업데이트된 프로토콜을 제시합니다.

초록

최근의 발전으로 PURE(Protein Synthesis Using Recombinant Elements) 무세포 시스템을 개별 실험실에서 경제적으로 생산하고 노동 부담을 줄일 수 있게 되었습니다. 그러나 PURE를 구성하는 36가지 단백질 성분과 리보솜의 준비는 여전히 복잡한 작업이며 변동과 오류의 여지가 많습니다. 우리는 최근 발표된 OnePot 프로토콜을 기반으로 PURE를 제조하기 위한 상세하고 업데이트된 절차를 제시하며, 여기에는 여러 주요 단계, 특히 광학 밀도(OD) 정규화된 글리세롤 스톡을 사용한 배양 접종, 세포 성장의 주의 깊은 모니터링 및 최종 글리세롤 농도 제어가 포함됩니다. 이 접근 방식을 사용하여 여러 생물학적 복제 및 사용자로부터 PURE의 재현 가능한 준비를 보고합니다. 이 프로토콜은 다른 실험실이 자체 PURE 시스템을 제조하고 문제를 해결하기 위한 참조 및 출발점 역할을 하므로 생체 분자 시스템의 상향식 구축 및 합성 세포 개발과 같이 PURE가 가능하게 하는 많은 응용 분야의 민주화를 증가시킵니다.

서론

무세포 단백질 합성(CFPS)은 바이오 제조, 바이오센싱 및 진단, 유전 및 대사 부분 및 경로의 프로토타이핑, 신속한 단백질 공학 및 교육을 포함한 다양한 응용 분야를 위한 기술로 성숙해졌습니다 1,2. 원래 '재조합 요소를 사용한 단백질 합성'(PURE) 시스템3으로 개발된 정제된 성분을 사용하는 CFPS 시스템은 용해물 기반 대안에 비해 여러 가지 이점을 제공합니다. PURE 시스템은 36개의 단백질 인자, 70S 대장균 리보솜 및 뉴클레오시드 삼인산(NTP), 아미노산 및 tRNA를 포함한 정의된 화학 기질 혼합물로 구성된 정의된 구성을 가지고 있으며, 이는 필요한 응용 분야에 맞게 마음대로 조정할 수 있습니다. 따라서 비표준 아미노산 통합, 기계론적 모델링, 생체 분자 시스템 및 합성 세포의 상향식 구성과 같은 연구에 매우 적합합니다1. PURE는 상업용 공급업체로부터 구할 수 있지만 비용(1μL 반응당 $0.34-$1.63)은 대규모 실험에 비해 부담스럽습니다. 그리고 PURE를 사내에서 생산하는 대체 전략은 지금까지 36개의 단백질과 리보솜4의 병렬 정제를 포함하는 노동 집약적인 프로토콜로 인해 방해를 받아왔으며, 이는 특히 경험이 없는 사용자의 경우 강력하고 재현 가능하게 수행하기 어렵습니다.

최근의 발전은 PURE의 수제 생산에 도움이 되었습니다. 예를 들어, Wang et al. 번역 기계에 게놈적으로 통합된 헥사-히스티딘 태그를 포함하도록 대장균 균주를 조작하여 단일 단계 정제를 용이하게 했습니다5. 모든 PURE 단백질을 암호화하는 유전자는 소수의 플라스미드로 조립되었으며, 이는 정제 노동력을 줄이기 위해 유사하게 사용되었습니다6. Villareal et al. 정확한 비율로 단백질을 생산하기 위해 발현의 균형을 맞추는 동시에 단일 단계 정제를 허용하는 PURE 균주의 우아한 컨소시엄을 설계했습니다7.

Lavickova et al.이 개발한 혁신적인 OnePot PURE 시스템은 사용 편의성에 대한 큰 가능성을 가지고 있습니다 8,9. 이 시스템에서는 원래의 PURE 균주가 단일 크로마토그래피 단계를 통해 공동 배양 및 정제됩니다. 결과 PURE 시스템의 구성을 정확하게 정의하는 것은 불가능하지만, 저자는 시스템의 여러 배치가 대체로 재현 가능하며 각 균주의 접종량을 변경하여 대략적인 수준의 제어를 달성할 수 있음을 입증했습니다. 생산 용이성을 위한 정밀한 조성 제어의 절충안은 OnePot 시스템의 전체 단백질 합성 수율이 상업적으로 얻은 것과 유사하다는 점을 감안할 때 많은 사용자가 수용할 수 있는 것입니다. 그러나 OnePot 시스템에 대한 자세한 프로토콜이 존재하지만 Lavickova et al. 다른 실험실에서 결과를 완전히 재현하는 것은 어려웠습니다. 예를 들어, 발현 벡터 불안정성, 느리게 성장하는 균주 및 단백질 분해가 관찰되었습니다10.

이 작업에서 우리는 표준화된 글리세롤 스톡 및 배지 조정을 사용하여 세포 성장을 제어하고, 성장 모니터링 및 수확 OD에 대한 지침을 제공하며, 최종 정제에서 글리세롤의 양을 정상화하는 상세하고 정제된 OnePot PURE 프로토콜을 제시합니다. 둘째, 우리는 리보솜 활성과 보다 정교한 방법의 비용 및 복잡성 사이의 균형을 맞추는 차등 초원심분리만을 사용하는 최적화된 조리보솜 정제 절차를 제시합니다.

이렇게 하면 OnePot 프로토콜에 더 많은 단계가 도입되지만 필요한 경우 절차를 보다 철저하게 해결하고 필요에 맞게 수정할 수 있는 기회가 늘어납니다. 우리는 동일한 실험실에서 여러 사용자가 수행한 여러 생물학적 복제를 보여줌으로써 프로세스의 재현성을 입증합니다. 우리는 PURE 구성 요소와 리보솜 준비에 대한 제어가 시스템의 높은 CFPS 성능을 보장하는 데 중요하다는 것을 발견했습니다.

PURE 및 리보솜 준비는 각각 4일 또는 5일이 소요되며 한 명의 사용자가 순차적으로 수행하거나 두 명의 사용자가 동시에 수행할 수 있습니다. PURE 준비에는 4x500mL의 액체 배양이 포함되며, 각각 ~15mg/mL의 농도에서 ~2g의 세포 펠릿과 ~1mL의 PURE 단백질을 생성합니다. 리보솜 준비는 4 × 500mL = 2L의 액체 배양을 포함하며, 총 ~3g의 세포 펠릿을 생성하고 ~17μM의 농도에서 ~1mL의 조리보솜을 산출합니다. 현재 프로토콜은 배치 반응 2시간에 걸쳐 최대 ~100 μg/mL GFP 또는 ~130 μg/mL의 mCherry의 합성 수율을 가진 PURE 시스템을 생산합니다11, 이는 원래 OnePot 및 상용 시스템(~140-160 μg/mL)8,12과 유리하게 비교됩니다. 따라서 염분, 크라우딩 에이전트 및 개별 단백질 인자와 같은 민감한 구성 요소의 보충 또는 조절을 통한 추가 최적화를 위한 적절한 출발점입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다. 간결성과 명확성을 위해 우리는 이 작업과 관련된 중요한 변경 사항을 강조하므로 다른 출판물에 존재하는 것과 동일한 세부 사항을 참조합니다.

예비 작업은 한 번만 수행하면 됩니다. 4개의 섹션에는 PURE 단백질을 위한 글리세롤 스톡 및 스타터 플레이트를 준비하고 균주의 발현 시간을 검증 및 측정하는 작업이 포함됩니다. 스타터 플레이트를 사용하면 긁힌 글리세롤 스톡에서 직접 접종과 관련된 변동성이 제거됩니다. 제조 단계로 진행하기 전에 이 작업이 철저하게 완료되었는지 확인하는 것이 중요합니다. PURE의 제조에 관여하는 다양한 글리세롤 스톡이 많기 때문에 시스템 생산을 시도하기 전에 플라스미드 무결성과 모든 균주의 발현을 검증하는 것이 필수적입니다.

워크플로의 개략도는 그림 1에 나와 있으며 권장 시간표는 표 1에 나와 있습니다. 필요한 재료와 사용되는 단계는 재료표에 나와 있으며, 각 단계에서 필요한 완충액 및 배지의 개요는 보충 그림 S1에 요약되어 있습니다.

1. 예비 작업

  1. 글리세롤 스톡의 생성
    참고: 모든 플라스미드는 Addgene에서 구할 수 있습니다.
    1. 표준 절차9에 따라 표 2에 나열된 모든 균주의 25% w/v 글리세롤 스톡을 생성하고 -80°C에서 냉동 바이알에 보관합니다.
  2. PURE 스타터 플레이트 준비(하룻밤)
    1. 100 μg/mL 암피실린(LB+AMP)이 보충된 LB 배지 20 mL를 준비합니다.
    2. #1-#36에서 36x 멸균 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다.
    3. 각 튜브에 LB+AMP 500μL를 추가합니다. 피펫 팁을 사용하여 원래 글리세롤 스톡에서 소량을 긁어내어 각 튜브에 해당 균주를 접종합니다. 글리세롤 재고가 해동되지 않도록 하십시오. 소용돌이를 완전히 섞습니다.
    4. 그림 2에 표시된 레이아웃에 따라 접종된 각 튜브에서 멸균 1mL 96 딥웰 플레이트의 해당 웰에 300μL를 분취합니다.
      알림: 플레이트와 관련된 모든 후속 단계에서 전체적으로 동일한 플레이트 레이아웃을 유지하십시오.
    5. 플레이트를 37°C, 1,000RPM에서 15시간 동안 플레이트 셰이커에서 밤새 배양합니다.
    6. 다음날, 100μg/mL 암피실린(LB+AMP)과 멸균 50%(v/v) 글리세롤 15mL를 보충한 LB 배지 25mL를 준비합니다.
    7. 다중 채널 피펫을 사용하여 딥웰 플레이트에서 광학 96웰 플레이트의 바닥으로 각 배양액 30μL를 옮깁니다. 배양액이 포함된 각 웰에 270μL의 LB+AMP 배지를 첨가하여 각 배양액을 10배 희석합니다.
    8. 플레이트 리더를 사용하여 각 배양의 OD600 을 측정합니다. 650μL의 신선한 LB+AMP를 0.2의 시작 OD600 으로 접종하는 데 필요한 각 배양액의 부피를 계산합니다. 계산에 도움이 되는 스프레드시트는 보충 표 S1로 제공됩니다.
    9. 3개의 새로운 멸균 1mL 96 딥웰 플레이트를 준비합니다. 한 플레이트에 650μL의 LB+AMP를 36개의 웰에 첨가하고 계산된 하룻밤 배양의 부피를 각 웰에 접종하여 OD600 = 0.2를 얻습니다.
    10. 접종된 배양액 300μL를 다른 두 플레이트 각각에 옮깁니다. 한 플레이트는 배양이고 다른 플레이트는 OD를 모니터링하는 데 사용됩니다. 배양이 OD600 ~ 1(~1.5-2시간)에 도달할 때까지 플레이트 셰이커에서 37°C, 1000RPM에서 두 개의 플레이트를 배양합니다. OD를 1시간 동안 모니터링한 다음 필요에 따라 두 번째 플레이트에서 30μL 샘플을 제거하고 10배 희석을 위해 270μL의 LB+AMP에 첨가하여 다시 모니터링합니다.
    11. 개별 웰이 OD600 ~ 1에 도달하면 셰이커에서 제거합니다. 각 배양액에 동일한 부피의 멸균 50%(v/v) 글리세롤을 첨가하여 25% 글리세롤에서 OD600 = 0.5의 최종 농도를 달성합니다. 완전히 섞어서 이 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 이들은 마스터 작업 주식입니다.
    12. 각 마스터 스톡의 최대 40μL를 96웰 PCR 플레이트에 분취하여 원래의 웰 패턴을 유지합니다. 저장 용량에 따라 가능한 한 많은 접시에 분배하십시오. 호일 플레이트 씰로 밀봉하고 이 PURE 스타터 플레이트를 -80°C에서 보관하십시오.
      알림: 이 스타터 플레이트는 최대 3회 해동해야 합니다. 변형률 무결성과 재현성을 유지하기 위해 이 한계를 초과하는 경우 새 플레이트로 교체하십시오.
  3. 스타터 배양액의 성장 시간 결정(하룻밤)
    1. 얼음 위에서 PURE 스타터 플레이트를 해동합니다.
    2. 멸균 원추형 튜브(LB+AMP)에 멸균 LB 배지 50mL에 100mg/mL 암피실린 50μL를 첨가합니다.
    3. #1-#36에서 36 x 1.5 mL 멸균 미세 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 1 mL의 LB+AMP를 추가합니다.
    4. 각 글리세롤 스톡 10μL를 해당 표지된 튜브에 넣고 소용돌이를 통해 잘 혼합합니다.
    5. 각 튜브에서 접종된 배양물 300μL를 멸균 1mL 96 딥 웰 플레이트의 해당 웰에 추가합니다. 통기성 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 플레이트 셰이커에서 배양 플레이트를 1000RPM, 37°C에서 배양합니다. 배양액이 OD600 = 3을 초과하지 않고 OD600 ~2-3에 도달하는 데 걸리는 시간을 결정하고 기록합니다. 계속하기 전에 이 매개변수를 설정하십시오.
      참고: 우리 연구실에서는 15시간이 걸립니다.
  4. PURE 균주의 발현 시험
    1. 100 μg/mL 암피실린(LB+AMP), 10 mM IPTG 스톡 및 1x 단백질 추출 시약이 보충된 38 mL의 LB 배지를 준비합니다.
    2. 얼음 위에서 PURE 스타터 플레이트를 해동합니다.
    3. 멸균 2mL 96 딥웰 플레이트의 36웰 각각에 1mL의 LB+AMP를 추가합니다. 각 웰에 20μL의 해당 스타터 배양액을 접종합니다. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 1000RPM, 37°C에서 약 1시간 동안 또는 OD600 = 2에 도달할 때까지 배양합니다.
    4. 최종 IPTG 농도가 0.1mM인 각 웰에 10 μL의 10 mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 1000RPM, 37°C에서 3시간 동안 배양을 계속합니다.
    5. 3시간 발현 기간이 끝나면 각 배양액 700μL를 36 x 1.5mL 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 20,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
    6. 각 펠릿을 70μL의 1x 단백질 추출 시약에 재현탁합니다. 세포 용해를 허용하기 위해 부드럽게 교반하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    7. 원심분리기를 4°C에서 10분 동안 20,000× g 으로 용해시켜 불용성 분획을 펠릿화합니다.
    8. 제조업체의 지침에 따라 Ni-NTA 마그네틱 비드를 사용하여 각 단백질의 소규모 His-tag 정제를 수행합니다.
    9. SDS-PAGE를 사용하여 정제된 단백질을 분석하여 각 단백질의 발현 및/또는 균주 간 교차 오염을 확인합니다9.
      참고: 단백질을 발현하는 균주는 표적 단백질의 예상 분자량에 해당하는 SDS-PAGE에서 뚜렷한 밴드를 나타냅니다. 밴드가 검출되지 않으면 균주가 단백질을 발현하지 않을 수 있습니다. 이러한 경우 플라스미드를 분리 및 시퀀싱하여 서열 동일성과 무결성을 확인하고 필요한 경우 플라스미드를 교체합니다.

2. 원팟 퓨어 단백질 정제(4일)

참고: 단일 PURE 시스템 준비에는 500mL의 액체 배양액을 처리해야 합니다. 한 번의 실행으로 4개의 독립적인 PURE 배치를 생산하기 위해 4 x 500 mL 준비를 동시에 생산하는 것이 좋습니다. 그런 다음 이러한 배치를 독립적으로 정량화하거나 적절한 경우 결합할 수 있습니다. 4일 프로토콜은 밤새 수지 배양 단계를 수행하여 3일로 단축할 수 있지만 여기에는 긴 3일이 포함됩니다. 두 옵션 모두 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

  1. 1일차: 재료 준비 및 스타터 배양 성장
    1. 보충 표 S2 및 보충 그림 S1에 설명된 대로 PURE 준비를 위한 원액 및 완충액을 준비합니다.
      참고: 프로토콜의 각 부분을 실행하기 직전에 필요한 관련 배지 및 버퍼를 준비하고 표시된 대로 사용하기 전 최대 일수 동안만 보관하십시오.
    2. 얼음 위에서 PURE 스타터 플레이트를 해동합니다.
    3. 멸균 50mL 원뿔형 튜브(LB+AMP)에 50 mL의 멸균 LB 배지에 50 μL의 100 mg/mL 암피실린을 첨가합니다.
    4. #1-#36에서 36 x 1.5 mL 멸균 미세 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 1 mL LB+AMP를 추가합니다.
    5. 각 글리세롤 스톡 10μL를 해당 라벨 튜브에 넣고 와틀을 사용하여 잘 혼합합니다.
      알림: 각 균주의 접종을 쉽게 추적하려면 각 튜브에 균주를 추가한 후 피펫 팁을 PURE 스타터 플레이트의 해당 웰에 배출합니다. 모든 균주에 대해 이 과정을 반복합니다. 완료되면 호일과 오토클레이브 테이프로 다시 밀봉하고 -80°C에서 보관하기 전에 플레이트에서 피펫 팁을 조심스럽게 제거합니다.
    6. 균주 #25(EF-Tu)를 제외하고 각 튜브에서 접종된 배양물 300μL를 멸균 1mL 96 딥 웰 플레이트의 해당 웰에 추가합니다. 통기성 플레이트 씰이 있는 씰 플레이트. 배양 플레이트를 플레이트 셰이커에서 1,000RPM, 37°C, 14시간 동안 배양합니다.
    7. 튜브 #25에서 접종된 배양액 1mL를 50mL 원뿔형 튜브의 LB 10mL에 첨가하여 EF-Tu 스타터 배양액을 준비합니다. 튜브를 인큐베이터에서 260RPM, 37°C에서 14시간 동안 배양합니다.
      참고: 균주 #25, EF-Tu는 다른 성분보다 훨씬 더 높은 농도로 필요하므로 원래 프로토콜8에 설명된 대로 별도로 처리됩니다.
    8. 멸균 2x YTP 배지 2L를 2L 유리병에 넣고 37°C의 정적 인큐베이터에 넣어 밤새 예열합니다.
  2. 2일차: 성장 및 펠릿화
    1. 필요한 시약을 준비합니다.
      1. 멸균 예열 2x YTP 배지 2L(1일차부터)
      2. 100 mg/mL 암피실린 2 mL
      3. 100 mM IPTG, 멸균
      4. 100 mL PBS, 멸균, 얼음 차갑게
      5. 10mL LB 배지
    2. 다중 채널 피펫을 사용하여 스타터 딥 웰 플레이트와 EF-Tu 스타터 튜브에서 광학 96웰 플레이트의 바닥으로 각 스타터 배양물 30μL를 옮깁니다.
    3. 배양액이 포함된 각 웰에 270μL의 LB 배지를 첨가하여 각 배양액의 10배 희석을 달성합니다.
    4. 플레이트 리더를 사용하여 각 배양의 OD600 을 측정합니다. 모든 변형률은 OD600 = 2-3이어야 합니다.
      참고: 배양액이 OD600 = 3 이상으로 과도하게 자란 경우 2x YTP+AMP를 사용하여 OD600 = 3으로 희석합니다(보충 표 S1). 무성한 스타터를 희석하는 것은 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉽습니다. 따라서 예비 작업 섹션 1.3에 설명된 대로 OD600 2-3에 도달하는 데 필요한 정확한 배양 시간을 설정하는 것이 좋습니다.
    5. 예열된 2x YTP 배지 500mL와 100mg/mL 암피실린 500μL를 멸균 2.5L 배플 플라스크(2x YTP+AMP)에 옮깁니다.
    6. 단일 멸균 15mL 원뿔형 튜브에 스타터 배양 플레이트에서 각 배양액 55μL와 EF-Tu 배양액 1675μL를 첨가합니다. 소용돌이로 잘 섞는다.
      참고: 이것은 모든 PURE 균주를 함께 결합한 OnePot 문화입니다. 이 단계에서 일부 균주를 생략하여 녹아웃(ΔPURE) 시스템을 생성하거나 공동 정제가 필요한 다른 구성 요소를 추가할 수 있습니다.
    7. 이 튜브의 내용물을 500mL의 2x YTP+AMP가 들어 있는 2.5L 배플 플라스크에 추가합니다. 5-7단계를 반복하여 4x 독립 배양액을 얻습니다.
    8. OD600 = 0.2-0.3이 될 때까지 플라스크를 260RPM, 37°C에서 1.5-2시간 동안 배양합니다.
    9. OD600 = 0.2-0.3에 도달하면 각 플라스크에 500μL의 100mM IPTG를 접종하여 0.1mM IPTG의 최종 유도 농도를 얻습니다.
    10. 배양액을 260RPM, 37°C에서 3시간 더 배양합니다.
    11. 배양하는 동안 멸균 50mL 원뿔형 튜브 4개의 무게를 측정하고 라벨을 붙입니다.
    12. 필요에 따라 원심분리기를 4°C로 예냉하고 4개의 폴리프로필렌 공중합체 원심분리기 병에 라벨을 붙이고 예냉합니다.
    13. 라벨이 붙은 500mL 유리병 4개를 얼음물 수조에 넣습니다.
    14. 3시간 배양이 끝나면 각 배양액을 얼음 위의 유리병에 조심스럽게 디캔팅하여 성장을 종료합니다.
      참고: 식힌 병으로 배양물을 옮기는 것은 성장을 빠르게 멈추는 데 필수적입니다: 뜨거운 플라스크를 얼음 수조에 직접 넣어도 성장을 효율적으로 종료할 수 없습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 후속 단계는 얼음 위에서 수행됩니다.
    15. 각 배양액 250mL를 해당 원심분리기 병에 넣고 3,220× g, 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 나머지 250mL는 얼음수조에 보관합니다.
    16. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하고 종이 타월로 닦아냅니다.
    17. 각 배양액의 나머지 250mL를 해당 원심분리기 병에 넣고 3,220× g, 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다.
    18. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하고 종이 타월로 닦아냅니다.
    19. 멸균된 얼음처럼 차가운 PBS 20mL를 각 원심분리기 병에 넣고 세포 펠릿을 완전히 재현탁합니다.
    20. 각 재현탁액을 준비된 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
    21. 튜브를 2,000× g, 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다.
    22. 조심스럽게 디캔팅하여 상청액을 제거합니다.
    23. 튜브를 2,000× g, 4°C에서 2분 동안 다시 원심분리합니다.
    24. 피펫팅으로 잔류 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 얼음 위에 보관합니다.
    25. 이제 각 튜브에는 단일 500mL 배양의 세포 펠릿이 포함되어 있습니다. 각 튜브의 무게를 측정하고 각 튜브의 빈 무게를 빼서 세포 펠릿 질량(일반적으로 ~2g)을 계산하고 기록합니다.
    26. 세포 펠릿을 스냅 냉동하고 용해될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
      참고: 선택적으로, 프로토콜은 이 시점에서 용해 단계로 직접 진행함으로써 3일 안에 완료될 수 있습니다.
  3. 3일차: 용해, 정제 및 투석
    1. 필요한 시약을 준비합니다.
      1. 50mL의 재현탁 완충액을 준비합니다.
      2. 0.5M TCEP를 준비합니다.
    2. 얼음 위에서 세포 펠릿을 해동합니다.
    3. 50mL의 재현탁 완충액을 50mL 원뿔형 튜브에 분취하고 100μL의 0.5M TCEP를 첨가합니다. 소용돌이로 잘 섞는다.
    4. 세포 펠릿을 Resuspension Buffer + TCEP에 세포 펠릿 1g당 2mL의 비율로 재현탁합니다. 소용돌이를 완전히 재현탁합니다.
    5. 세포 재현탁액을 50mL 원추형 튜브에 분배하여 각 튜브에 5mL의 현탁액이 있도록 합니다. 4개의 독립적인 배양을 추적하기 위해 필요에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다. 얼음 위에 보관하십시오.
    6. 냉각된 초음파 처리 프로브를 사용하여 얼음 수조에서 10 사이클 동안 30 % 진폭, 20 초 켜기, 20 초 끄기에서 초음파 처리를 통해 세포를 용해합니다 (그림 3A, B).
      알림: 초음파 처리 중에 약 1000J의 에너지가 각 튜브로 전달되어야합니다. 에너지 전달의 일관성을 보장하기 위해 초음파 처리 중에 튜브를 제자리에 유지하기 위해 고정 된 스탠드를 사용하십시오.
    7. 용해물을 2mL 멸균 미세 원심분리기 튜브에 분배하여 각 튜브에 1mL의 용해물이 포함되도록 합니다. 2.3.6 및 2.3.7단계를 반복하여 네 가지 배양균을 모두 용해합니다. 다음 단계는 4개의 용해물에 대해 병렬로 수행됩니다.
    8. 15,923 × g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다.
    9. 원심분리하는 동안 단백질 정제 수지 5mL를 세척하고 평형화합니다(4개의 용해물에 대해 4개의 컬럼을 준비합니다).
      1. 신선한 단백질 정제 수지 2mL를 중력 흐름 크로마토그래피 컬럼에 추가합니다.
      2. 30mL의 멸균 증류수로 컬럼을 두 번 세척하여 저장 에탄올을 제거합니다.
      3. 30mL의 재현탁 완충액에 60μL의 0.5M TCEP를 최종 농도 1mM까지 보충합니다.
      4. 컬럼의 부피가 30mL이므로 버퍼를 컬럼에 직접 부어 채웁니다. 밸브가 닫혀 있는지 확인하고 30mL의 재현탁 완충액 + TCEP를 추가하여 컬럼을 평형화합니다.
      5. 밸브를 열어 ~25mL의 완충액이 흐르도록 한 후 컬럼 밸브를 닫고 건조를 방지하기 위해 수지 베드 위에 ~5mL의 완충액을 남겨 둡니다. 이제 컬럼을 사용할 준비가 되었습니다.
    10. 원심분리 후, 각 배양액에서 모든 정화된 펠릿 프리 상청액을 얼음 위에 4x 신선한 50mL 원뿔형 튜브로 결합합니다.
    11. 각 컬럼 내의 나머지 5mL의 재현탁 완충액 + TCEP에 수지를 재현탁하고 용해물 상청액이 포함된 각 원뿔형 튜브에 완충액과 수지를 첨가합니다.
    12. 뚜껑을 닫고 파라필름으로 밀봉한 다음 로티세리 셰이커에서 4°C에서 5시간 동안 배양합니다.
      참고: 성장 직후 용해를 수행한 경우, 이 용해물은 수지와 함께 밤새 배양할 수 있습니다.
    13. 필요한 시약을 준비합니다.
      1. 최종 농도 1mM의 TCEP를 세척 및 용출 완충액에 첨가하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
      2. 20%(v/v) 에탄올을 준비하십시오.
    14. 배양 후 원심분리기에서 튜브를 잠시 펄스하여 수지를 튜브 바닥으로 수집합니다.
    15. 피펫을 사용하여 레진을 재현탁하고 레진을 단백질 정제 컬럼에 다시 추가합니다.
    16. 수지가 컬럼 바닥의 베드에 가라앉으면 완충액이 통과하도록 합니다.
      참고: 선택적으로 SDS-PAGE를 통한 분석을 위해 단백질 정제 중 흐름 및 세척을 수집하여 정제 절차 문제를 해결합니다.
    17. Wash Buffer + TCEP의 1컬럼 부피로 컬럼을 세척합니다.
    18. 5mL 용출 완충액 + TCEP를 컬럼에 넣고 피펫으로 수지를 몇 번 재현탁한 다음 10분 동안 배양합니다.
    19. 배양 후, 용출액을 라벨이 붙은 5mL 비쥬 튜브에 모아 얼음 위에 보관합니다.
    20. 단백질 정제 수지를 세척하고 보관합니다.
      1. 용출이 완료된 후 30mL의 용출 완충액으로 컬럼을 세척하여 남아 있는 결합 단백질을 제거합니다.
      2. 멸균 증류수 30mL로 수지를 헹구고 3회 반복합니다.
      3. 30mL의 20%(v/v) 에탄올을 컬럼에 한 번 통과시킵니다.
      4. 컬럼에 20% 에탄올을 채우고 뚜껑이나 파라필름으로 밀봉합니다. 다음 사용까지 4°C에서 보관하십시오.
        알림: 청소만 필요합니다.-수지에서 니켈을 벗겨내려고 하지 마십시오. 세척된 수지는 표준 PURE 시스템 준비에 재사용하기에 적합합니다. 그러나 ΔPURE 시스템 변형의 경우 교차 오염을 방지하기 위해 항상 새 수지를 사용하십시오.
    21. 15mL 2kDa 투석 카세트를 Buffer HT(TCEP 없음)에 10분 동안 담그십시오.
    22. 용출된 단백질 용액 5mL를 투석 카세트에 추가합니다.
    23. 뚜껑을 다시 덮기 전에 카세트에서 가능한 한 많은 공기를 제거하십시오.
    24. 용출된 단백질 5mL를 1L의 Buffer HT(TCEP 없음)에 대해 2시간 동안 투석시킨 후 4°C에서 하룻밤 동안 1L의 신선한 Buffer HT를 부드럽게 교반합니다.
      참고: 여러 정제의 용출액을 결합하는 경우, 최대 10mL의 용출액을 2L의 완충액 HT에 대해 2시간 동안 투석한 후 4°C에서 밤새 2L의 완충액 HT를 추가로 투석할 수 있습니다. 수지 배양이 밤새 수행된 경우, 투석은 2시간 후 4시간의 프로토콜을 사용하여 낮 동안 수행될 수 있으며, 그 다음에는 즉시 아래의 단백질 농도 단계를 수행할 수 있습니다.
  4. 4일차: 집중 및 보관
    1. 필요한 시약 준비:
      1. 버퍼 HT 새로 고침 + TCEP를 준비합니다.
      2. Stock-60 + TCEP를 준비합니다.
    2. 투석이 완료된 후, 카세트에서 투석된 샘플 5mL를 제거하고 500μL 분취량을 5 x 2mL 멸균 미세 원심분리기 튜브에 분배합니다.
    3. 14,000 × g, 4°C에서 10분 동안 침전된 단백질을 펠릿화하도록 회전시킵니다.
    4. 펠릿이 없는 상청액을 재결합하고 3kDa MWCO 원심 필터 장치에 첨가하고 10mL의 Buffer HT Refresh + TCEP로 부피를 채웁니다.
    5. 3,220 × g, 4°C에서 30분 동안 또는 샘플 부피가 1.5mL로 감소할 때까지 원심분리합니다.
      참고: 농축 단계 중 단백질 침전은 전체 CFPS 성능을 크게 저하시킬 수 있습니다. 각 30분 원심분리 주기 후, 1mL 피펫을 사용하여 원심 필터 튜브에 샘플을 재현탁하여 필터 바닥에서 침전된 단백질을 제거합니다.
    6. 원심분리기에서 샘플을 제거하고 500μL 분취량을 3 x 2mL 멸균 미세 원심분리기 튜브에 분배합니다.
    7. 14,000 × g, 4°C에서 10분 동안 침전된 단백질을 펠릿화하기 위해 회전시킵니다.
    8. 펠릿이 없는 상청액을 얼음 위의 신선한 멸균 미세 원심분리기 튜브에 재결합합니다.
    9. 제조업체의 지침에 따라 Bradford Assay를 사용하여 용액 내 단백질의 농도를 결정합니다.
    10. 신선한 3kDa MWCO 필터에 첨가하고 14,862× g, 4°C에서 15분 동안 또는 25-30mg/mL의 최종 농도를 얻기 위해 샘플 부피에 도달할 때까지 원심분리하여 단백질 용액을 농축합니다.
    11. 원심분리기에서 샘플을 제거하고 500μL 분취량을 2mL 멸균 미세원심분리기 튜브에 분배합니다.
    12. 14,000 × g, 4°C에서 10분 동안 침전된 단백질을 펠릿화하기 위해 회전시킵니다.
    13. Bradford Assay를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 농도가 25에서 30 mg/mL 사이인 경우에만 다음 단계로 진행하십시오.
    14. 펠릿이 없는 상청액을 얼음 위의 신선한 미세 원심분리기 튜브에 재결합합니다.
    15. 농축된 단백질 용액에 같은 부피의 Stock-60 + TCEP를 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
    16. Bradford Assay를 사용하여 최종 단백질 농도를 결정합니다.
      참고: 단백질은 현재 완충액 HT + 30% 글리세롤에 있으며 Stock-30으로 추가 희석해도 글리세롤 농도는 변하지 않습니다.
    17. 필요한 경우 샘플을 Stock-30 + TCEP로 희석하여 약 12.5mg/mL의 최종 농도를 달성합니다.
    18. PURE 단백질 용액을 20 μL 분취량으로 PCR 튜브에 분취하고 액체 질소에서 급속 동결한 다음 -80°C에서 보관합니다.
      참고: 글리세롤을 함유한 단백질 용액을 농축하면 최종 CFPS 반응에서 다양한 양의 글리세롤로 인해 CFPS 성능이 일관되지 않을 수 있으므로 Stock-60을 첨가하기 전에 단백질 농도를 정확하게 결정하는 것이 중요합니다. 따라서 Stock-60은 단백질 농도가 25-30mg/mL의 최적 범위 내에 있음을 확인한 후에만 첨가해야 합니다.

3. 조리보솜 제제(5일)

참고: 리보솜 정제 프로토콜은 2L(4 x 500mL 플라스크)의 액체 배양 처리에 최적화되어 총 ~3g의 세포 펠릿을 생성하고 15-24μM의 농도에서 ~1mL의 조리보솜을 산출합니다.

  1. 1일차: 스타터 배양액의 준비 및 성장
    1. 보충 표 S2 및 보충 그림 S1에 설명된 바와 같이 리보솜 준비를 위한 원액 및 완충액을 준비한다.
      참고: 프로토콜의 각 부분을 실행하기 직전에 필요한 관련 배지 및 버퍼를 준비하고 표시된 대로 사용하기 전 최대 일수 동안만 보관하십시오.
    2. 두 개의 50mL 원뿔형 튜브를 준비합니다: 한 튜브에 10mL의 LB 배지를 추가하고 다른 튜브에 5mL의 LB 배지를 추가합니다.
    3. -80°C 냉동고에서 BL21(DE3)의 글리세롤 스톡을 꺼내 얼음 위에 올려 스톡이 해동되기 전에 다음 단계가 완료되었는지 확인합니다.
    4. 글리세롤 스톡에서 세포를 긁어낸 LB 배지 10mL를 접종하여 LB '미니 배양'을 만듭니다. 37°C, 220RPM에서 다른 (접종되지 않은) 튜브와 함께 배양하여 모든 성장이 항생제 없이 수행되므로 배지 오염을 확인합니다.
    5. -80°C 냉동고에서 글리세롤 스톡을 교체하십시오.
    6. 멸균 Terrific Broth(TB) 2.2L를 멸균 유리병에 넣고 37°C의 정적 인큐베이터에 보관하여 밤새 예열합니다.
  2. 2일차: 성장 및 펠릿화
    1. 인큐베이터에서 배양균을 제거하고 진행하기 전에 접종되지 않은 튜브 또는 예열된 배지 병에 오염이 없는지 확인하십시오.
    2. 1cm 큐벳에서 900μL의 LB에 100μL의 미니 배양 배양액을 첨가하여 10배 희석액을 준비하고 분광 광도계를 사용하여 OD600 을 측정합니다(~4-6인지 확인).
    3. 예열된 결핵 200mL를 멸균 500mL 원추형 플라스크에 첨가하고 적절한 부피의 미니 배양액을 접종하여 시작 OD600 = 0.05를 얻습니다(보충 표 S1). 이것이 '미디 문화'입니다.
    4. OD600 = 1이 될 때까지 37°C, 220RPM에서 미디 배양을 배양하며, 이는 약 1.5-2시간이 소요됩니다.
    5. 4개의 멸균 2.5L 배플 플라스크 각각에 500mL의 결핵을 추가합니다. 시작 OD600 = 0.05를 얻기 위해 적절한 양의 미디 배양액으로 각각을 접종합니다(보충 표 S1). 이것이 4가지 '맥시 문화'입니다.
    6. OD600 = 0.7-0.8이 될 때까지 37°C, 220RPM에서 최대 배양액을 배양하며, 이는 약 1.5-2시간이 소요됩니다.
    7. 그 동안 깨끗한 폴리프로필렌 공중합체 원심분리기 병 4개와 깨끗한 500mL 유리병 4개를 얼음 위에 라벨을 붙이고 식힙니다.
      참고: OD600 = 0.7 오버슈팅을 방지하기 위해 성장 1시간 후 15분마다 최대 배양 밀도를 측정합니다.
    8. OD600 = 0.7에 도달하면 배양물을 냉각된 유리병에 빠르게 옮기고 얼음물 수조에 20분 동안 넣어 성장을 종료합니다.
      참고: 식힌 병으로 배양물을 옮기는 것은 성장을 빠르게 멈추는 데 필수적입니다: 플라스크를 얼음물 수조에 직접 넣으면 성장을 효율적으로 종료할 수 없습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 후속 단계는 얼음 위에서 수행됩니다.
    9. 배양액이 얼음물 수조에서 냉각되는 동안 세포 펠릿화를 위해 원심분리기를 예식시키고 500mL의 PBS 용액을 얼음 위에 올려 식힙니다.
    10. 20분 후, 각 배양액 250mL를 해당 예냉된 원심분리기 병으로 옮기고, 나머지 250mL는 얼음 위에 유지하면서 3,220× g, 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
    11. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하고 종이 타월로 닦아냅니다.
    12. 각 배양액의 나머지 250mL를 해당 원심분리기 병에 넣고 3,220× g, 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다.
    13. 디캔팅하여 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 다시 얼음 위에 놓기 전에 종이 타월로 병을 닦아냅니다.
    14. 멸균 얼음처럼 차가운 PBS 30mL를 각 원심분리기 병에 넣고 세포 펠릿을 완전히 재현탁합니다.
    15. 4x 깨끗한 50mL 원추형 튜브를 계량하고 라벨링합니다.
    16. 세포 현탁액을 4 x 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
    17. 3,220 × g, 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다.
    18. 디캔팅하여 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 얼음 위에 다시 놓기 전에 종이 타월로 튜브를 닦아냅니다.
    19. 멸균 얼음처럼 차가운 PBS 30mL를 각 원뿔형 튜브에 넣고 소용돌이를 통해 세포 펠릿을 완전히 재현탁합니다.
    20. 3,220 × g, 4 °C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다.
    21. 디캔팅하여 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 얼음 위에 다시 놓기 전에 종이 타월로 튜브를 닦아냅니다.
    22. 멸균 얼음처럼 차가운 PBS 30mL를 각 원뿔형 튜브에 넣고 소용돌이를 통해 세포 펠릿을 완전히 재현탁합니다.
    23. 3,220 × g, 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다.
    24. 디캔팅하여 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 얼음 위에 다시 놓기 전에 종이 타월로 병을 닦아냅니다.
    25. 3,220 × g, 4 °C에서 2분 동안 마지막으로 원심분리합니다.
    26. 피펫팅으로 과도한 상청액을 제거합니다.
    27. 각 원추형 튜브의 질량을 측정하고 기록합니다. 세포 펠릿 질량은 이 값과 튜브의 빈 중량 (~1g이어야 함) 사이의 차이입니다.
    28. 액체 질소를 사용하여 세포 펠릿을 스냅 동결하고 -80°C에서 보관합니다.
  3. 3일차: 용해, 초원심분리 및 완충액 B 담금
    1. 얼음 위에서 세포 펠릿을 해동합니다.
    2. 50mL의 리보솜 완충액 A를 깨끗한 원추형 튜브에 첨가합니다.
    3. 원뿔형 튜브에서 100μL의 리보솜 완충액 A를 꺼내 No-Weigh DTT 바이알에 첨가합니다. DTT 펠릿을 완전히 용해시켜 0.5M DTT 스톡을 얻습니다.
      참고: 여기에 설명된 대로 후속 0.5M DTT 스톡을 준비하되 각 단계에 적절한 완충액을 사용합니다.
    4. 100μL의 0.5M DTT를 50mL 원뿔형 튜브에 다시 추가하여 50mL 리보솜 완충액 A에서 1mM DTT의 최종 농도를 얻습니다. 용액을 얼음 위에 보관합니다.
    5. 각 세포 펠릿을 리보솜 완충액 A + DTT에 세포 펠릿 1g당 2mL의 비율로 완전히 소용돌이로 재현탁합니다. 재현탁된 모든 세포를 하나의 원추형 튜브에 결합하여 총 재현탁된 슬러리 부피를 확인하며, 이는 2L의 배양액에서 10mL여야 합니다. 필요한 경우 추가 리보솜 완충액 A + DTT로 부피를 10mL까지 보충합니다.
    6. 슬러리를 별도의 원추형 튜브에 2 x 5mL 샘플로 나눕니다.
    7. 냉각된 초음파 처리 프로브를 사용하여 얼음 수조에서 10주기(총 프로그램 길이 3분 20초) 동안 30% 진폭, 20초 켜기, 20초 끄기에서 초음파 처리를 통해 각 튜브의 세포를 용해합니다(그림 3A, 3C).
      알림: 초음파 처리 중에 튜브 당 약 1,000 J의 에너지가 전달되어야합니다. 에너지 전달의 일관성을 보장하기 위해 초음파 처리 중에 튜브를 제자리에 고정하기 위해 고정 스탠드를 사용하십시오.
    8. 리보솜 완충액 A + DTT로 용해된 각 샘플의 부피를 25mL로 채우고 잠시 소용돌이치게 혼합합니다.
    9. 내용물을 2x 냉각된 S30 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    10. 4°C에서 1시간 동안 30,000× g 에서 원심분리합니다(그림 3E).
    11. 각 S30 튜브에서 펠릿이 없는 상청액(펠릿의 멤브레인 오염을 방지하기 위해)의 최대 75%를 두 개의 깨끗한 예냉식 S30 튜브로 회수합니다.
    12. 30,000 × g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
    13. 펠릿이 없는 상청액의 최대 75%를 두 개의 깨끗한 50mL 원뿔형 튜브에 회수하고 리보솜 완충액 A + DTT로 각각의 부피를 25mL로 채웁니다.
    14. 샘플을 두 개의 깨끗한 사전 냉각된 S100 튜브로 옮깁니다.
      참고: 초원심분리 전에 튜브가 정확하게 균형을 이루고(반대쪽 튜브 간의 최대 0.01g 차이) 25mL(S100 튜브의 최대 용량)로 채워져 있는지 확인하십시오.
    15. 100,000 × g 에서 4°C에서 4시간 동안 원심분리합니다(그림 3F).
    16. S100 실행이 끝나기 30분 전에, 위의 지침에 따라 얼음처럼 차가운 리보솜 완충액 B를 사용하여 0.5M DTT 스톡을 준비하고, 리보솜 완충액 B 50mL에 1mM DTT의 최종 용액을 생성합니다.
    17. 디캔팅하여 초원심분리기 튜브에서 상청액을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 리보솜 완충액 B + DTT 5mL를 리보솜 펠릿이 들어 있는 각 S100 튜브에 첨가합니다. 남은 리보솜 완충액 B + DTT는 다음날 사용할 수 있도록 4°C에 보관합니다.
    18. 냉장실의 얼음 위에서 튜브를 배양하여 리보솜 펠릿을 리보솜 버퍼 B + DTT에 밤새 담그게 합니다.
      참고: 리보솜 펠릿이 리보솜 완충액 B + DTT에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 이것은 얼음 속에 튜브를 비스듬히 배치하여 달성할 수 있습니다(그림 3D).
  4. 4일차: 초원심분리 및 완충액 C 담금
    1. 다음날, 밤새 담근 리보솜 펠릿이 들어 있는 각 S100 튜브에 얼음처럼 차가운 리보솜 완충액 B + DTT 5mL를 추가로 추가합니다.
    2. 피펫팅으로 펠릿을 부드럽게 재현탁해 보십시오. 피펫 팁을 사용하여 튜브 벽에서 펠릿을 긁어내고 이러한 방식으로 재현탁합니다. 내용물을 두 개의 깨끗한 예식 S30 튜브로 옮깁니다.
    3. 리보솜 펠릿이 포함된 각 S100 튜브에 얼음처럼 차가운 리보솜 완충액 B + DTT 10mL를 추가로 추가하고 위와 같이 재현탁 단계를 반복합니다.
    4. 재현탁액을 이전과 동일한 S30 튜브에 대조합니다.
    5. 4°C에서 1시간 동안 30,000× g 에서 원심분리합니다(그림 3G).
    6. 펠릿이 없는 상청액의 최대 75%를 2개의 깨끗한 50mL 원뿔형 튜브에 회수하고 Ribosome Buffer B + DTT로 부피를 25mL까지 보충합니다.
    7. 이 샘플을 두 개의 깨끗한 사전 냉각된 S100 튜브로 옮깁니다.
      참고: 초원심분리 전에 튜브의 균형이 정확하게 맞춰져 있고 25mL(S100 튜브의 최대 용량)의 부피로 채워져 있는지 확인하십시오.
    8. 100,000 × g 에서 4°C에서 4시간 동안 원심분리합니다(그림 3H).
    9. S100 실행이 끝나기 30분 전에 위의 지침에 따라 얼음처럼 차가운 리보솜 완충액 C를 사용하여 0.5M DTT 스톡을 준비하고 5mL의 리보솜 완충액 C에 1mM DTT의 최종 용액을 생성합니다. 이 완충액을 얼음 위에 보관합니다.
    10. 초원심분리 후 상청액을 버리고 피펫팅으로 잔류 완충액을 제거합니다. 펠릿이 완충액으로 덮이지 않은 상태로 너무 오랫동안 방치되지 않도록 신속하게 작업하십시오.
    11. 얼음처럼 차가운 리보솜 완충액 C + DTT 400 μL를 리보솜 펠릿이 들어 있는 각 초원심분리기 튜브에 첨가합니다.
    12. 냉장실의 얼음 위에서 튜브를 배양하여 리보솜 펠릿을 리보솜 버퍼 C + DTT에 밤새 담가둡니다.
      참고: 리보솜 펠릿이 리보솜 완충액 C + DTT에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 이것은 튜브를 얼음 속에 비스듬히 배치하여 달성할 수 있습니다.
  5. 5일차: 수집
    1. 다음날 1mL 피펫을 사용하여 리보솜 펠릿을 부드럽게 재현탁하고 부드럽게 소용돌이치면서 투명한 후광 리보솜 펠릿을 완전히 용해시킵니다.
      참고: 리보솜 펠릿은 이 단계에서 완충액에 완전히 용해되어야 합니다: 이 시점에서 불용성 펠릿이 없어야 하지만 노란색 불용성 펠릿이 남아 있으면 재현탁을 시도하지 마십시오.
    2. 리보솜 용액을 멸균 2mL 미세 원심분리기 튜브 2개로 옮기고 20,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 남아 있는 불용성 물질을 펠릿화합니다.
    3. 펠릿이 없는 상청액을 깨끗한 튜브에 모아 얼음 위에 보관합니다(그림 3I).
    4. 리보솜 완충액 C 198μL에 2 μL를 3 중으로 첨가하여 리보솜 용액의 100 배 희석액을 만듭니다.
    5. 260nm에서 RNA의 농도를 측정합니다. 희석된 샘플의 10 흡광도 단위는 24μM의 리보솜13에 해당합니다.
    6. 분취량 리보솜 용액(예: 사용자 요구에 따라 50μL 분취량)을 사용하여 최대 농도 24μM의 액체 질소에서 급속 동결하고 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
      참고: 프로토콜은 12-18μM 농도에서 약 1mL의 리보솜으로 이어져야 합니다. 리보솜이 너무 묽으면 3kDa MWCO 필터8를 사용하여 농도를 달성할 수 있습니다.

4. CFPS 실험 설정

  1. 예비 작업
    1. 확립된 프로토콜9에 따라 DNA 주형(선형 또는 플라스미드)을 준비합니다.
      참고: 우리 연구실에서는 무세포 발현에 최적화된 T7p14 발현 시스템을 기반으로 하는 DNA 주형을 사용합니다14. 정제된 PCR 산물은 선형 템플릿으로 사용할 수 있습니다. 플라스미드는 미니프립 후에 세척되어야 하며 상용 키트마다 다양한 결과가 산출된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다15.
    2. 표 3에 설명된 대로 5x 에너지 용액을 준비합니다.
    3. 표 4에 설명된 대로 6x 매트릭스 용액을 준비합니다.
  2. PURE 반응 설정 및 모니터링
    참고: 이 프로토콜은 마스터 믹스를 사용한 삼중 측정 설정을 설명합니다. 반응 수는 보충 표 S3에 제공된 스프레드시트를 사용하여 필요에 따라 확대 또는 축소할 수 있지만 단일 실험 조건에 대해 최소 3회 반복을 권장합니다.
    1. 해동에는 얼음 위의 PURE, 리보솜, 에너지 용액 및 매트릭스 용액의 분취량이 필요했습니다.
    2. 표 5와 같이 PCR 튜브에서 총 17μL의 단일 삼중 반응 세트를 위한 마스터 믹스를 준비합니다: 에너지 용액, PURE 단백질, 리보솜, 매트릭스 용액, 뉴클레아제가 없는 물을 17μL로 순서대로 조립합니다.
    3. 피펫을 5.1μL로 설정하고 용액을 5-6회 부드럽게 흡인하여 혼합하여 균질성을 보장합니다.
    4. 동일한 피펫 설정(5.1μL)을 사용하여 마스터 믹스를 광학 384웰 플레이트의 3개의 개별 웰에 로드합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 피펫을 첫 번째 정지 지점 너머로 밀지 마십시오. 형광 누화를 최소화하기 위해 각 복제 사이에 하나의 웰 공간을 남겨 둡니다.
    5. 접착 플레이트 씰을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.
    6. 필요에 따라 다운스트림 배양 또는 플레이트 리더 측정을 진행합니다.
      참고: 글리세롤을 함유한 추가 성분(예: 인핸서 단백질)을 첨가할 때 해당 성분의 최종 부피가 반응 부피의 10%를 초과하지 않도록 하십시오. 예를 들어, 글리세롤이 30% 함유된 성분은 17μL 마스터 믹스당 1.7μL로 제한되어야 합니다.
      로딩 후 384웰 플레이트를 원심분리하지 마십시오. 원심분리는 글리세롤이 풍부한 성분(예: PURE 시스템)의 분리를 일으켜 발현 수준이 일관되지 않을 수 있습니다. 플레이트 디자인은 소량 반응을 지원하며, 신중한 피펫팅은 원심분리 없이 적절한 침전을 보장합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

PURE 및 리보솜 준비에 대한 워크플로우는 그림 1에 나와 있으며, 작업에 대한 권장 시간표는 표 1에 나와 있습니다. 일반적으로 반응은 GFP 또는 mCherry와 같은 형광 단백질의 생산을 통해 모니터링되며 RFU 판독값은 보정11에 의해 농도로 변환될 수 있습니다. 그러나 CFPS 수율은 생산되는 특정 단백질에 따라 달라지므로 Thornton et al.16에 설명된 대로 원하는 관심 단백질을 생산하도록 시스템을 최적화하는 것이 중요합니다. 최적화의 출발점은 에너지 솔루션의 나머지 부분과 분리되어 유지되는 '행렬 솔루션'의 구성 요소의 변형입니다. 이러한 구성 요소에는 DNA 주형, 글루타민산칼륨, 아세트산마그네슘 및 tRNA가 포함됩니...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

우리는 동일한 실험실에서 여러 배치 및 사용자에 대해 재현 가능한 PURE 시스템을 얻을 수 있는 자세한 절차를 제시했습니다. 이를 달성하기 위해 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.

첫 번째 중요한 단계는 36가지 PURE 균주의 무결성을 보장하는 것입니다: 모든 플라스미드를 시퀀싱하는 것 외에도 단일 균주의 손실이 CFPS 활성을 없앨 수 있으므로 모든 균주가 올바르게 과발현되고 있는지 확인하기 위해 발현 시험을 수행하는 것이 필수적입니다. 우리는 돌연변이로 인한 발현 손실과 하나의 스톡에 여러 균주가 존재하는 오염을 모두 관찰했습니다. 두 번째 시나리오는 녹아웃 ΔPURE 시스템이 필요한 경우 제거하는 것이 중요합니다. 향후 작업에서는 Zhang et al.10이 제안한 대로 PURE 시스템을 보다 안정적인 플라스미드 및 균주로 합리화하는 것이 유리할 것입니다.

...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

SL은 파지 엔지니어링을 위한 무세포 기술을 개발하는 Biophoundry Inc.의 공동 창립자이자 CTO입니다.

감사의 글

NL, SL, AB 및 NZ는 NL의 UKRI 미래 리더 펠로우십(MR/V027107/1)의 지원을 받습니다. SL은 Biophoundry Inc.의 추가 지원을 받습니다. SY는 에든버러 대학의 다윈 트러스트 박사 과정 학생의 지원을 받습니다. CW는 BBSRC Eastbio 박사 과정 학생의 지원을 받습니다. 저자는 Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology[226791]의 자금 지원을 받아 초원심분리기 사용에 도움을 준 A. Pompa에게 감사를 표합니다. 또한 원래 OnePot 프로토콜을 설정하는 데 도움을 준 B. Lavickova와 S. J. Maerkl에게 감사드립니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출물에서 발생하는 모든 저자 승인 원고 버전에 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시(CC BY) 라이선스를 적용했습니다. 그림 1 은 BioRender에서 부분적으로 만들어졌습니다. 라오하쿠나콘, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
유튜브 2회시그마Y2377-250G
아미노산시그마LAA21-1KT
암모늄 아세테이트 RNAse 프리써모 사이언티픽AM9070G
염화암모늄시그마09718-1KG
암피실린시그마A8351-5G
BL21(DE3) 건강한 대장균NEBC2527H
병, 원심분리기 (날겐)써모 사이언티픽3120-9500폴리프로필렌 공중합자 병
병, 유리병(듀란) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
브래드포드 분석, 퀵 스타트 1x 염료 시약바이오-래드5000205
원심 분리기써모 사이언티픽헤라우스 메가퓨지 16R
원심분리기, 마이크로에펜도르프5424R 
크로마토그래피 컬럼바이오-래드7321010
크레아틴 인산염시그마27920
큐벳, 세미마이크로 1.6 mL피셔브랜드FB55147
이나트륨 수소 정형인산 이수화물피셔 케미컬S/4450/60
투석 카세트, 슬라이드-A-라이저 G3, 2 kDa MWCO, 15 mL써모 사이언티픽A52962
이칼륨 수소 정인산 무수화물피셔 케미컬P/5240/60
DTT 무중량써모 사이언티픽A39255
필터 유닛, 원심 3kDa MWCO 아미콘 울트라 15EMD 밀리포어UFC900324
플라스크, 500 mLVWR214-1133
플라스크, 배플 2.5 L 튀네어SS-5013
폴리닉산시그마F7878-100MG
글리세롤시그마G5516-1L
HCl피셔브랜드H/1200/PB17
HEPES 완충액, 1 M 용액 pH 7.3써모 사이언티픽BP299
이미다졸시그마I2399-500G
부 화기에펜도르프뉴브런즈윅 이노바 & 42
IPTG써모 사이언티픽R0392
KOH 펠릿써모 사이언티픽P1767-500G
L-글루탐산 헤미마그네슘 사수화물 염시그마49605-250G
L-글루탐산 단칼륨 염 일수화물시그마49601-500G
마그네슘 아세테이트 사수화물시그마M5661-50G
염화마그네슘플루카63020-1L
자기 교반 장치스튜어트US152
나노드롭써모 사이언티픽나노드롭 2000
NEBExpress Ni-NTA 매그 비즈NEBS1423S
파라필름시그마P7543-1EA
피펫, 멀티채널 Eppendorf Research Plus 30-300 및 마이크로; L에펜도르프3125000052
판 리더용 판 접착 씰엑셀사이언티컬STR-SEAL-PLT (무균)
플레이트 통기성 실링스타랩E2796-3005
플레이트 포일 씰엑셀사이언티컬FCS-25
번호판 인식기바이오텍시너지 H1
플레이트 셰이커올셩MBI100-4A
플레이트, 384 우물써모 사이언티픽242764
플레이트, 96 깊이 우물 1 mL써모 사이언티픽736-0601
플레이트, 96 깊이 웰 2 mL사르스테트82.1972.002
플레이트, 96웰 PCR사르스테트721,978
플레이트, 광학 96 웰써모 사이언티픽10057581
염화칼륨시그마P5405-500G
이수소 정인산 칼륨피셔 케미컬P/4800/53
단백질 추출(버그버스터) 시약EMD 밀리포어70584-3
단백질 정제 수지(cOmplete)로슈5893682001
로티세리 셰이커스타랩RM-멀티 1
소금피셔 케미컬S/3105/70
초음파 프로브, 피셔브랜드 15-50 mL써모 사이언티픽12931181
소닉에이터피셔 사이언티브FB120
분광광도계젠웨이제노바 플러스
스페르미딘시그마S2626-1G
TCEP 0.5 M수펠코646547
Thermo Fisher NTP, Tris 완충써모 사이언티픽R1481
대장균 MRE600에서 추출한 tRNA로슈10109541001
트립톤포미디어TRP02
튜브, 0.2 mL PCR 등급사르스테트72,737,002
튜브, 비주 스테릴린 7 mL 폴리스티렌써모 사이언티픽129A
관, 원뿔형 (팔콘) 15 mL사르스테트62.554.502
관, 원뿔형 (팔콘) 50 mL사르스테트62.547.254
튜브, 마이크로 원심분리기 (에펜도르프) 1.5 mL사르스테트72.690.001
튜브, 마이크로 원심분리기(Eppendorf) 2 mL사르스테트72.695.700
튜브, S100 원심분리 및 nbsp;벡맨-쿨터355619
튜브, S30 원심분리  써모 사이언티픽3118-0050
초원심분리기벡맨-쿨터옵티마 XPN-100
초원심분리기 로터벡맨-쿨터70Ti 고정각 로터
울트라퓨어 DNase/RNase 프리 증류수써모 사이언티픽10977049
소용돌이VWR444-2791
효모 추출물옥소이드LP0021T

참고문헌

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).
  3. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  4. Shimizu, Y., Ueda, T. Pure technology. Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).
  5. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).
  6. Shepherd, T. R., et al. De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  7. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).
  8. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).
  9. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. OnePot PURE cell-free system. J Vis Exp. (172), e62625(2021).
  10. Zhang, Y., et al. Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency. ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).
  11. Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. ATP regeneration from pyruvate in the PURE system. ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).
  12. Doerr, A., et al. Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).
  13. Christodoulou, J., et al. Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes. PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).
  14. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).
  15. Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production. Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).
  16. Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants. ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).
  17. Laohakunakorn, N. Cell-free 3PGA energy solution. , Protocols.io. (2020).
  18. Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S. Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).
  19. Blaha, G., et al. Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

PURE 시스템리보솜 준비합성생물학초원심분리GFP 형광광학 밀도 정규화글리세롤 농도단백질 발현
재현 가능한 무세포 단백질 합성을 위한 OnePot PURE 및 조류 리보솜 생산 개선
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.