방법 논문

자연 살해 세포 활성화의 신속한 무표지 분석을 위한 현장 배치 가능한 렌즈 프리 이미징 플랫폼

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DOI:

10.3791/68834

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2025년 8월 8일

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1Department of Electronics and Information Engineering, Korea University, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, 3Metaimmunetech Inc., 4Department of Gastroenterology and Hepatology, Guro Hospital, Korea University College of Medicine, 5Department of Laboratory Medicine, Anam Hospital, Korea University College of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 렌즈가 없는 섀도우 이미징 기술을 사용하여 자연 살해(NK) 세포 수 및 활성의 신속한 단일 세포 분석을 위한 무표지 방법을 설명합니다. 이 방법은 회절 패턴의 컴퓨터 분석을 통해 개별 NK 세포의 형태학적 변화를 정량화합니다.

초록

자연살해(NK) 세포는 바이러스에 감염된 악성 세포를 제거하는 선천성 면역의 중요한 이펙터입니다. NK 세포 활성 모니터링은 면역 기능을 평가하는 데 필수적입니다. 그러나 유세포 분석법과 같은 기존 방법은 노동 집약적이고 시간이 많이 걸립니다. 이 프로토콜은 렌즈 없는 섀도우 이미징 기술(LSIT)을 사용하여 자연 살해(NK) 세포 활동을 신속하게 분석하기 위한 무표지 기술을 설명합니다. 말초 혈액에서 분리되고 독점 활성제로 자극된 NK 세포를 LSIT 플랫폼을 사용하여 5분 이내에 분석했습니다. LSIT 플랫폼은 NK 세포에 빛의 간섭에 의해 생성된 그림자 이미지로 알려진 홀로그램 이미지를 캡처하고 그림자 매개변수의 변화를 분석하여 활성화 상태를 모니터링합니다. 피크 대 피크 거리(PPD) 및 2차 최대 폭의 표준 편차(WSM-SD)를 포함하여 그림자 이미지에서 파생된 주요 매개변수는 세포 형태와 내부 복잡성을 정량적으로 반영했습니다. 이러한 매개변수는 결합된 섀도우 매개변수(CSP) 및 선천성 면역 지수(I3)에 통합되어 세포의 형태학적 변화를 기반으로 NK 세포 활동에 대한 포괄적인 평가 및 정량화를 제공했습니다. 활성화 후 CSP의 백분율 변화로 계산된 I3는 NK 세포 활성의 직접적인 척도 역할을 했습니다. 건강한 개인의 NK 세포는 면역력이 저하된 개인의 NK 세포보다 지속적으로 유의하게 더 높은 I3 값을 보였습니다. LSIT 플랫폼은 현장 진단에 적합한 빠르고 비용 효율적인 면역 프로파일링을 가능하게 합니다.

서론

세포 형태는 분자 메커니즘의 핵심 지표로 떠오르고 있습니다. 이는 세포 구조를 시각적으로 표현할 뿐만 아니라 개별 세포의 기본 과정과 기능에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다1. 단일 세포 수준에서 면역 세포의 모양, 크기 및 활동을 분석하면 면역 세포의 행동, 이질성, 건강 및 질병에서의 역할에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다 2,3,4,5,6.

이러한 중요한 세포 중에는 선천성 면역 체계의 중심 구성 요소인 자연 살해(NK) 세포가 있습니다 7,8. 그들은 바이러스에 감염된 암세포와 암세포를 제거하고 사이토카인 방출을 통해 적응 면역 반응을 조절합니다 9,10,11. 암, 바이러스 감염 및 면역결핍은 종종 NK 세포의 수를 감소시키고 기능을 손상시킵니다12,13,14. 따라서 NK 세포 활성화는 중요한 바이오마커 역할을 하며 면역 체계의 전반적인 건강에 대한 정보를 제공합니다. 결과적으로, NK 세포 활성화의 신속한 단일 세포 평가는 예후, 진단, 질병 모니터링 및 환자 계층화에 필수적입니다 15,16,17,18.

현재 NK 세포 활성은 세포독성 능력(표적 세포를 죽이는 능력)과 사이토카인 생산을 기반으로 평가됩니다 19,20,21,22. 자극 후 NK 세포에 의해 분비되는 인터페론-감마(IFN-γ)를 정량화하기 위한 크롬-51(51Cr) 방출 분석법24,25, 유세포 분석분석법 26,27 및 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)과 같은 세포 매개 세포독성을 측정하기 위한 종래의 방법28,29,30 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 여기에는 표준화 부족, 긴 프로토콜(예: 하룻밤 ELISA 배양), 세포 라벨링에 대한 의존성 및 높은 장비 비용이 포함됩니다31,32,33. 이러한 과제는 신속한 결과, 비용 효율성, 라벨 없는 분석 및 높은 처리량을 제공하는 혁신적인 방법의 필요성을 강조합니다. 또한, 단일 세포 수준에서 NK 세포 활성화를 평가하면 집단 이질성과 자극에 대한 개별 세포 반응에 대한 자세한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

이러한 한계를 극복하기 위한 새로운 기술 중에서, 렌즈 프리 섀도우 이미징 기술(LSIT)은 특히 효과적인 솔루션이다 34,35,36. 단순화된 디지털 인라인 홀로그래피(DIH)인 LSIT는 단일 세포 분해능 37,38,39에서 NK 세포 활성화의 신속하고 라벨이 없는 고처리량 분석을 가능하게 합니다. DIH는 산란된 레이저 광과 디지털 센서의 동일선상 기준 빔 사이의 간섭 패턴을 캡처하여 미세한 물체에 대한 3차원(3D) 정보를 재구성합니다40,41. LSIT는 부분적으로 일관된 LED, 마이크로핀홀 및 CMOS 센서를 사용하여 세포(42,43,44,45)의 회절 패턴(즉, 그림자 이미지)을 캡처함으로써 이 접근법을 단순화합니다. 이 기술의 이론적 근거는 면역 세포의 활성화가 종종 세포 크기, 모양, 세포질 입도 및 핵 구조의 변화를 포함하여 형태학적 변화를 일으킨다는 관찰에 기초합니다 46,47,48,49,50. LSIT는 회절 패턴 51,52,53에 직접적인 영향을 미치는 이러한 변화에 매우 민감합니다.

이러한 형태학적 변화에 대한 LSIT의 민감도와 회절 패턴에 미치는 영향을 기반으로 하는 이 프로토콜은 Cellytics NK 플랫폼(이하 LSIT 플랫폼54)을 사용하여 단일 세포 수준에서 NK 세포 수 및 기능적 활성을 빠르고 정확하게 정량화하기 위한 새로운 방법을 제시합니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이 LSIT 플랫폼은 샘플 처리, 활성화 및 섀도우 이미징을 컴팩트한 다중 채널 워크플로우에 통합합니다. NK 세포를 전혈에서 분리하고 특별히 제조된 활성화 자극제 칵테일(ASC)으로 자극한 다음 전용 분석 칩에 로드했습니다. ASC는 노출 후 1시간 이내에 세포 크기 증가 및 내부 복잡성과 같은 NK 세포의 형태학적 변화를 유도하며, 이는 LSIT 플랫폼55,56을 사용하여 정확하게 검출될 수 있습니다.

LSIT 플랫폼은 LED 광원과 CMOS 센서를 사용하여 개별 셀의 DIH 패턴(그림자)을 캡처합니다(그림 1B). 그런 다음 특수 알고리즘이 이러한 그림자 패턴을 분석하고 세포 크기와 상관관계가 있는 피크 간 거리(PPD) 및 세포질의 복잡성 및 불규칙성과 상관관계가 있는 2차 최대값 너비의 표준 편차(WSM-SD)와 같은 주요 매개변수를 추출합니다(그림 1C,D). 자극 전후의 값을 비교하여 플랫폼은 활성화 후 CSP의 백분율 변화를 반영하는 결합된 그림자 매개변수(CSP = PPD × WSM-SD)와 선천성 면역 지수(I³)의 복합 지수를 계산합니다. CSP를 도입하는 이유는 면역 활성화가 세포 확대와 세포질 복잡성 증가를 모두 포함하기 때문입니다. 두 기준 중 하나에만 의존하면 경계선 활성화를 놓치거나 파편이나 불규칙한 조명과 같은 소음의 영향을 받을 수 있습니다. CSP는 두 메트릭 모두에서 일관된 이동을 요구하여 분류를 개선합니다. 이 지표는 형광 표지나 복잡한 샘플 처리 없이 다양한 세포 집단의 활성화 상태를 분류합니다.

이 프로토콜은 면역 세포의 활성화 유도 형태학적 변화를 모니터링하기 위해 신속하고 정량적이며 라벨이 없는 방법이 필요한 연구자 및 임상의에게 특히 유용합니다. 기초 면역학 연구, 전임상 약물 스크리닝 및 면역 요법 평가에 적합하며 면역 상태의 신속한 평가가 필수적인 임상 환경에서 진단 또는 예후 도구로 사용할 수 있습니다. 이 방법에는 분리된 세포 집단, LSIT 플랫폼에 대한 액세스 및 특정 NK 세포 활성화 칵테일이 필요합니다.

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프로토콜

모든 연구는 기관 지침을 따랐으며 고려대학교 안암병원 임상시험심사위원회(승인번호: 2021AN0040)의 승인을 받았습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 샘플 수집 및 취급

알림: 모든 인간 혈액 샘플을 취급하십시오.amp표준 생물 안전 예방 조치와 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오.

  1. 멸균 헤파린 튜브에 환자의 말초 전혈을 무균 상태로 수집합니다.
  2. 튜브를 8-10회 부드럽게 뒤집어 항응고제를 혈액과 혼합합니다.
  3. 채취 직후 혈액 샘플을 분석합니다. 분석이 지연되는 경우 샘플을 2-8°C의 헤파린 처리 튜브에 보관하고 48시간 이내에 사용하십시오.
    알림: 전혈을 얼리지 마십시오. 세포 무결성을 보존하기 위해 신선한 샘플을 사용하십시오.

2. NK 세포 분리 및 활성화

참고: 이 프로토콜은 세포 분리를 위한 NK Sep 키트와 자극을 위한 NK 활성화 키트로 구성된 NK Prep Kit를 사용하여 인간 전혈에서 직접 NK 세포를 분리하고 활성화하기 위한 최적화되고 포괄적인 워크플로우를 제공합니다. 이 키트는 마그네틱 비드 기반 음성 선택 및 자극을 통합하여 렌즈가 없는 이미징 세포 분석 플랫폼을 통해 신속한 표현형 평가를 가능하게 합니다.

  1. 사전 테스트 설정
    1. 냉장고에서 키트를 꺼내 실온(15-28°C)에 두십시오.
      참고: NK Sep 키트에는 다음 구성 요소가 포함되어 있습니다.
      (a) 녹색 뚜껑: 항체 칵테일을 들어 있는 반응 튜브.
      (b) 빨간색 뚜껑: 희석 매체(1.5mL)에 자성 입자가 들어 있는 분리 튜브 1.
      (c) 보라색 뚜껑: 자성 입자를 포함하는 분리 튜브 2.
      (d) 회색 뚜껑: 회수 튜브(깨끗하고 비어 있음).
      NK 활성화 키트에는 다음 구성 요소가 포함되어 있습니다.
      (a) 차량: 밀봉된 알루미늄 백에 8개의 투명 튜브.
      (b) ASC: 밀봉된 알루미늄 백에 8개의 노란색 튜브.
      밀봉된 백에서 필요한 튜브만 꺼냅니다. 사용하지 않는 구성 요소를 다시 밀봉하고 냉장 보관하십시오.
    2. 필요한 장비를 준비합니다: 자기 분리기, 멸균 팁이 있는 피펫, 37°C로 설정된 보정된 인큐베이터 또는 가열 블록.
  2. NK 세포 분리 절차
    1. 항체 칵테일이 들어 있는 녹색 캡이 있는 반응 튜브에 전혈 0.5mL를 추가합니다. 튜브를 2-3회 뒤집어 부드럽게 혼합하고 5분 동안 배양합니다.
    2. 전체 내용물을 빨간색 캡이 있는 분리 튜브 1로 옮깁니다. 부드럽게 2-3회 섞습니다.
    3. 튜브를 자기 분리기에 놓고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    4. 자석을 제자리에 놓은 상태에서 약 1.5mL의 상청액을 보라색 캡이 있는 분리 튜브 2로 옮깁니다. 부드럽게 2-3회 섞습니다.
    5. 분리 튜브 2개를 마그네틱 스탠드에 놓고 10분 동안 배양합니다.
    6. 자석이 부착된 상태에서 약 1.0mL의 상청액을 회색 뚜껑이 있는 회수 튜브로 옮깁니다. 조심스럽게 섞는다.
  3. NK 세포 활성화
    1. 분리된 NK 세포 현탁액 100μL를 비히클 튜브에 추가하고 100μL를 ASC 튜브에 추가합니다
    2. 두 튜브의 내용물을 조심스럽게 섞습니다.
    3. 튜브를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
      알림: 보정된 가열 블록을 사용하여 일정한 배양 온도를 유지하십시오.

3. LSIT 플랫폼을 이용한 이미징 및 분석

참고: 세포는 배양 직후 분석해야 합니다. 즉각적인 분석이 불가능한 경우 배양된 세포를 2-8°C에서 보관하고 6시간 이내에 분석합니다. LSIT 플랫폼은 DIH를 사용하여 인간 혈액 샘플의 세포 형태와 수를 평가합니다. 면역 활성을 분석하기 위해 자극되지 않은 NK 세포와 ASC 자극된 NK 세포를 모두 특수 슬라이드에 로드하고 장치에 삽입하고 자동으로 이미지화했습니다.

  1. 장치 설정 및 보정
    알림: 샘플을 분석하기 전에 항상 백그라운드 보정을 수행하십시오.
    1. LSIT 플랫폼을 켭니다. LED, 팬 및 카메라가 작동하는지 확인하십시오.
    2. LSIT 캡처 소프트웨어를 시작합니다. ID와 비밀번호를 입력하여 로그인합니다.
    3. 설정으로 이동하여 보정을 선택합니다.
    4. 터치스크린의 열기 버튼을 누르거나 물리적 슬라이딩 도어 버튼을 사용하여 도어를 엽니다. 서랍이 열리면 보정 슬라이드를 제거하고 보관하십시오.
    5. 테스트 슬라이드가 없는지 확인합니다. 서랍을 닫습니다.
      알림: 슬라이드 표면을 청소하려면 광학 물티슈만 사용하십시오.
    6. 배경 설정을 클릭하여 광학 강도를 보정합니다.
    7. 보정 슬라이드를 교체하고 서랍을 닫습니다.
    8. 보정 시작을 클릭합니다.
      알림: 장치에 액체를 엎지른 경우 즉시 전원을 끄십시오. 깨끗이 닦아주세요. 장치를 분해하지 마십시오.
  2. 분석 슬라이드 준비 및 로딩
    1. 파우치에서 분석 슬라이드를 꺼내 샘플 데이터로 라벨을 붙인 다음 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다.
    2. 비히클(자극되지 않은) 샘플 10μL를 채널 A와 B에 피펫팅합니다.
    3. ASC 자극 샘플 10μL를 채널 C와 D에 피펫팅합니다.
      알림: 기포 형성 및 과충전을 피하십시오.
    4. 열기를 눌러 서랍을 꺼내고 보정 슬라이드를 제거한 다음 보관 상자에 넣습니다.
    5. 준비된 분석 슬라이드를 삽입하고 닫기를 누릅니다.
  3. 이미지 획득: 테스트 메뉴 1 - NK 세포 활동
    알림: 이미지 획득에 실패하면 조명 및 샘플 볼륨을 확인하십시오. 필요한 경우 재보정합니다.
    1. LSIT 시스템에 로그인하고 메인 화면에서 NK 세포 활동 테스트를 선택합니다.
    2. 샘플 ID를 입력하거나 바코드 스캐너를 사용합니다.
      참고: 보관된 목록에서 샘플 ID를 검색하려면 검색 버튼을 사용합니다.
    3. 캡처를 눌러 녹화를 시작합니다.
    4. 이미지를 캡처한 후 분석을 클릭합니다
    5. 화면에 표시된 NK 세포 활성(%)과 세포 수를 확인합니다.
      참고: 유효한 결과는 숫자로 표시됩니다. I3 이 범위 미만이면 "≤100%"가 표시됩니다. 범위 위에는 ">300%"가 표시됩니다.
    6. 결과를 USB에 다운로드하거나 터치스크린 메뉴를 사용하여 인쇄합니다.
  4. 이미지 획득: 테스트 메뉴 2 - 세포 계수
    1. 기본 인터페이스의 테스트 메뉴 2에서 셀 카운팅 옵션을 선택합니다.
    2. 10μL의 샘플을 새 분석 슬라이드 채널에 로드합니다.
    3. 슬라이드를 삽입하고 서랍을 닫은 다음 샘플 ID를 입력합니다.
    4. 해당되는 경우 희석 계수를 입력합니다.
    5. 카운트를 누릅니다.
      참고: 결과가 테스트 범위 내에 있으면 NK 셀 수가 시스템 화면에 숫자 값으로 표시됩니다. 테스트 범위 미만의 결과에는 "≤ 10 cells/μL"가 표시되고 "> 1,000 cells/μL"를 초과하는 결과에는 "1,000 cells/μL"가 표시됩니다.
    6. 결과를 세포/μL로 표시합니다.
      참고: 검은색 결과 필드를 전환하여 이미지의 실제 셀 수를 봅니다.
    7. 결과를 검토하고 다운로드하거나 인쇄합니다.
      참고: 정확한 결과를 얻으려면 올바른 희석 계수를 입력했는지 확인하십시오.

4. 분석 후 정리

  1. 열기 버튼이나 물리적 토글 스위치를 사용하여 서랍을 엽니다.
  2. 사용한 슬라이드를 제거합니다.
  3. 센서를 보호하기 위해 교정 슬라이드를 서랍에 다시 넣습니다.
  4. 서랍을 닫습니다.
  5. 사용한 튜브, 팁 및 슬라이드는 실험실 폐기물에 대한 규정에 따라 폐기하십시오.

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결과

이 프로토콜에 따라 LSIT 플랫폼은 세포의 형태학적 변화를 기반으로 NK 세포 활성화에 대한 정량적이고 무표지 평가를 가능하게 합니다. 그림 2A 는 ASC 유무에 관계없이 2시간 배양 후 건강한 기증자로부터 1차 NK 세포의 Hema-3 염색 사이토스핀 제제를 보여줍니다. ASC에 의한 활성화는 비히클(자극되지 않은) 대조군에 비해 주로 세포 확대 및 내부 복잡성 또는 세분성 증가와 같은 현저한 변화를 초래합니다. 이러한 변화는 섀도우 회절 패턴의 형태로 캡처되며, 이는 통합 소프트웨어를 사용하여 LSIT 플랫폼에서 분석하여 각 셀에 대한 주요 형태 측정 매개변수를 추출합니다(그림 2B). 이 프로토콜은 서로 다른 NK 세포 활성화 상태를 효과적으로 구별하고 전반적인 선천성 면역 기능을 평가할 수 있습니다.

섀도우 매개변수의 재현성을 평가하기 위해 비히클 및 ASC 자극...

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토론

이 프로토콜은 NK Prep Kit를 사용한 세포 분리 및 활성화와 LSIT 플랫폼을 통한 분석을 결합한 NK 세포 활성화를 정량화하기 위한 표준화된 무표지 방법을 제시합니다. 51Cr 방출, 유세포 분석 및 ELISA와 같은 기존 분석에 대한 빠르고 정량적인 대안을 제공합니다. 이 프로토콜은 LSIT 플랫폼이 장착된 실험실을 위해 개발되었으며 NK 세포 수와 I3의 그림자 이미지 분석을 기반으로 간단한 결과를 제공합니다. 단일 세포 해상도는 ELISA와 같은 질량 분석에서는 불가능한 상세한 통찰력을 제공합니다.

이 작업 흐름의 중요한 요소는 음성 자기 선택에 의한 세포 분리의 정확한 실행과 시약의 표준화된 처리입니다. NK 세포 준비의 품질과 순도는 그림자 이미지의 선명도와 매개변수 추출에 영향을 미칩니다. ASC 자극 중 변동성을 최소화하고 세포의 무결성을 보존...

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공개 사항

I.L., S.H., H.S.J. 및 S.S.는 본 연구에서 제시된 LSIT 플랫폼의 개발 및 상용화에 관여하는 회사인 Metaimmunetech Inc.와 제휴하고 있습니다. 구체적으로 HSJ는 회사의 창립자이자 CEO, SH는 CEO, SS는 회사의 CTO입니다. 그러나 저자는 이 원고의 결과와 해석이 객관적으로 보고되었으며 어떤 종류의 상업적 이익에도 영향을 받지 않음을 확인합니다. 다른 모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 한국연구재단(NRF) 기초과학연구사업(Grant#: RS-2024-00353675, Grant#: 2021R1I1A3056109), IITP(Institute for Information and Communications Technology Planning and Evaluation)가 주관하는 ITRC(Information Technology Research Center) 지원프로그램, 과학기술정보통신부(MSIT)의 자금 지원을 받는 R&D 성과사업화촉진원(COMPA)의 지원을 받아 한국(보조금#: IITP-2025-RS-2023-00258971(50%), 보조금#: 2710084652), 해양수산부가 지원하는 한국해양과학기술진흥원(KIMST) 지원사업(보조금#: 20210660), 고려대학교 보조금. 저자는 고려대학교에서 이전한 기술을 기반으로 Cellytics NK 장치 개발에 협력한 Metaimmunetech Inc.에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.7 mL 미세 원심분리기 튜브액시젠MCT-175-C멸균, DNase/RNase 프리
분석 슬라이드메타면역테크AS050-GCellytics 시스템 전용 슬라이드
50 슬라이드 한 상자에
소프트웨어가 포함된 Cellytics 시스템메타면역테크CS001렌즈 없는 섀도우 이미징 플랫폼
원심분리기(스윙 버킷 로터)라보진1580 르300– 500 &회; G 범위
CMOS 이미지 센서Cellytics 장치에 포함통합회절 이미징에 사용
사이토스핀 원심분리기나스코코리아TXT3 사이토 원심분리기사이토스핀 염색용
디지털 히팅 블록(37 ° C)다이한 사이언티픽DH입니다. WHB00349세포 배양용
ELISA 키트(IFN-&감마;)R& D 시스템DIF50C인간 IFN-&감마; ELISA 키트
Guava easyCyte 유세포 분석기밀리포어0500-5005CD107a 발현 분석용
헤마 3 스탯 팩써모피셔122-911사이토스핀 염색용
IL-12 (재조합 인간)R& D 시스템ASC의 구성 요소
IL-2(재조합 인간)페프로텍200-02ASC의 구성 요소
마그네틱 분리 랙메타면역테크M13R8비드 분리용
현미경 슬라이드마리엔펠트1000612사이토스핀 준비용
NK 활성화 키트메타면역테크MIT2301V, MIT2301ANK 세포 활성화용
NK Sep 키트메타면역테크MIT2301-500NK 세포 분리용
PE 마우스 항인간 CD107a, 100testBD 생명과학555801CD107a 발현 분석용
핀홀 조리개Cellytics 장치에 포함통합LSIT 조명 경로에 사용
피펫(2– 20 & 마이크로; 엘, 20– 200 & 마이크로; L)액시젠T-200-Y볼륨 조절 가능
섀도우 캘리브레이션 슬라이드메타면역테크AS050-G장치 교정용.
1개의 분석 슬라이드 박스에 1개의 교정 슬라이드
와류 믹서머크 SI-0246A재현탁용

참고문헌

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