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방법 논문

광대역 간섭성 안티 스토크스 라만 및 2광자 형광 수명 현미경을 사용한 초고 정보 함량 화학 이미징

1K 조회수

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DOI:

10.3791/68845

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2025년 10월 7일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 광대역 간섭성 안티 스토크스 라만 산란(BCARS), 2광자 여기 형광(TPEF) 및 2광자 형광 수명 이미징 현미경(2p-FLIM)을 결합하여 매우 높은 정보 함량의 화학 바이오이미징을 가능하게 하는 다중 모드 이미징 플랫폼을 보여줍니다.

초록

라만 지문 분광법과 형광 수명 이미징은 생물학적 표본의 대사 프로필을 연구하기 위한 새로운 도구입니다. 라만 지문 분광법은 시료의 분자 조성과 화학적 환경을 반영하는 고유 분자 진동을 감지하는 반면, 형광 수명 이미징은 미세 환경에 민감한 형광단의 여기 상태 수명의 변화를 측정합니다. 여기에서는 생물학적으로 관련된 라만 지문 스펙트럼과 형광 수명 신호를 생 체 내에서 동시에 획득할 수 있는 광대역 간섭 반스토크스 라만 산란(BCARS)과 2광자 형광 수명 이미징(2p-FLIM) 현미경을 결합한 다중 모드 이미징 플랫폼을 제시합니다. 공간적으로 공동 등록된 BCARS 및 2p-FLIM 이미지에서 얻은 엄청난 화학적 정보를 통해 세포하 구획 간의 미묘한 차이를 특성화하고 형광 이미징만으로 생성된 잠재적인 위양성 결과를 확인할 수 있습니다. 이것은 녹색 형광 단백질(GFP) 마커를 발현하는 살아있는 온전한 C. elegans 에서 동일한 염료 염색 소기관에서 동시에 얻은 BCARS, 2p-FLIM 및 2광자 여기 형광(TPEF) 신호를 직접 비교함으로써 입증됩니다. 이 작업에서는 BCARS/2p-FLIM/TPEF 설정 방식, 이미지 획득 단계, 데이터 처리 및 교차 양식 이미징 방법이 세포 이하 해상도에서 엄격한 특성화 및 생체 내 검출을 가능하게 함을 보여주는 대표적인 결과를 소개합니다. 이 프로토콜은 복잡한 생명 시스템에서 생물학적 해석의 정확성을 향상시키기 위해 동시 화학 및 형광 수명 이미징을 위한 프레임워크를 제공합니다.

서론

생물학적 연구의 한 가지 과제는 생물학적 건축 자재를 본래 상태와 세포와 조직의 온전한 구조 내에서 정확하게 감지하는 것입니다. 라만 분광법은 생물학적 표본 내에서 내재 대사 산물 및 화학 종을 검출하는 데 전례 없는 잠재력을 보여주며 최근 생물학적 표본의 대사 프로파일링을 위한 새로운 도구로 인식되었습니다1. 라만 지문 스펙트럼에 나타난 다양한 대사 그룹의 피크를 분석함으로써 지문 특징이 암 2,3,4, 심장 질환 5,6 및 신경퇴행성 질환 7,8과 같은 질병의 초기 단계를 감지하는 데 사용될 수 있으며 근본적인 생물학적 문제를 해결하는 데 특히 유용하다는 증거가 증가하고 있습니다 어떠한 표지 섭동11 없이 세포내 구조를 이미징하고, 다양한 세포 상태(12,13)를 구별하고, 세포 유형 분류(14,15,16)을 포함한다. 라만 스펙트럼에 인코딩된 대부분의 화학 정보(> 90%)는 지문 영역(500 내지 1800 cm-1)에 있으며, 이 영역은 생물학적 샘플의 화학 조성을 구별하는 데 단연 가장 유용합니다17. 그러나 이 주파수 범위에서 약한 라만 신호로 인해 라만 지문 분광법을 생물학적 연구에 적용하는 것이 어렵고, 특히 살아있는 온전한 생물학적 표본의 경우 더욱 그렇습니다1.

코히어런트 라만 이미징(CRI) 접근 방식은 라만 신호의 획득 시간을 크게 단축하지만 대부분은 상대적으로 좁은 스펙트럼 세그먼트를 획득하고 2800 - 3100 cm-1 사이의 강한 CH 스트레치 신호에 최적화되어 있습니다. 협대역 CAR 및 유도 라만 산란(SRS)(그림 1A,B)은 일반적으로 강한 CH 신호 18,19,20,21,22,23의 좁은 부분을 획득하기 위해 2개의 피코초 펄스를 사용합니다. 멀티플렉스 CARS와 같은 멀티플렉스 CRI 접근법(그림 1C)은 피코초와 ~100fs 펄스의 조합을 사용하여 일반적으로 CH 영역 24,25,26,27,28,29,30에서 적당한 스펙트럼 범위(보통 400cm-1 ≤)를 얻습니다. 이러한 이미징 접근법을 사용하여 픽셀당 전체 생물학적 관련 라만 스펙트럼(600 - 3200 cm-1)을 획득하는 것은 대부분의 지문 신호가 CH-스트레치 신호보다 10-100배 약하기 때문에 일반적으로 금지됩니다31. 대부분의 CRI 접근법과 달리, 광대역 간섭성 안티 스톡스 라만 산란(BCARS)은 지문 및 CH-스트레치 영역(31,32,33)을 커버하는 단일 샷 광대역 획득에 최적화되어 있다. BCARS는 ~10fs 펄스의 펄스 내 상호 작용을 사용하여 저주파(지문) 진동을 효율적으로 여기시키고(그림 1D), 다중 CARS와 동일한 메커니즘인 fs 펄스와 ps 펄스의 조합을 사용하여 CH 스트레치 영역에서 진동 일관성을 생성합니다(그림 1C)32,33. 또한, BCARS 신호는 비공진 배경(NRB)과의 상호 작용으로 인해 본질적으로 보정되며, 각 픽셀(31)에서 레이저 펄스당 정량적이고 기기 불변의 풀 라만 스펙트럼을 생성하며, 세포, 온전한 조직 및 살아있는 생물학적 유기체(32,34,35,36,37)로부터 높은 정보 함량 데이터를 신속하게 획득할 수 있는 능력과 함께,38,39.

획득한 원시 BCARS 스펙트럼에는 소위 강력한 "비공진 배경"(NRB)이 포함되어 있습니다. NRB는 화학적으로 특이적이지 않은 레이저 펄스에 대한 전자적 응답의 기여입니다. NRB는 헤테로다인 증폭기(32) 역할을 하는 진동 공진 신호를 일관되게 간섭한다. NRB는 또한 기본 라만 스펙트럼을 왜곡하지만(그림 2A), 중요한 인접 스펙트럼 섹션이 획득되는 한 라만 스펙트럼을 검색할 수 있습니다. 현재 협대역 CARS 접근 방식을 사용하여 공진 CARS 신호와 비공진 구성 요소를 분리하는 데 사용할 수 있는 후처리 방법은 없습니다. 광대역 CARS 신호로부터의 라만 신호 검색은 시간 영역 크레이머스-크로니히 관계(또는 힐베르트 변환)33,40(그림 2B), 최대 엔트로피(41,42) 또는 머신 러닝(43,44,45,46,47,48)을 활용하여 달성할 수 있다 접근. 처음 두 가지 방법은 원시 BCARS 스펙트럼에서 위상(공진 라만 신호)을 분석적으로 검색하며, 기계 학습 접근 방식은 계측 및 훈련 모델에 크게 의존할 수 있습니다.

BCARS 현미경은 생물학적 표본의 대사 프로파일링에 대한 무표지 특성화를 허용하지만, BCARS 신호 생성에 사용되는 동일한 초연속체 레이저(본 연구에서 제시된 BCARS 설정의 경우 950 - 1200 nm)는 로다민 기반, 보디피 기반, Alexa Fluor 기반 및 시아닌 기반 염료와 같은 광범위한 염료와 GFP 및 mCherry49를 포함한 다양한 형광 단백질을 흥분시킬 수 있습니다. 50. 근적외선(NIR) 광을 사용하는 2광자 형광 수명 이미징 현미경(2p-FLIM) 및 2광자 여기 형광 현미경(TPEF)과 같은 다광자 형광 현미경은 가시광선 연속파(CW) 레이저를 사용한 단일 광자 여기와 비교하여 더 깊은 시료 침투 깊이, 고유한 3D 절편 기능, 고대비 이미지 및 최첨단 공초점 현미경에 필적하는 우수한 해상도를 제공하여 생물학을 위한 매력적인 도구입니다 연구51,52. 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 접근법을 사용하는 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)은 시간 변조 레이저 소스(53,54)에 의해 반복적으로 여기된 형광 감쇠 신호를 감지합니다. 주어진 형광단의 형광 스펙트럼은 용매 극성과 같은 환경 요인에 따라 변할 수 있지만 이러한 변화는 일반적으로 미묘합니다. 한편, 형광 수명은 pH 값55, 점도56, 극성57 및 이온 종의 농도 58,59, 결합 상호 작용, 소광제의 존재 또는 구조적 변화 53,54와 같은 환경 변화에 따라 종종 두 가지 이상의 요인에 의해 달라집니다. 형광 수명의 이러한 독특한 특성은 형광 이미징에서 추가적인 신호 대비를 제공하고 세포 및 조직 이미징에서 자가형광 간섭 문제를 성공적으로 해결했으며60, 스펙트럼 분해 FLIM 접근법61, 암 진단 및 치료 모니터링62, 세포 이질성의 무표지 검출63 및 대사 변화64,65.

본 연구에서는 BCARS, 2p-FLIM 및 TPEF를 결합한 멀티모달 이미징 플랫폼을 소개합니다. 우리가 아는 한, BCARS와 2p-FLIM/TPEF 이미징을 동시에 허용하는 이미징 플랫폼을 제시하는 것은 이번이 처음입니다. 우리는 널리 사용되는 유전적으로 다루기 쉬운 모델 유기체인 Caenorhabditis elegans(C. elegans)를 사용하여 이 기기의 생체 내 이미징 기능을 보여줍니다. 우리는 BCARS 스펙트럼, 나일 레드(필수 지질 염료)의 2p-FLIM 붕괴 및 보고된 지질 마커(DHS-3::GFP)의 2광자 형광 GFP 신호가 나일-레드 염색 벌레로부터 생체 내에서 동시에 획득될 수 있음을 보여줍니다. 여기에 제시된 이미징 접근 방식에 대한 실용적인 가이드는 (i) 샘플이 광학적으로 투명해야 하며 두께가 일반적으로 100μm 미만이어야 합니다. (ii) 염료와 시료에 따라 염색 조건이 다를 수 있습니다. 여기에 표시된 C. elegans의 나일-적색 염색 결과에서 나일강 적색 농도는 ~μM 수준이고 염색 시간은 몇 시간에서 하룻밤까지 다양할 수 있습니다66; (iii) 2p-FLIM/TPEF 검출기로의 가시광선 누출을 방지하기 위해 어두운 샘플 환경이 필요합니다. 이러한 이미징 조건은 대부분의 비선형 광학 및 형광 현미경의 이미징 조건과 동일합니다. 또한, 여기에서 시연된 당사의 시스템은 2광자 형광 여기를 위해 700 -950 nm 범위를 커버하는 추가 Ti:Sapphire fs 레이저를 도입하여 나일강 적색 및 GFP 외에 다른 염료 및 형광 리포터를 검출하는 데 추가로 적용될 수 있습니다. 따라서, 이 프로토콜에 기술된 대표적인 결과는 GFP를 발현하는 염료 염색된 C. elegans의 생체 내 이미징이지만, 초고정보 함량 화학 바이오이미징 플랫폼은 광범위하고 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다.

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프로토콜

1. 씨 . elegans 샘플 준비 및 Nile Red Vital 염색

참고: C. elegans는 전신 투명성으로 인해 여러 이미징 기술에 많이 사용되었습니다. 내부 장기와 조직은 해부 없이 온전한 동물에서 쉽게 이미지화할 수 있습니다. 또한, C. elegans 는 척추동물로 간주되지 않으며 설치류와 같은 고등 동물과 동일한 윤리적 규정을 받지 않기 때문에 C. elegans와 관련된 연구에는 윤리 승인이 필요하지 않습니다. 이 섹션에서는 C. elegans 웜의 동기화 및 형광 이미징을 위한 나일 적색 염색 샘플의 준비에 대해 설명합니다. 동기화된 1일 성충 벌레는 2세대 산란 프로토콜 을 통해 얻어지고 새로 준비된 Nile Red-OP50 플레이트를 사용하여 염색됩니다.

  1. C. elegans 균주(예: N2, LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)])를 20°C에서 OP50 박테리아로 파종한 표준 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에 유지합니다.
  2. 웜 동기화
    1. 10-20마리의 임신 성충을 갓 만든 OP50 시드 NGM 플레이트에 올려 놓습니다.
    2. 알을 낳을 수 있도록 플레이트를 20°C에서 1-3시간 동안 배양합니다.
    3. 모든 성충을 제거하고 접시에 갓 낳은 알만 남겨 둡니다.
    4. 벌레가 1일 성충 단계에 도달할 때까지 플레이트를 20°C에서 배양합니다.
    5. 동기화 정밀도를 향상시키기 위해 추가 생성에 대해 위의 단계를 반복합니다.
  3. 나일 레드 원액 준비
    1. 15.92mg의 나일강을 10mL의 DMSO에 용해시켜 최종 농도 5mM이 되도록 합니다.
    2. 용해를 돕기 위해 필요한 경우 10-30분 동안 초음파 처리하십시오.
  4. Nile Red-OP50 염색 플레이트를 준비합니다.
    1. OP50 박테리아 슬러리를 나일 레드 스톡과 완전히 혼합하여 NGM 플레이트당 5μM의 최종 나일 레드 농도를 달성합니다. 예를 들어, 10μL의 나일 레드 스톡과 20 μL OP50 박테리아 슬러리를 혼합한 다음 전체 혼합물을 시드되지 않은 6cm(~10mL 부피) NGM 한천 플레이트에 즉시 도포하여 NGM 플레이트당 5μM의 최종 나일 레드 농도를 만듭니다.
    2. 혼합물을 시드되지 않은 6cm NGM 플레이트에 고르게 펴 바릅니다.
    3. 박테리아 성장과 염료 흡수를 허용하기 위해 플레이트를 실온에서 밤새 어둡게 보관하십시오.
  5. 염색 동기화 웜
    1. 30-50마리의 동기화된 1일 성충 벌레를 준비된 각 Nile Red-OP50 플레이트에 옮깁니다.
    2. 이미징하기 전에 20°C의 어두운 곳에서 1-2시간 동안 웜을 배양합니다.
  6. 이미징을 위해 웜 고정
    1. 현미경 슬라이드의 2% 아가로스 패드에 100mM 아지드화나트륨 한 방울을 도포합니다(웜 20마리의 경우 약 10-15μL).
    2. 염색된 벌레를 마취제(아지드화나트륨) 방울로 옮기고 현미경 검사 전에 커버슬립으로 벌레를 덮습니다.
      참고: 산란 동기화의 첫 번째 단계에서 새로 만든 NGM OP50 플레이트에 10-20마리의 임신 성충을 선택할 때 성충만 선택하고 길 잃은 알이나 유충은 선택하지 마십시오. 이는 접시에 남아 있는 모든 알이 1-3시간의 알을 낳는 시간 창 내에 채취된 벌레에 의해 생산되도록 하기 위한 것입니다. 또한 아지드화나트륨은 유해 물질로 분류되지만 선충 마취에는 매우 적은 양이 필요합니다. 아지드화나트륨 폐기물의 사용 및 폐기는 기관 환경 보건 및 안전 부서의 지침을 따라야 합니다.

2. 프로브 빔 생성

참고: 이 프로토콜은 프로브 빔의 출력 전력을 안정화하기 위해 집에서 만든 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 사용한 후 집에서 만든 신호 피드백 루프 시스템을 사용하여 2차 고조파 생성(SHG)을 사용하여 피코초(ps) 프로브 빔을 생성하는 방법을 설명합니다.

  1. 1030nm OPO 펌프 레이저(그림 3A 또는 그림 4에 표시된 거의 1ps, ~3W OPO 펌프 레이저)를 켜고 열 평형화를 위해 최소 2시간을 허용합니다. OPO 작동에는 안정적인 출력이 중요합니다.
  2. 출력을 OPO 캐비티로 안내합니다.
    1. 대상 신호 파장과 일치하도록 OPO PPLN(그림 3A) 크리스탈에서 적절한 폴링 주기를 선택합니다.
    2. 빔을 첫 번째 곡면 거울(CM)(그림 3A)으로 향하게 하여 선형 캐비티의 일부를 형성합니다.
    3. 광학 파라메트릭 하향 변환을 용이하게 하기 위해 빔이 주기적으로 극화된 니오브산리튬(PPLN) 결정(그림 3A)을 통과하는지 확인합니다(그림 3B).
    4. 빔이 두 번째 곡면 거울(CM)에서 반사된 다음 엔드 미러(EM)에서 반사되는지 확인합니다(그림 3A) 캐비티 루프를 형성합니다.
    5. 출력 커플러(OC)(그림 3A)를 구성하여 캐비티에서 생성된 신호 빔을 추출합니다.
  3. 온도 컨트롤러(TC)(그림 3A)를 사용하여 OPO PPLN 결정의 온도를 조정하여 신호 파장을 선택합니다. 일반적인 신호 파장은 1530nm이며, 1064nm에서 3W로 펌핑할 때 약 0.8W의 출력 전력에 해당합니다.
  4. OPO 정렬 최적화
    1. 두 개의 CM과 EM의 위치와 기울기를 조정하여 출력 전력과 빔 품질을 최대화합니다.
    2. 캐비티 길이를 조정하여 신호 스펙트럼을 원하는 주파수로 이동합니다.
  5. 시준 및 초점 광학 장치 세트를 통해 OPO 신호 빔을 라우팅하고 SHG 스테이지로 안내합니다.
    1. SHG PPLN 크리스탈(그림 3A)에서 대상 신호 파장과 일치하도록 적절한 폴링 주기를 선택합니다.
    2. SHG 효율을 극대화하기 위해 온도 컨트롤러를 사용하여 결정 온도를 정밀하게 제어합니다.
    3. 2차 고조파 생성을 위해 빔을 SHG PPLN 결정으로 향하게 하여 1530nm OPO 신호를 765nm로 변환합니다(그림 3C). 일반적인 SHG 변환 효율은 최적의 정렬 조건에서 약 30%입니다.
    4. SHG PPLN 뒤에 1300nm 단거리 통과 필터( 그림 3A의 SPF, 재료 표의 사양)를 삽입하여 잔류 1530nm 기본 광을 제거합니다.
    5. 적절한 렌즈를 사용하여 생성된 765nm 빔을 시준합니다( 그림 3A의 L).
  6. 전력 안정화 구현
    1. 쐐기 창(WW)을 사용하여 SHG 빔을 샘플링하고 포토다이오드(PD)로 보냅니다.
    2. 피드백 루프가 포토다이오드 신호( 그림 3A의 PD)를 기준 값과 비교하고 엔드 미러(EM)의 피코모터를 작동시켜 OPO 캐비티 길이를 실시간으로 조정하여 SHG 출력 전력을 안정화합니다.
      알림: 기준 값을 결정하려면 먼저 SHG 출력 전력을 기록하는 동안 피코모터를 사용하여 EM 위치를 스캔하십시오. 이 프로파일에서 피크 강도를 식별한 다음 참조 값을 피크의 90%로 설정합니다. 이 선택은 피드백 보정의 명확한 방향을 보장하여 시스템이 전력의 증가 및 감소 추세를 모두 보상하고 시간이 지남에 따라 출력 전력을 효과적으로 안정화할 수 있도록 합니다.

3. BCARS를 위한 초연속체(SC) 생성

참고: BCARS 기반 다중 모드 시스템의 단순화된 체계는 그림 4에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 SC 빔의 생성을 설명합니다.

  1. 프리처프(그룹 지연 분산, GDD)를 펨토초(fs) 펄스 출력(1030nm, 150fs, ~1W)으로 조정하여 지문 영역 신호(SC 대역폭 ≥ 1800cm-1)를 포괄하는 충분히 넓은 SC 대역폭을 얻습니다. 이를 달성하면 격자 쌍의 분리를 조정하고(그림 4 참조) 분산을 정밀하게 제어할 수 있습니다.
    참고: 사전 보상된 GDD의 적용은 원하는 펄스를 생성하고 SC 생성을 최적화하는 데 중요합니다. 필요한 GDD 값은 사용되는 레이저 시스템의 특정 특성에 따라 달라질 수 있습니다.
  2. 펌프 빔의 발산을 조정하기 위해 동일한 초점 거리를 가진 두 개의 렌즈로 구성된 빔 망원경을 통합합니다.
    참고: 빔이 확장되는 광섬유에 들어가기 전에 미터를 넘게 이동할 때 빔 발산을 정밀하게 제어하는 것이 필수적입니다. 이 거리 동안 시준된 빔을 유지하는 것은 효율적인 SC 생성을 보장하는 데 중요합니다.
  3. 빔 조향을 위해 피에조 액추에이터가 장착된 키네마틱 미러 마운트를 사용하여 자동 정렬기(그림 4)를 설정합니다. 이를 광학 웨지 및 위치 감지 검출기(PSD)와 결합하여 빔 정렬을 능동적으로 모니터링하고 수정합니다.
  4. 쐐기에서 첫 번째 거울까지의 거리가 쐐기에서 첫 번째 PSD까지의 거리와 같도록 구성요소를 배치합니다. 이 대칭 구성은 확장되는 광섬유에 대한 빔 포인팅 안정성을 보장합니다.
    참고: 능동 정렬은 스펙트럼 확장 효율을 극대화하고 광섬유 입력 손상 위험을 최소화하는 데 필수적입니다.
  5. 반파장판(HWP)과 편광 빔 스플리터(PBS)를 사용하여 광섬유에 결합하기 전에 레이저 출력을 제어합니다. HWP를 회전하여 PBS에 대한 편광 각도를 조정하여 전송 전력을 조정합니다. 이러한 구성 요소는 그림 4에 표시되지 않았지만 안전한 정렬 및 전력 제어에 매우 중요합니다.
  6. 광섬유 커플러를 사용하여 약 1W의 레이저 출력을 10cm LMA-PM-5(Large-Mode-Area Polarization Maintaining) 광자 결정 광섬유(PCF)에 결합합니다. 결합 절차는 다음과 같습니다.
    1. 먼저, 광섬유 손상을 방지하기 위해 초기 정렬 중에 레이저 출력을 ~20-50mW로 줄입니다.
    2. 시준된 빔을 광섬유로 향하게 하여 반대쪽에서 일부 빛이 나오도록 합니다. 출력 전력을 최대화하기 위해 위치를 조정하여 빔 경로를 최적화합니다.
    3. 비구면 렌즈(그림 4)를 삽입하고 빔을 다시 미세 조정하여 출력 전력을 최대화합니다.
    4. 비구면 렌즈의 z 위치를 조정하여 섬유 면에 정확한 초점을 맞춥니다.
    5. 정렬 및 초점 조정을 반복적으로 반복하여 결합 효율성을 극대화합니다.
    6. 작동을 위해 레이저 출력을 1W로 높입니다.
  7. 그림 4와 같이 초점 거리 f = 15mm의 축외 포물선(OAP) 미러를 사용하여 PCF에서 생성된 광대역 초연속체(SC) 출력을 시준합니다.
    참고: OAP 미러와 같은 반사 광학은 굴절 요소에 의해 도입되는 색수차를 최소화하기 위해 광대역 빔에 선호됩니다.
  8. 시준된 광대역 초연속체(SC) 출력을 한 쌍의 Schott Flint(SF10) 프리즘으로 구성된 프리즘 압축기(그림 4)로 안내합니다.
    1. SC 빔을 첫 번째 프리즘의 정점으로 향하게 하여 스펙트럼 분산을 시작합니다.
    2. 분산된 빔이 정점을 통해 들어오도록 두 번째 프리즘을 배치합니다.
    3. 프리즘 분리를 대략적으로 조정할 수 있도록 레일 시스템에 두 프리즘을 모두 장착합니다. 레일을 따라 두 번째 프리즘을 변환하여 광학 경로 길이와 전체 압축을 조정합니다. 이 시스템의 간격은 44cm입니다.
    4. 첫 번째 프리즘을 정밀 선형 변환 스테이지에 장착합니다. 첫 번째 프리즘의 삽입 깊이를 조정하여 분산 보정을 미세 조정합니다.
    5. 프리즘 분리와 두 번째 프리즘의 삽입 길이를 반복적으로 조정하여 SC 펄스의 최적의 시간적 압축을 달성합니다. 실험적으로 관찰된 퇴행한 4파 혼합(DFWM) 신호를 그룹 지연 분산(GDD) 및 3차 분산(TOD)을 설명하는 시뮬레이션 결과와 일치시켜 최적의 시간적 압축을 결정합니다. 이 접근 방식에는 GDD 및 TOD의 효과를 통합하여 초연속체 생성 프로세스의 시뮬레이션을 수행하는 것이 포함되며, 이는 최적으로 압축된 SC 펄스의 예상되는 시간적 및 스펙트럼 특성에 대한 참조를 제공합니다. 그런 다음 실험 DFWM 신호가 시뮬레이션 예측과 일치할 때까지 시스템에 존재하는 GDD 및 TOD를 보상하기 위해 프리즘 압축기 매개변수를 반복적으로 조정합니다. SC의 스펙트럼 프로파일의 일반적인 결과는 그림 5에 나와 있습니다.
      참고: 적절한 분산 보상은 SC의 스펙트럼 일관성을 향상시킵니다. 최적의 정렬에서 SC 출력은 약 150mW의 전력, 약 1060nm의 중심 파장, 950에서 1200nm(1800cm-1에 해당)의 스펙트럼 범위에 걸쳐 있습니다. 이 값은 정렬 및 광섬유 결합 효율에 따라 약간 달라질 수 있습니다.
  9. 이색성 거울을 사용하여 프로브와 초연속체 빔을 결합합니다( 그림 4의 DM 참조). 두 빔이 동일선이 되도록 한 쌍의 핀홀에 정렬합니다. 결합된 빔을 고주파 포토다이오드(1GHz 대역폭)에 초점을 맞춥니다. 최적의 신호 품질을 위해서는 두 빔이 공간 및 시간 영역 모두에서 겹쳐야 합니다. 프로세스는 다음과 같습니다.
    1. 포토다이오드의 출력을 고주파 오실로스코프(500MHz 대역폭)로 보냅니다. 레이저 트리거를 기준 시계로 사용하십시오.
    2. 프로브 빔을 차단하고 SC 펄스를 측정합니다. SC 펄스와 레이저 기준 간의 시간적 차이를 기록합니다.
    3. SC 빔을 차단하고 프로브 펄스를 측정합니다. 프로브 펄스가 SC 펄스와 시간에 맞도록 기계적 지연선( 그림 4 참조)을 조정합니다. 두 빔이 동시에 최대값에 도달하는지 확인합니다.
    4. 포토다이오드를 제거하고 빔이 현미경으로 들어가도록 합니다.
      참고: 위의 단계에서는 빔 오버랩에 대한 대략적인 조정에 대해 설명합니다. 보다 정확한 정렬을 위한 추가 최적화는 6.1 - 6.9 단계에서 다룹니다.

4. 2p-FLIM 및 TPEF에 대한 형광 검출 설정 및 추가 Ti:Sapphire fs 레이저 도입

  1. Ti:Sapphire 레이저를 켜고 열 평형에 도달하도록 합니다. 안정적인 출력 전력과 빔 포인팅을 보장하기 위해 약 2시간 정도 기다리십시오.
    참고: 이 연구에서 TPEF 및 FLIM 이미징은 GFP 및 나일 레드와 같은 형광단에 대해 광범위한 스펙트럼 범위와 충분한 전력을 제공하는 SC 소스를 사용하여 수행되었습니다. Ti:Sapphire 레이저는 SC에 의해 효율적으로 여기되지 않을 수 있는 950nm 미만의 2광자 흡수 피크를 가진 형광단에 대한 선택적 여기 소스로 시스템에 포함되어 있습니다.
  2. Ti:Sapphire 레이저의 모드 잠금 메커니즘을 활성화합니다. 내장 모니터 를 통해 안정적인 모드 잠금을 확인합니다.
  3. 프리즘 압축기를 사용하여 샘플에서 최적의 시간적 압축을 위해 Ti:Sapphire 펄스를 미리 처프합니다. 3.8단계에서 설명한 것과 유사한 구성으로 프리즘을 배열하고 두 번째 프리즘의 삽입 길이를 조정하여 펄스 지속 시간을 미세 조정합니다.
    참고: 적절한 시간적 압축은 샘플 평면에서 피크 강도와 효율적인 2광자 여기를 보장합니다.
  4. (선택 사항) 레이저가 별도의 광학 테이블에 있는 경우 Ti:Sapphire 빔을 편광 유지 단일 모드 광섬유에 결합합니다. 입력 커플링 광학 장치를 조정하고 광섬유 출력을 모니터링하여 커플링 손실을 최소화합니다.
  5. 이색성 거울을 사용하여 Ti:Sapphire 빔을 초연속체(SC) 및 프로브 빔과 결합합니다( 그림 3에 표시된 PBS의 결합 지점 참조). 이색성 및 현미경 쪽으로 공전파에서 공간적 중첩을 보장하기 위해 빔을 조심스럽게 정렬합니다.
  6. 결합된 빔을 현미경으로 안내하고 공간적 겹침을 미세 조정합니다. 형광 샘플(예: 1μm 형광 폴리스티렌 비드가 있는 슬라이드)을 사용하여 BCARS 여기 경로에 대한 Ti:Sapphire 빔의 정렬을 확인합니다. Ti:Sapphire 정렬 미러를 조정하여 형광 방출이 동일한 이미징 필드 내에서 BCARS 초점과 함께 국소화되도록 합니다. 공간 오프셋이 1픽셀 미만이어야 하는 동시에 획득된 BCARS와 TPEF 이미지 간의 겹침을 시각화하여 공동 국소화를 확인합니다.
    참고: 형광과 BCARS 신호 간의 공간적 중첩을 달성하는 것은 다중 모드 이미지 등록에 필수적입니다.
  7. 현미경 입력 앞에 이색성 거울을 삽입하여 검출 경로를 향해 후방 산란 형광을 반사합니다. 적절한 차단 파장을 가진 이색성을 선택하여 여기 빔에서 형광을 효율적으로 분리합니다.
  8. 방출 경로의 다운스트림에 두 번째 이색성 미러를 삽입하여 형광 신호를 두 개의 검출 분기로 분할합니다.
    1. 550nm≥ 파장을 FLIM 검출기로 전송합니다.
    2. 아날로그 TPEF(Two-photon excited fluorescence) 검출을 위해 PMT(Photomultiplier Tube)를 향해 550nm≤ 파장을 반사합니다.
      알림: 각 감지 분기에 대역 통과 필터를 설치하여 잔류 여기광을 차단하고 특정 방출 대역을 분리합니다.
  9. PMT 출력을 프리앰프에 연결하고 증폭된 아날로그 신호를 데이터 수집(DAQ) 디바이스에 공급합니다. FPGA(Field Programmable Gate Array)의 글로벌 동기화 트리거를 DAQ와 공유하여 이미징 모달리티 전반에 걸쳐 시간적 정렬을 보장합니다(그림 7).
  10. FLIM 검출기 출력을 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 모듈에 연결합니다.
    1. FLIM 감지기 신호를 TCSPC 모듈의 시작 입력에 연결합니다.
    2. Ti:Sapphire 레이저(또는 BCARS SC)의 동기화 출력을 TCSPC 모듈의 기준 입력에 연결합니다.
    3. 글로벌 카메라 트리거(FPGA에서 생성)를 TCSPC 모듈의 프레임 동기화 입력에 연결하여 라인 스캔 이미지 획득과 동기화합니다.

5. BCARS 감지 경로 설정

참고: 이 프로토콜은 라인 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징을 위한 디스캔된 감지 경로 설정을 설명합니다. 1D 갈보 미러는 충분한 신호 통합을 위해 픽셀당 2-4ms의 체류 시간으로 y축을 따라 여기 빔을 스캔합니다. 각 라인 스캔 후 샘플 단계는 x축을 따라 한 단계 전진합니다. 동기화된 2차 갈보 미러를 사용한 디스캔은 고속 빔 스캐닝 중에 카메라에서 스펙트럼 신호의 일관된 공간 등록을 유지하고 인접한 픽셀 간의 신호 누화를 제거하고 공간-스펙트럼 충실도를 보존하는 데 필수적입니다39.

  1. 초연속체(SC) 및 프로브 빔을 1차원(1D) 갈보 스캐너에 도입합니다( 그림 4 및 참조39의 자세한 내용). 갈보 미러 공합체를 초점 대물렌즈의 후면 조리개에 배치하여 시야를 가로질러 정확한 빔 스캐닝을 가능하게 합니다.
  2. 반사 빔 확장기( 그림 4 참조)를 사용하여 각 빔을 확장하여 여기 대물렌즈의 후면 조리개와 일치시킵니다. 이것은 샘플 평면에서 최적의 초점 및 최대 공간 해상도를 보장합니다.
    알림: 반사 광학을 사용하여 색수차를 최소화하고 SC 빔의 광대역 스펙트럼 내용을 유지하십시오.
  3. 여기 대물렌즈의 후면 조리개 평면에 정렬 대상을 배치합니다. SC 및 프로브 빔이 모두 타겟의 중심을 통과하도록 조정하여 광축을 따라 공동 정렬을 보장합니다.
    참고: 정확한 공간 중첩은 BCARS 신호 강도를 최대화하고 초점에서 최대 공간 해상도를 보장합니다.
  4. 도립 현미경에 장착된 높은 NA 여기 대물렌즈(예: 1.2NA, 60x 수침 대물렌즈)를 사용하여 빔을 샘플에 집중시킵니다.
  5. 밀봉된 현미경 슬라이드를 만들기 위해 두 개의 커버슬립 사이에 물 한 방울을 끼워 정렬 샘플을 준비합니다. 준비된 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 초점을 조정하여 샘플을 볼 수 있도록 합니다.
  6. 여기 경로 반대편에 배치된 수집 대물렌즈를 사용하여 전송에서 생성된 안티 스토크스 신호를 수집합니다.
  7. 4f 디스캐닝 시스템( 그림 4 참조)을 구현하여 검출기의 고정 행에 대한 안티 스톡스 신호의 공간 매핑을 보존합니다.
    1. 4f 광학 시스템을 사용하여 수집 대물렌즈의 후면 초점면(BFP)을 디스캐닝 갈보 미러의 축에 전달합니다. 이것은 다음과 같이 배열된 두 개의 정밀 튜브 렌즈( 재료 표 참조)로 구성됩니다.
      1. 첫 번째 렌즈는 수집 대물렌즈의 BFP 이후 한 초점 거리(200mm)에 배치됩니다.
      2. 두 번째 렌즈는 갈보 미러 앞에 한 초점 거리에 배치됩니다.
    2. FPGA 제어 파형 생성기를 사용하여 디스캐닝 갈보를 스캐닝 갈보와 동기화합니다.
    3. 7비트 디지털 전위차계를 FPGA 제어 시스템에 통합하여 디스캐닝 갈보 진폭을 조정할 수 있습니다.
      알림: 디스캐닝 갈보 미러는 1차 스캐닝 갈보에 의해 도입된 각도 편향을 보상합니다. 각도를 동적으로 조정하여 빔 이동을 상쇄하여 안티 스토크스 신호가 분광계로 이어지는 광축을 따라 정렬된 상태로 유지되도록 합니다. 이러한 안정화는 검출기의 공간 등록을 유지하고 스캐닝 중 스펙트럼 이미지의 측면 변위를 방지하는 데 필수적입니다.
  8. 갈보 스캐닝과 카메라 트리거링을 동기화하도록 FPGA 시스템( 재료 표 참조)을 구성합니다.
    1. 스캐닝 및 디스캐닝 갈보를 위한 아날로그 출력을 생성합니다.
    2. 입력 스테이지 트리거를 수락하여 각 라인 스캔의 시작을 표시합니다.
    3. 각 스캔 위치에서 과학적 상보형 금속 산화물 반도체(sCMOS) 카메라로 프레임 캡처 트리거 신호를 출력합니다.
    4. 다양한 수집 목표를 수용하기 위해 디스캐닝 진폭을 독립적으로 제어합니다.
      참고: 일반적인 FPGA 펄스 트레인에는 스캐닝 갈보 구동 신호, 디스캐닝 갈보 구동 신호, 스테이지 트리거 입력 및 동기화된 프레임 타이밍을 위한 픽셀 클럭이 포함됩니다.
  9. 시준된 안티 스토크스 신호를 두 개의 단거리 통과 필터에 통과시켜 잔류 펌프와 SC 여기 광을 차단합니다.
  10. 필터링된 안티 스토크스 신호를 분광기 입구 슬릿을 통해 sCMOS 검출기에 초점을 맞춥니다. 스캐닝 및 디스캐닝 갈보의 각도를 모두 조정하여 빔이 슬릿의 장축과 평행하게 스캔되도록 하고 광학 이미지 평면을 슬릿과 정렬합니다. 이 정확한 정렬은 스펙트럼 해상도를 최대화하고 검출기 행에서 측면 신호 크로스 토크를 최소화합니다.
  11. 카메라 행을 따라 안티 스토크스 스펙트럼을 수직으로 분산시키도록 분광계를 구성합니다. 최적의 스펙트럼 범위를 위해 적절한 격자(예: 300라인/mm, 700nm에서 블레이즈)를 선택하십시오.

6. 신호 최적화 및 스펙트럼 분해능 보정

  1. 자체 제작된 획득 소프트웨어를 실행하고 sCMOS 카메라에서 실시간 신호 모니터링을 시작합니다. 수집 소프트웨어는 Hamamatsu DCAM-API 및 Measurement Computing Universal Library 드라이버를 포함한 종속성이 있는 Python 3.8+(Windows 10)로 홈빌드되어 HDF5 형식으로 데이터를 출력합니다. 소프트웨어는 해당 저자의 합당한 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
  2. 밀봉된 슬라이드를 형성하기 위해 두 개의 커버슬립 사이에 벤조니트릴 한 방울을 놓아 스펙트럼 보정 샘플을 준비합니다. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 여기 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다.
  3. sCMOS 카메라에서 BCARS 신호를 찾습니다. 수집 대물렌즈의 z-위치를 조정하여 안티 스토크스 신호 강도를 최대화합니다.
  4. 수집 대물렌즈의 측면 위치를 조정하여 안티 스토크스 빛이 분광계의 입구 슬릿을 통해 올바르게 초점을 맞춥니다. 이 정렬은 분광계에 대한 최적의 결합과 향상된 스펙트럼 충실도를 보장합니다.
  5. 샘플 평면에서 초연속체(SC)와 프로브 빔 사이의 공간 겹침을 최적화합니다. 프로브 빔 경로에서 거울을 사용하여 측면 위치와 입사각을 미세하게 조정합니다.
  6. 프로브 빔 경로의 광학 지연선을 변환하여 SC 펄스와 시간적으로 겹치도록 합니다. 신호 강도를 모니터링하고 안티 스톡스 신호가 최대화될 때까지 조정하여 적절한 시간 동기화를 확인합니다.
  7. sCMOS 이미지에서 벤조니트릴(예: 1002cm-1)에서 강력하고 날카로운 라만 피크를 식별합니다.
  8. 카메라에서 프로브 파장과 해당 픽셀 위치를 기록합니다. Rayleigh 라인(프로브 파장에서 0 cm-1 )과 1002 cm-1 및 3073 cm-1 에서 알려진 벤조니트릴 라만 피크를 사용하여 sCMOS 검출기 전반에 걸쳐 선형 픽셀-파수 매핑을 설정합니다. Rayleigh 라인은 제로 파수 기준을 제공하는 반면 벤조니트릴 피크는 픽셀당 파수 증분을 결정합니다.
    참고: 분석에는 상대 파수 정보(픽셀 위치와 라만 이동 간의 매핑)만 필요하므로 방출 램프를 사용한 절대 파장 보정이 필요하지 않습니다.
  9. 픽셀-파수 매핑을 획득 소프트웨어에 입력합니다. 이 교정은 광학 경로, 분광계의 격자 설정 또는 정렬을 변경하지 않는 한 유효한 상태로 유지되어야 합니다.

7. 신호 획득

  1. 1.1 내지 1.6단계에서 준비된 C. elegans 샘플을 현미경 스테이지에 로드합니다. 관심 영역을 찾아 여기 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다.
  2. 슬라이드에서 라만 활성 신호(물 배경 또는 베어 유리 커버슬립)가 없는 영역을 식별하여 비공진 배경(NRB) 참조 역할을 합니다.
  3. sCMOS 검출기에서 BCARS 신호를 찾습니다. 수집 대물렌즈의 z-위치를 미세 조정하여 안티 스토크스 신호 강도를 최대화합니다.
  4. 수집 대물렌즈의 측면 위치를 조정하여 안티 스토크스 조명이 분광계 입구 슬릿을 통해 적절하게 정렬되도록 합니다.
  5. FPGA를 사용하여 동기화된 스캐닝 및 디스캐닝 갈보 미러를 시작합니다. 1차 스캔의 각도 편향이 완전히 보상될 때까지 디지털 전위차계를 사용하여 디스캐닝 갈보의 진폭을 조정합니다. 안티 스톡스 신호는 전체 스캔 범위에서 카메라의 ~12행 이내로 제한되어야 합니다.
  6. 임시 획득 시퀀스 정의
    1. 프로브 펄스를 지연시켜 SC와 프로브 펄스 간의 상호 상관 신호를 수집합니다. 이를 얻으려면 통합 3색 BCARS 신호와 프로브 펄스의 시간 지연을 플로팅합니다. 가장 강한 신호는 SC 및 프로브 펄스가 시간적으로 겹치는 시간 0에 나타납니다.
      참고: FLIM 및 TPEF 감지 시스템은 BCARS와 동일한 트리거를 공유하므로 이 시점 동안 신호가 동시에 수집됩니다.
    2. BCARS의 경우 프로브 빔의 이후 지연(예: 1-2ps)과 비공진 배경에 대한 SC 빔의 이후 지연으로 기록합니다( 그림 6A의 NRB 스펙트럼). 협대역 펄스(프로브)에 시간 지연이 적용되면 3색 CARS 신호의 NRB를 효과적으로 억제할 수 있으므로 신호 대 잡음비를 향상시킬 수 있습니다67.
    3. SC와 프로브 사이에 시간적 중첩이 없는 어두운 이미지를 획득하여 기준선 검출기 노이즈(어두운 기준)를 캡처합니다.
    4. 메타데이터를 포함하여 모든 BCARS, NRB 및 어두운 이미지를 단일 h5 파일 내에 저장합니다.
  7. BCARS 신호 처리 프로토콜
    1. CRIkit2 소프트웨어68을 엽니다.
    2. 그림 6B와 같이 Open HDF 도구를 사용하여 필요한 모든 데이터 세트를 로드합니다: BCARS 하이퍼스펙트럼 데이터, NRB 참조 및 다크 참조 로드. 주파수 창 도구를 사용하여 BCARS 신호 생성 대역폭 내에서 주파수 영역을 선택합니다(여기에 시연된 BCARS 시스템의 경우 400cm-1에서 ≥ 3200cm-1까지).
    3. 전처리 단계를 수행합니다.
      1. Anscombe 도구(그림 6B 참조)를 사용하여 BCARS 및 NRB 데이터 세트를 분산 안정화합니다.
      2. 노이즈 제거 도구를 사용하여 SGD(Singular Value Decomposition) 수행: 육안 검사를 기반으로 주성분을 유지합니다. 샘플의 형태와 일치하는 공간 분포를 나타내는 구성 요소를 보존하고 구조화되지 않거나 반점과 같은 노이즈가 지배하는 구성 요소를 폐기합니다. 이 노이즈 제거 단계는 특히 저강도 스펙트럼 기능의 경우 신호 대 잡음비(SNR)를 개선합니다.
      3. 역 Anscombe 도구를 사용하여 데이터를 원래 도메인으로 복원하십시오.
        참고: 획득 시 실시간 처리를 수행하는 경우 이러한 단계를 건너뛸 수 있습니다.
    4. Kramers-Kronig(KK) 변환을 사용하여 라만 유사 스펙트럼을 검색합니다.
      1. KK 도구를 엽니다(그림 6B 참조).
      2. 적절한 스펙트럼 참조 정규화를 보장하기 위해 NRB에 대한 표준을 활성화합니다.
      3. NRB 바이어스, 패드 계수 및 에지 픽셀 평균화를 포함한 매개변수를 설정합니다.
      4. KK 변환을 실행하여 검색된 라만 스펙트럼을 얻습니다.
    5. 사후 KK 오류 수정 수행
      1. Savitzky-Golay 스무딩을 사용하여 위상 오류 수정: 위상 오류 수정 도구를 엽니다(그림 6B). 평활 창 크기와 다항식 순서를 조정합니다. 미리보기 패널을 사용하여 원본 스펙트럼과 보정된 스펙트럼을 검사합니다.
      2. 스케일 오류 수정: 스케일 오류 수정 도구를 엽니다(그림 6B). 스펙트럼을 정규화하여 데이터 세트 전체의 상대 강도 스케일링을 수정합니다. 공간 및 스펙트럼 차원에서 일관성을 보장합니다.
    6. 스펙트럼 축 보정(선택 사항, 잘못 정렬된 경우): 보정 도구를 엽니다(그림 6B). 측정된 파수를 알려진 기준 피크와 비교합니다. 수정된 기울기/절편을 적용하여 스펙트럼 축을 재정렬합니다.
    7. 관심 영역(ROI)에서 데이터 정의 및 추출
      1. ROI 측면 을 사용하십시오.또는 Pt Spect. 도구(그림 6B)를 사용하여 BCARS 이미지에서 관심 영역 또는 관심 지점을 표시합니다.
      2. 다양한 ROI의 스펙트럼 내용을 시각화하고 비교합니다.
      3. 추가 정량 또는 화학 측정 분석을 위해 검색된 스펙트럼을 내보냅니다.

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결과

그림 5는 BCARS 여기에 사용되는 협대역 프로브와 광대역 초연속체(SC) 펄스의 측정된 스펙트럼을 보여줍니다. 자체 제작된 광학 파라메트릭 발진기(OPO, 그림 3)에서 ~1530nm 신호의 2차 고조파 생성을 통해 생성된 프로브 펄스는 764.2nm에 중심을 두고 있으며 최대 전폭(FWHM)은 0.2nm이므로 결과 라만 스펙트럼에서 ~6.8cm-1의 스펙트럼 분해능을 제공합니다. 미리 처프된 펨토초 1030nm 레이저 펄스를 10cm PCF( 재료 표 참조)에 결합하여 생성된 SC 펄스는 약 950nm에서 1200nm(≥ 1800cm-1)에 걸쳐 있으며, 지문(펄스 내 3색 여기를 통해), 무음 영역(3색 및 2색 여기의 혼합), 전체 생물학적으로 관련된 라만 스펙트럼 영역(400에서 ≥ 3200cm-1)을 포괄합니다.

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토론

이 작업은 BCARS 및 2p-FLIM/TPEF 이미징 플랫폼의 아키텍처를 자세히 보여줍니다. 현재 설정에서는 이중 출력 1030nm 레이저가 사용되지만 대부분의 고출력 fs 1030nm 파이버 레이저는 BCARS 현미경을 구축하기 위한 마스터 레이저 소스로 사용할 수 있습니다. OPO/SHG PPLN 결정의 길이와 주기를 신중하게 선택하면 sub-ps OPO 1030nm 펌프로 몇 ps 프로브 펄스를 생성할 수 있습니다. 상대적으로 높은 레이저 반복률(100MHz) 또는 상대적으로 낮은 펄스 피크 전력이 여기에 입증되었지만 BCARS 신호는 내부 및 상호 자극(3색 및 2색 신호 생성)을 결합한 BCARS 신호 여기 방식을 사용하여 여전히 효과적으로 생성할 수 있습니다. 대표적인 결과에 표시된 in vivoC. elegans 이미지는 집에서 제작한 SC/프로브 BCARS 레이저 소스를 사용하여 바이오 이미징을 수행할 수 있는 타당성을 추가로 확인했습니...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없으며 경쟁하는 금전적 이해관계도 없습니다.

감사의 글

W-WC는 NIH(R21AG086974)의 지원을 인정합니다. MTC는 미국 에너지부(DOE BERDE-SC0022121)의 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
사진기하마마쓰ORCA-퓨전sCMOS, 2304× 2304 픽셀
수집 목적  올림푸스  LUMPLFLN60XW  침수, 1.0 NA
DAQ  부지런한  MCC USB-1208HS  데이터 수집 카드
지연선  뉴포트  DL225  프로브 펄스에 대한 기계적 지연
이색성  셈록  FF925-DI01  프로브와 SC의 결합
이색성  셈록  FF705-DI01  에피 모드 형광 검출
이색성  토랩스  DMLP550R  FLIM 신호와 TPEF 신호 분리
여기 목표  올림푸스  UPLSAPO60XWIR  침수, 1.2 NA
필터  셈록  FF01-1326/SP-25  SHG 후 기본 레이저 거부
필터  셈록  FF01-758/SP  BCARS 카메라 전에 기본 레이저 거부
필터  토랩스  FESH0650  형광 모드 전에 기본 레이저 거부
플림 PMT  피코퀀트  PMA 하이브리드  FLIM 단일 광자 검출기
FPGA  레드피타야  스테모랩 125-14  스캔 동기화 및 트리거링
갈보  토랩스  GVS101 시리즈  스캔 및 스캔 해제용
격자  간섭성의  라이트스미스 1040nm  1000 그로브/mm, SC용 프리처프
반파 플레이트  토랩스  AHWP05M-980  편광 제어
K-큐브  토랩스  국경101 자동 정렬 장치용 PSD 드라이버
레이저  유망한 악기  FSX-듀얼  이중 출력 펨토초 레이저
레이저  간섭성의  미라-900  형광 여기를 위한 펨토초 레이저
PBS  토랩스  PBS255  SC 및 프로브를 위한 빔 조합
PCF  토랩스  LMA-PM-5  SC 생성을 위한 10cm 광자 결정 섬유
PD  토랩스  PDA100A2  OPO 피드백 루프
피에조 미러 마운트  토랩스  폴라리스-K1S2P  자동 정렬 장치용 압전 조절기
프리앰프  에드먼드옵틱스  59-179  TPEF 프리앰프
프리즘  Lambda Research 광학  EQP-30SF10 시리즈  SC 압축
PSD  토랩스  PDQ80A  자동 정렬기용 위치 감지기
분광기  Teledyne 프린스턴 악기  아이소플레인 160  300g/mm 격자, 700nm 중심
무대  아시아  MS-2000 시리즈  전동식 3축 스테이지
TCSPC  피코퀀트  멀티하프 150  FLIM용 광자 계수 장치
TPEF PMT  하마마쓰  H9305-03  TPEF 검출기
튜브 렌즈  토랩스  TL200-2P2 시리즈  디스캐닝 시스템에 사용

참고문헌

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