마우스 난모세포 감수분열(mouse oocyte moiosis) 동안 염색체 분리의 살아있는 세포 이미징

요약

여기에서는 염색질에 H2B-RFP를, 방추 시각화에 SiR-Tubulin을 사용하여 마우스 난모세포의 염색체 분리를 연구하기 위한 살아있는 세포 이미징 기술을 요약합니다. 우리는 샘플 준비, 미세 주입, 배양, 이미징 설정 및 분석을 자세히 설명하며 감수 분열 염색체 역학의 고해상도 및 최소한의 광독성 이미징을 달성하기 위한 실용적인 가이드를 제공합니다.

초록

난자 감수 분열 중 정확한 염색체 분리는 적절한 배아 발달을 보장하고 이수성 관련 장애를 예방하는 데 필수적입니다. 형광 표지 기술과 결합된 살아있는 세포 이미징은 높은 시공간 해상도로 감수 분열 염색체 역학을 연구하기 위한 강력한 접근 방식이 되었습니다. 이 프로토콜에서는 염색질 표지를 위한 히스톤 H2B-RFP와 방추 추적을 위한 SiR-튜불린의 사용에 초점을 맞춰 살아있는 마우스 난모세포에서 염색체 분리를 시각화하기 위한 주요 방법론을 요약합니다. 우리는 광독성을 최소화하면서 고해상도 이미징을 달성하도록 최적화된 샘플 준비, mRNA 미세 주입, 난자 배양, 생세포 이미징 챔버 설정 및 공초점 현미경 설정 절차를 설명합니다. 또한 광독성, 이미지 처리 및 감수 분열 사건의 정량적 분석과 같은 중요한 실험 고려 사항을 강조합니다. 현재 방법론에 대한 포괄적인 평가를 제공함으로써 이 프로토콜은 살아있는 난모세포의 염색체 역학을 조사하고 감수 분열 연구의 정확성과 재현성을 향상시키려는 연구자를 위한 실용적인 가이드 역할을 합니다.

서론

난자 감수 분열 동안 염색체 및 방추 역학의 정확한 시각화는 여성 배우자 성숙 및 이수성 위험을 지배하는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다 1,2,3,4,5. 포유류 난모세포는 배아 소포 파괴(GVBD), 염색체 응축, 방추 조립 및 비대칭 분열을 포함하여 고도로 조정된 일련의 감수 분열 사건을 겪습니다⁶. 고정 시점 이미징은 이러한 프로세스의 귀중한 스냅샷을 제공했지만 시간적 해상도가 부족하고 샘플링 간격 사이에 발생하는 일시적이거나 빠른 이벤트를 캡처할 수 없습니다. 대조적으로, 형광 표지된 염색체 및 미세소관의 살아있는 세포 이미징은 이러한 동적 과정을 실시간으로 모니터링하는 강력한 접근 방식을 제공합니다^2,3,7. 이를 통해 개별 난모세포 내에서 감수 분열 사건의 시기, 기간 및 순서를 직접 관찰할 수 있으며 고정된 샘플에서 놓칠 수 있는 일시적인 사건을 식별할 수 있습니다. 그러나 미세 주입 및 이미징 중에 난모세포 생존력과 생리학적 완전성을 유지하려면 세심한 취급과 최적화된 조건이 필요합니다⁸.

이 프로토콜은 H2B-RFP cRNA로 마우스 배아 소포(GV) 단계 난모세포를 미세 주입하여 염색질의 형광 표지를 가능하게 한 다음 감수 분열 전반에 걸쳐 염색체 및 방추 거동을 타임랩스 공초점 이미징하기 위한 포괄적인 워크플로를 설명합니다⁴. 이 방법은 호르몬 프라이밍, 난모세포 분리, 제어된 온도 조건에서의 미세 주입, 환경 제어와 함께 공초점 현미경을 사용한 라이브 이미징을 포함한 주요 단계를 통합합니다 ^4,9. 이 논문의 전반적인 목표는 살아있는 마우스 난모세포에서 염색체 및 방추 역학의 실시간 시각화를 위한 강력하고 재현 가능한 워크플로를 제시하여 감수 분열 조절 및 이수성 위험의 기초가 되는 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위한 플랫폼을 제공하는 것입니다.

이 프로토콜은 높은 시간적 및 공간적 해상도를 제공하지만, 내인성 단백질 역학을 완전히 복제하지 못할 수 있고 과발현될 경우 잠재적으로 천연 減수분열 과정을 방해할 수 있는 외인성 리포터 발현에 의존합니다. 연구자는 이러한 한계를 고려하고 가능한 경우 보완적인 접근 방식을 사용하여 결과를 검증해야 합니다.

이 프로토콜은 감수 분열 메커니즘, 염색체 분리 오류, 유전적 또는 환경적 교란이 난모세포 질에 미치는 영향을 조사하는 연구를 지원하도록 설계되었습니다. 생식 생물학의 기초 연구와 중개 응용을 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

모든 실험은 지역 동물 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다. 실험 절차는 3R 원칙인 교체, 감소 및 개선을 엄격히 준수해야 합니다. 생쥐는 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 표준화된 환경 조건(22°C, 습도 60%)에서 공인된 동물 시설에 사육되어야 합니다.

1. 난자 채취 및 준비

참고: 모든 장비와 시약은 멸균되어야 합니다. 입체 현미경 아래에서 구강 피펫을 사용하여 모든 난모세포 처리를 수행합니다( 재료 표 참조). 모든 배양 배지 방울을 미네랄 오일로 덮습니다(그림 1A-E).

1. 호르몬 자극
   1. 난자 수집 46-48시간 전에 3-4주 된 암컷 마우스에게 임신한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG; 재료 표 참조)의 5 국제 단위(IU)를 복강 내 주사합니다.
      참고: B6CBAF1 마우스(C57BL/6J × CBA/CaCrl의 F1 자손)는 우수한 난자 생산량과 유리한 성숙 특성으로 인해 선호됩니다.
2. 배양 배지 준비
   1. 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 M2 및 M16 배지를 필터링합니다( 재료 표 참조). 100mM 스톡에서 희석하여 IBMX를 최종 농도 100μM로 보충합니다.
   2. 35mm 플라스틱 조직 배양 접시에 M2-IBMX 5-6 방울(각각 ~30 μL)과 M16-IBMX 3 방울을 준비합니다. 모든 물방울에 미네랄 오일을 겹쳐 놓습니다. 난모세포 분리 전에 M2-IBMX 접시를 37°C 핫 블록(그림 1A)에 놓고 M16-IBMX 접시를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 최소 30분 동안 놓습니다(그림 1C).
   3. 난소 절제를 위해 800-1,000μL의 M2-IBMX(오일 없음)가 들어 있는 추가 접시를 준비합니다. 입체 현미경 위에 장착된 37°C 가열판에 놓습니다(그림 1B).
3. 난모세포 분리
   1. 자궁경부 탈구로 생쥐를 희생하십시오. 70% 에탄올로 하복부를 닦은 후 피부와 복막을 수평으로 작은 절개하여 복강으로 들어갑니다. 손가락으로 절개 부위의 가장자리를 당겨 절개 부위를 확장합니다.
   2. 집게를 사용하여 장을 쓸어내어 신장의 상극에 위치한 상복부의 난소를 노출시킵니다. 가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 조직 손상을 피하면서 난소를 조심스럽게 절제합니다. 즉시 난소를 100-200μL의 예열된 M2-IBMX 배지가 들어 있는 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   3. 난소를 예열된 M2-IBMX 배지 1mL로 옮기고 가열된 해부 현미경 단계로 이동합니다(그림 1B). 지방 조직과 난관 잔여물을 조심스럽게 제거하십시오.
      알림: 난포나 난모세포의 손상을 방지하기 위해 난소를 부드럽게 다루십시오. 동물실에서 실험실로 옮기는 동안 따뜻한 매체에 난소를 유지하십시오.
   4. 27G 바늘을 사용하여 난포에 구멍을 뚫어 난구-난모세포 복합체(COC)를 방출합니다(그림 1A-B). COC를 수집하고 M2-IBMX의 25-30μL 액적으로 옮깁니다(그림 1D).
   5. 협구경 유리 파스퇴르 피펫으로 반복적으로 피펫팅하여 난구 세포를 해리합니다(그림 1E).
      알림: 구강 피펫팅은 일반적으로 난자 처리에 사용되지만 기계식 피펫터 또는 마이크로 매니퓰레이터는 특히 구강 피펫팅이 제한되거나 실현 불가능한 환경에서 대안을 제공합니다. 이러한 대안은 유사한 프로토콜^10,11에서 성공적으로 사용되었습니다.
   6. 20x-40x 배율의 실체 현미경을 사용하여 더 큰 직경과 중앙에 위치한 GV를 기반으로 완전히 성장한 GV 단계 난모세포를 식별하고 선택합니다. 빛으로부터 보호된 37°C 핫 블록에서 신선한 30μL의 M2-IBMX 액적으로 옮깁니다.
      참고: 생리적 무결성을 보존하기 위해 모든 절차에서 난모세포를 37°C로 유지하십시오. 모든 매체를 미리 예열하고 모든 현미경 기반 취급 및 미세 주입에 온도 제어 스테이지를 사용합니다.
   7. 미세 주입 전에 37°C 가열 단계에서 난모세포가 20분 동안 회복되도록 합니다.

2. H2B-RFP cRNA 준비

알림: 깨끗하고 RNase가 없는 환경에서 장갑을 끼고 모든 단계를 수행하십시오. RNase가 없는 물과 시약만 사용하고 바람직하게는 RNase 억제제가 있는 상태에서 작동합니다.

1. 인서트 옆에 있는 프라이머를 사용하여 Sanger 시퀀싱에 의해 H2B-RFP 플라스미드( 재료 표 참조)를 염기서열 분석합니다. 유능한 대장 균(예: DH5α)을 형질전환하고, 단일 콜로니를 선택하고, 적절한 항생제와 함께 LB 국물에서 성장시켜 플라스미드를 증폭합니다. 표준 midi 또는 maxi 준비 키트를 사용하여 플라스미드를 정제합니다. 자세한 절차는 Green 및 Sambrook¹²를 참조하십시오.
2. 제조업체의 지침에 따라 상용 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제합니다. 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 정량화합니다.
3. 벡터 백본에서 한 번 절단하는 적절한 제한 효소를 사용하여 삽입물의 다운스트림에서 2-4μg의 플라스미드 DNA를 선형화합니다(NotI는 H2B-RFP에 사용됨). 표 1 에 설명된 대로 적절한 완충액 및 효소 농도를 사용하여 분해 반응을 설정하고 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다. 아가로스 겔 전기영동으로 완전한 선형화를 확인합니다. 여러 밴드는 불완전한 소화를 나타냅니다. 상용 키트를 사용하는 경우 제조업체의 지침을 따르십시오.
   참고: 인서트의 하류와 최적의 분해 조건에서 정확하게 절단하는 제한 효소를 선택하십시오. 아가로스 겔에 작은 분취량을 실행하여 선형화를 확인합니다.
4. 분해 반응을 1 μL의 Proteinase K(10 μg/mL), 5.3 μL의 10% SDS 및 50 μL의 뉴클레아제가 없는 물과 함께 50°C에서 1시간 동안 배양하여 RNase 오염을 제거합니다.
   참고: 이 단계는 RNase 및 단백질 오염 물질을 제거하는 데 필수적입니다. RNase가 없는 시약만 사용하고 깨끗한 작업 조건을 유지하십시오.
5. 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1)으로 소화된 DNA를 추출한 후 클로로포름 추출합니다.
   참고: 독성을 최소화하고 시료 처리를 간소화하기 위해 페놀/클로로포름 추출 대신 상업용 컬럼 또는 비드 기반 정제 방법(예: 실리카 멤브레인 또는 마그네틱 비드 시스템)을 사용할 수도 있습니다.
6. 3M 아세테이트나트륨과 100% 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킵니다. -80°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
7. 4°C에서 10분 동안 12,000-14,000 x g 에서 원심분리하여 DNA를 펠릿화합니다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 4°C에서 5분 동안 동일한 속도로 다시 원심분리한 다음 잠시 자연 건조(2-5분)한 다음 RNase가 없는 물 6μL에 재현탁합니다.
   알림: 에탄올 침전 및 원심분리 후 튜브 바닥에 눈에 보이는 반투명 또는 흰색 펠릿이 형성되어야 합니다. 펠릿이 보이지 않으면 더 빠른 속도로 원심분리를 반복하거나 DNA 농도를 재평가하십시오.
8. 제조업체의 프로토콜에 따라 T7 mMESSAGE mMACHINE 키트(표 2 참조)를 사용하여 시험관 내 전사를 수행합니다.
9. 전사 반응을 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 전사체 길이가 5kb를 초과하는 경우 배양을 연장합니다.
10. 10μL 반응 부피당 1U의 DNase I을 사용하여 DNase 처리에 의해 주형 DNA를 제거하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
11. 염화리튬 침전을 이용하여 합성된 cRNA를 정제한다¹³. 침전 및 원심분리 후 튜브 바닥에 눈에 보이는 반투명 또는 흰색 펠릿이 형성되어야 합니다. RNA 펠릿을 70% 에탄올로 세척합니다.
12. 최종 cRNA 펠릿을 RNase가 없는 물 20μL에 재현탁합니다. RNA 농도를 측정하고 RT-PCR을 수행한 후 PCR 산물의 시퀀싱을 수행하여 폴리(A) 꼬리의 존재와 길이를 확인합니다. cRNA를 1μL 부피로 분취하고 -80°C에서 보관합니다.

3. 난모세포의 준비 및 미세주입

참고: 절차 전반에 걸쳐 난모세포의 품질을 보존하기 위해 예열된 배지와 온도 제어 현미경 단계를 사용하여 난모세포를 37°C로 유지하십시오.

1. 준비
   1. H2B-RFP cRNA 분취량을 얼음 위에서 해동하고 잠시 원심분리한 다음 원하는 농도(예: 250ng/μL)로 희석합니다.
      참고: 최적의 cRNA 농도는 구축물, 발현 시스템 및 실험 목표에 따라 달라질 수 있습니다. 충분한 신호를 보장하면서 과발현 아티팩트를 최소화하기 위해 cRNA 농도(예: 50-300ng/μL 범위 내)를 적정하는 것이 좋습니다. 사용자는 또한 구조 발현 후 난모세포 건강 및 생존력의 기능적 판독값으로 감수 분열 진행(예: GVBD, 방추 형성 및 극체 압출)을 모니터링해야 합니다. cRNA의 주입 농도는 일반적으로 0.2 내지 1 μg/μL 범위이며, 최적의 결과는 종종 0.5 μg/μL 2,3,4,5,7,8,9에서 달성되는 것으로 보고되었습니다.
   2. 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관(OD = 1.5mm, ID = 0.86mm, 길이 = 100mm)에서 미세 주입 바늘을 준비합니다(그림 2A).
      알림: 우리는 수직 피펫 풀러를 사용합니다( 재료 표 참조; 그림 2A). 경험적으로 풀링 매개변수를 최적화합니다. 바늘 끝은 난모세포 손상을 최소화할 수 있을 만큼 가늘어야 하지만 막힘을 방지하고 원활한 cRNA 전달을 허용할 수 있을 만큼 충분히 넓어야 합니다.
   3. RNase가 없는 마이크로로더 팁을 사용하여 0.5-1.5μL의 cRNA 용액을 바늘 끝에 로드합니다. 주입하기 전에 기포를 제거하십시오.
2. 미세 주입 접시 설정
   1. 100μL의 M2-IBMX 배지로 미세 주입 접시를 준비하고 증발 및 삼투압 이동을 방지하기 위해 미네랄 오일로 완전히 오버레이합니다.
3. 난자 미세 주입
   1. 홀딩 및 주입 피펫을 마이크로 매니퓰레이터 시스템에 장착합니다(그림 2B,C).
   2. 현미경 스테이지에 현미주입 접시를 놓습니다. 구강 피펫을 사용하여 난모세포를 M2-IBMX 액적으로 옮깁니다.
   3. 홀딩 피펫과 주입 피펫을 난모세포와 동일한 수평면으로 가져옵니다.
   4. 홀딩 피펫으로 부드럽게 흡입하여 하나의 난모세포를 캡처합니다(그림 2B 및 C).
   5. 투명대와 oolemma를 통해 주사 바늘을 삽입하여 세포질을 표적으로 삼고 핵을 피합니다.
   6. 세포내 전위계를 통해 음의 정전 용량의 짧은 펄스를 사용하여 H2B-RFP cRNA를 전달합니다(그림 2B-E). 주입량은 난자 부피의 약 5%로 유지합니다. 성공적인 주사는 일반적으로 작지만 뚜렷한 세포질 분산으로 나타납니다. 멤브레인 손상을 방지하기 위해 주입 압력과 주입 시기를 조정하십시오.
   7. 멤브레인 찢어짐을 최소화하기 위해 같은 각도로 바늘을 빠르고 부드럽게 빼십시오.
   8. 홀딩 피펫에서 난모세포를 풀고 접시의 별도 영역으로 재배치하여 주입된 난모세포와 주입되지 않은 난모세포를 구별합니다(그림 2F). 이 설정에서는 주입되지 않은 난모세포를 접시 상단에 유지하고 주입된 난모세포를 하단으로 이동하여 워크플로를 구성합니다.
   9. 나머지 모든 난모세포에 대해 3.3.4-3.3.8단계를 반복합니다. 주사 후 생존율은 기술 및 mRNA 특성에 따라 다릅니다. 60%-80%의 생존 가능성을 기대하십시오.
4. 사후 처리
   1. 주입된 난모세포를 깨끗한 배양 접시에서 M16-IBMX 배지의 신선한 물방울로 옮깁니다.
   2. H2B-RFP 발현을 허용하기 위해 37°C에서 1-4시간 동안 배양합니다. cRNA 농도, 전사체 크기 및 발현 효율에 따라 배양 기간을 조정합니다.

4. 감수 분열 중 H2B-RFP 표지 염색체의 타임랩스 이미징

1. 장비 및 매체 준비
   1. 사용하기 전에 공초점 현미경 스테이지 인큐베이터와 환경 챔버를 37°C에서 ≥ 30분 동안 예열합니다(그림 3A). 가스 컨트롤러를 켜고 가스 흐름을 시작하여 챔버를 5% CO₂ 및 주변 O₂로 유지합니다. 확장된 살아있는 세포 이미징 중에 난모세포 건강을 지원하기 위해 챔버가 가습되었는지 확인하십시오.
   2. 배양 방울 준비: SiR-Tubulin(최종 농도 100nM 최종 농도)이 보충된 M16 배지 50-6방울을 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 미네랄 오일로 오버레이하십시오. 별도의 유리 바닥 이미징 접시에 M16 + SiR-Tubulin의 5μL 방울 3개를 넣고 미네랄 오일을 오버레이합니다. 사용하기 전에 두 접시 모두 37°C에서 ≥ 30분 동안 예열하십시오.
2. 난자 이식 및 세척
   1. 난모세포 세척: 주입된 난모세포를 50μL M16 + SiR-Tubulin 방울을 통해 순차적으로 옮겨 잔류 IBMX를 씻어냅니다(5회 세척 권장). 난자 손상을 방지하기 위해 부드럽게 세척하십시오.
      참고: 잔류 IBMX는 감수 분열 재개를 억제할 수 있으므로 철저한 세척이 중요합니다.
   2. 최종 전달: 세척 후, 15-20개의 난모세포를 예열된 유리 바닥 이미징 접시에 있는 M16 + SiR-Tubulin의 5μL 방울로 옮깁니다.
3. 현미경 설정
   1. 이미징 접시 장착: 유리 바닥 접시를 공초점 현미경 스테이지에 놓습니다(그림 3A). 난모세포가 ~10분 동안 가라앉도록 합니다.
   2. 스테이지 위치 지정: 명시야 이미징을 사용하여 난모세포를 시야의 중앙에 배치합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 위치를 저장합니다.
      참고: 이 연구에서는 HC PL APO 20x/1.0 NA 수침 대물렌즈와 함께 라이카 TCS SP8 공초점 현미경을 사용했습니다. 그러나 가용성에 따라 유사한 사양의 다른 공초점 시스템 및 대물 렌즈를 사용할 수 있습니다.
   3. 침수 대물렌즈를 위한 워터 펌프 설정: 침수 대물렌즈를 사용하는 경우 워터 펌프 시스템을 작동하여 5-10분 간격으로 간헐적으로 물을 공급합니다. 이러한 주기적인 흐름은 렌즈와 유리 바닥 이미징 접시 사이의 수주를 유지하여 건조를 방지하고 장기간 실험 중에 안정적인 이미징 조건을 보장합니다. 오일 침지 렌즈의 경우 이 물 흐름 설정이 필요하지 않습니다.
4. 이미징 설정
   1. 레이저 스캔 모드로 전환합니다. 다음과 같이 레이저 강도를 설정합니다: H2B-RFP(염색체)의 경우 0.5%(대물렌즈에서 ~100μW)에서 561nm; SiR-Tubulin(스핀들 미세소관; 그림 3B,E).
      알림: 적절한 레이저 안전 지침을 따르십시오. 레이저 노출을 최소화하여 시료 생존 가능성을 보호합니다.
5. Z-스택 획득
   1. 2-4μm 스텝 크기로 30-50μm에 이르는 Z-스택을 획득합니다(그림 3B,C).
   2. 600Hz의 스캔 속도를 사용하여 5-10분 간격으로 이미지를 캡처합니다(그림 3B,D). 총 이미징 기간은 모니터링되는 감수 분열 단계에 따라 12-16시간에 걸쳐 있을 수 있으며 확장된 시험관 내 배양에 대한 광독성 및 난모세포 내성에 의해 제한됩니다.
6. 순차 이미지 획득
   1. 현미경 시스템에서 두 개의 HyD 검출기로 순차 스캐닝을 수행합니다. H2B-RFP: 561nm에서 여기; 580-630nm에서 수집된 방출; 633nm에서 SiR-튜불린 여기; 650-700nm에서 수집된 방출(그림 3E).
7. 타임랩스 이미징 시작
   1. 장기 타임랩스 획득을 시작하기 전에 테스트 이미지를 촬영하여 신호 품질을 확인하십시오. 형광 신호는 고르게 분포되어야 합니다: H2B-RFP는 염색질을 뚜렷하게 표지해야 하며 SiR-튜불린은 과도한 배경 없이 미세소관 구조를 강조해야 합니다. 짧은 예비 이미징 실행에서 자동 초점 안정성과 최소한의 광표백을 확인합니다.
   2. 시작을 클릭하여 타임랩스 이미징을 시작합니다.
      참고: M상 진입을 표시하는 GVBD는 일반적으로 IBMX 세척 후 60-90분 후에 발생합니다(그림 4A). 이 설정에서 C57BL/6 난모세포는 GVBD 후 약 8-9시간 후에 첫 번째 극체를 압출합니다(그림 4A). 시기는 마우스 계통 및 배양 조건에 따라 다를 수 있습니다.

5. 영상 후 처리

1. 파일 > 열기를 선택하고 이미징 세션에서 .lif 파일을 선택하여 이미지 분석 소프트웨어에서 이미징 파일을 엽니다.
2. Processing(처리) > Generate projection(프로젝션 생성)을 선택하여 H2B RFP 및 SiR-Tubulin 채널에 대한 Z 투영을 생성합니다. 투영 유형을 최대 강도 투영으로 설정합니다. RFP 및 SiR Tubulin 채널을 모두 선택한 다음 실행을 클릭합니다.
   참고: DIC 채널에 대해 Z 투영을 수행하면 이미지가 흐려질 수 있으므로 수행하지 마십시오. 대신 가장 선명하게 초점을 맞춘 단일 DIC 평면을 식별하고 선택합니다. 이 집중된 DIC 이미지를 H2B-RFP 및 SiR-Tubulin 채널의 최대 강도 투영과 함께 사용하여 최적의 시각화를 달성합니다.
3. 단일 명시야 초점면을 추출합니다. Process Tools로 돌아가서 편집 > 자르기를 선택합니다. 명시야 채널을 선택하고 Z 슬라이더를 사용하여 최적의 초점면을 찾은 다음 적용을 클릭합니다.
4. Process Tools를 열고 병합 > 채널 추가를 선택하여 투영 및 명시야 이미지를 병합합니다. RFP 투영, SiR-Tubulin 투영 및 단일 명시야 이미지를 추가합니다. 병합된 세트를 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 적용을 클릭합니다.
5. 파일 > 이미지 내보내기를 선택하여 병합된 최종 이미지를 내보냅니다>. 고품질의 비압축 출력을 위해 TIFF 형식을 선택하십시오.
   참고: 다운스트림 분석 및 그림 준비를 위해 TIFF 형식으로 내보내는 것이 좋습니다.

결과

그림 4A,B에서 볼 수 있듯이 이 프로토콜은 난모세포의 염색체(H2B-RFP) 및 방추 미세소관(SiR-튜불린)의 고품질 살아있는 세포 이미징을 가능하게 하여 감수 분열 성숙 전반에 걸쳐 포괄적인 시공간 정보를 제공합니다.

그림 4A의 H2B-RFP 채널은 GVBD (그림 4A, 03:00 - 08:00) 이후의 초기 정렬에서 후기 I(그림 4A, 09:00 노란색 화살표)의 분리 및 중기 II에서 염색체 정렬로 끝나는 염색체 이동의 모든 측면을 보여줍니다(그림 4A, 13:30). 고해상도 이미지를 통해 연구자들은 방추 미세소관 재배열 및 미묘한 염색체 위치 지정과 같은 미세 구조를...

토론

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 난모세포의 미세 주입 및 살아있는 세포 이미징을 위한 강력한 방법을 간략하게 설명하여 높은 시간 및 공간 해상도로 감수 분열 동안 염색체 역학을 시각화할 수 있습니다. 이 접근 방식의 성공에 중요한 것은 수집 및 미세 주입에서 이미징에 이르기까지 절차의 각 단계에서 난모세포를 세심하게 처리하는 것입니다. 난모세포는 환경 변동에 매우 민감하며 온도, pH 또는 삼투압의 편차는 생리학적 무결성과 발달 잠재력을 손상시킬 수 있습니다 3,4,5,16,17. 따라서 37°C에서 연속 배양, 예열된 배지 및 온도 제어 현미경 단계의 사용과 같은 최적의 조건을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1ml 주사기	테루모	SS+01T 투베르쿨린	정밀한 PMSG 주입을 위한 주사기.
아가로스 젤	인비트로젠	16500500	H2B-RFP 서열을 준수하기 위해 핵산을 크기별로 분리하기 위해 DNA 및 RNA 겔 전기영동에 사용됩니다.
알코올 버너	랩텍	LW15557-01	살균 및 입 피피트 준비에 사용됩니다.
박테리아 배양 배지(LB 국물)	시그마-알드리치	L3022	대장균 및 기타 박테리아 배양 성장에 사용되는 표준 배지.
세포 배양 접시(35 & 10 mm 및 60 & 15 mm)	시그마-알드리치	CLS430165, CLS430166	난모세포 배양에 사용됩니다. 다양한 크기로 제공됩니다.
원심분리기(벤치탑)	에펜도르프	5424 R	연구 실험실에서 일반적으로 사용되는 소량의 시료를 위한 소형 원심분리기입니다.
원심분리기 튜브(15ml 및 50ml)	코 닝	352096, 352070	세포 및 단백질 처리에 일반적으로 사용되는 원심분리용 더 큰 튜브.
클로로포름	시그마-알드리치	C2432	분자 생물학 프로토콜, 특히 DNA/RNA 추출에 일반적으로 사용되는 용매입니다.
CO2 인큐베이터	산요	(모델: MCO-18AIC)	난자 배양을 위해 제어된 CO2 분위기를 유지하도록 설계된 인큐베이터입니다.
일회용 초극세 바늘(27G &1/2")	한케 사스 울프	4710004012	난자 수집을 위한 가는 바늘
DNase I(RNase 프리)	써모 피셔 사이언티픽	EN0521 인증	RNA 제제에서 오염된 DNA를 제거하는 데 사용되는 효소.
건식 가열 블록	그랜트 인스트루먼트	(모델: QBD4)	물 없이 정확한 온도에서 샘플 또는 반응을 가열하는 데 사용되는 블록입니다.
에탄올(분자 생물학 등급)	시그마-알드리치	E7023	DNA 및 RNA 침전뿐만 아니라 멸균 절차에도 사용됩니다.
미세 해부 가위	Met-App 과학 및 수술 기기	2235	정밀한 해부 마우스 난모세포에 사용
미세 집게(Fine Forceps)	Met-App 과학 및 수술 기기	2127	정밀한 해부 마우스 난모세포에 사용
겔 전기영동 시스템	바이오 래드	1645050	겔 내 핵산 또는 단백질의 전기영동을 수행하는 시스템.
겐타마이신 설페이트	시그마-알드리치	지1264	세포 배양에서 박테리아 오염을 방지하는 데 사용되는 항생제.
유리 파스퇴르 피펫(230mm)	VWR	6121702	난자 입 피펫에 사용되는 유리 피펫
IBMX	시그마-알드리치	I5879	GVBD를 예방하기 위해 사용되는 포스포디에스테라제 억제제
도립 현미경	니콘		배양 접시 아래에서 살아있는 세포나 유기체를 관찰하기 위해 설계된 현미경입니다.
마우스 배아 배양에 적합한 경미네랄 오일	시그마-알드리치	M5310	증발을 방지하고 온도를 유지하기 위해 배양에서 난모세포를 덮는 데 사용됩니다.
염화리튬	시그마-알드리치	엘9650	RNA 침전 방법에 사용됩니다.
라이브 셀 이미징 시스템	라이카	라스 엑스	고급 현미경 기술을 사용하여 살아있는 세포를 실시간으로 관찰하도록 설계된 이미징 시스템입니다.
M16 배지(체외 배양용)	시그마-알드리치	M7292	마우스 난모세포 및 배아 배양 및 기타 시험관 내 응용을 위해 설계된 배지입니다.
미세 원심분리기 튜브(0.6ml 및 1.6ml)	해왕성	3735.X, 3745.X	분자 생물학 및 생화학 프로토콜에 자주 사용되는 원심분리용 소용량 튜브입니다.
미세 원심분리기 튜브(RNase 프리)	에펜도르프 / 넵튠	022431081 (Eppendorf)	RNA용 RNase-free 튜브는 RNA의 분해를 방지하는 역할을 합니다.
미세 주입 바늘	서터 악기	P-30 피펫 풀러	난모세포에 정밀한 미세주입을 위한 바늘
마이크로 인젝션 시스템	하버드 장치	펨토젯, 피코펌프	cRNA를 마우스 난모세포에 높은 정밀도로 주입하는 데 사용되는 시스템입니다.
미니프렙 키트	키아겐	27106 (QIAprep 스핀 미니프렙 키트)	분자 생물학 응용을 위해 박테리아 배양에서 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 키트입니다.
구강 흡인기 튜브 어셈블리	시그마-알드리치	A5177	흡인 난모세포용
펠렛 페인트	머크 밀리포어	69049-3	원심분리 중 펠릿 형성을 시각화하기 위한 제품입니다.
페놀:클로로포름:이소아밀알코올	써모 피셔 사이언티픽	15593031	상 분리를 위한 H2B-RFP 추출에 사용되는 용액입니다.
H2B-RFP를 인코딩하는 플라스미드	아드진	플라스미드 #20972	적색 형광 단백질(RFP) 로 염색체를 표지하는 데 사용되는 플라스미드;
PMSG	프로스펙	호르-272	마우스 과분발상용
프로테이나제 K	써모 피셔 사이언티픽	EO0491	DNA/RNA 추출 절차에 일반적으로 사용되는 단백질을 소화하는 데 사용되는 효소입니다.
제한 효소 NotI	뉴잉글랜드 바이오랩스(NEB)	R3189S	H2B-RFP 플라스미드 선형화를 위해 DNA 복제 및 분자 생물학 응용 분야에 사용되는 제한 효소입니다.
RNase 억제제(선택 사항)	뉴잉글랜드 바이오랩스(NEB)	M0314S	RNA 관련 실험 중 RNA 분해를 방지하는 데 사용되는 효소입니다.
RNase가 없는 장갑	VWR / 피셔 사이언티픽	크기에 따라 다름	RNA 조작 프로토콜에 사용되는 RNase 오염을 방지하기 위해 처리된 장갑.
RNase가 없는 피펫 팁	Axygen / 써모 피셔	T-300-RS	RNA 관련 응용 분야를 위해 RNase 오염이 없도록 설계된 피펫 팁.
RNase가 없는 물	써모 피셔 사이언티픽	AM9932	RNase 효소를 제거하기 위해 정제된 물은 분해를 방지하기 위해 RNA 작업에 필수적입니다.
SDS (10%)	시그마-알드리치	L3771	전기영동 및 기타 실험에서 단백질을 변성시키는 데 사용되는 도데실 황산나트륨.
SiR-튜불린	스피로크롬	SC002	방추의 살아있는 세포 이미징을 위해 튜불린에 특이적으로 결합하는 형광 염료
아세트산나트륨(3M)	시그마-알드리치	S7899	분자 생물학 절차에서 완충액 및 DNA 침전에 사용됩니다.
분광 광도계	써모 피셔(NanoDrop)	ND-원-W	흡광도를 측정하여 핵산, 단백질 및 기타 물질을 정량화하는 데 사용되는 기기입니다.
실체현미경	라이카 마이크로시스템즈	M165C	저배율로 표본을 3차원으로 관찰하도록 설계된 현미경으로 해부에 유용합니다.
주사기 필터 장치(0.22-µ m)	머 크	SLGP033RS	특히 미생물학 및 분자 생물학 응용 분야에서 액체의 멸균 여과에 사용됩니다.
주사기 및 바늘 조립	테루모	SS+01T 투베르쿨린 주사기	정확한 PMSG 배송에 사용됩니다.
T7 mMESSAGE mMACHINE 키트	써모 피셔 사이언티픽	AM1344	H2B-RFP cRNA 준비를 위한 T7 프로모터에서 RNA의 시험관 내 전사를 위한 키트입니다.
수조/가열 블록	보조금 도구	QBD4	열이 필요한 실험에서 정확한 온도를 유지하는 데 사용됩니다.