마우스 난모세포 감수분열(mouse oocyte moiosis) 동안 염색체 분리의 살아있는 세포 이미징

요약

여기에서는 염색질에 H2B-RFP를, 방추 시각화에 SiR-Tubulin을 사용하여 마우스 난모세포의 염색체 분리를 연구하기 위한 살아있는 세포 이미징 기술을 요약합니다. 우리는 샘플 준비, 미세 주입, 배양, 이미징 설정 및 분석을 자세히 설명하며 감수 분열 염색체 역학의 고해상도 및 최소한의 광독성 이미징을 달성하기 위한 실용적인 가이드를 제공합니다.

초록

난자 감수 분열 중 정확한 염색체 분리는 적절한 배아 발달을 보장하고 이수성 관련 장애를 예방하는 데 필수적입니다. 형광 표지 기술과 결합된 살아있는 세포 이미징은 높은 시공간 해상도로 감수 분열 염색체 역학을 연구하기 위한 강력한 접근 방식이 되었습니다. 이 프로토콜에서는 염색질 표지를 위한 히스톤 H2B-RFP와 방추 추적을 위한 SiR-튜불린의 사용에 초점을 맞춰 살아있는 마우스 난모세포에서 염색체 분리를 시각화하기 위한 주요 방법론을 요약합니다. 우리는 광독성을 최소화하면서 고해상도 이미징을 달성하도록 최적화된 샘플 준비, mRNA 미세 주입, 난자 배양, 생세포 이미징 챔버 설정 및 공초점 현미경 설정 절차를 설명합니다. 또한 광독성, 이미지 처리 및 감수 분열 사건의 정량적 분석과 같은 중요한 실험 고려 사항을 강조합니다. 현재 방법론에 대한 포괄적인 평가를 제공함으로써 이 프로토콜은 살아있는 난모세포의 염색체 역학을 조사하고 감수 분열 연구의 정확성과 재현성을 향상시키려는 연구자를 위한 실용적인 가이드 역할을 합니다.

서론

난자 감수 분열 동안 염색체 및 방추 역학의 정확한 시각화는 여성 배우자 성숙 및 이수성 위험을 지배하는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다 1,2,3,4,5. 포유류 난모세포는 배아 소포 파괴(GVBD), 염색체 응축, 방추 조립 및 비대칭 분열을 포함하여 고도로 조정된 일련의 감수 분열 사건을 겪습니다⁶. 고정 시점 이미징은 이러한 프로세스의 귀중한 스냅샷을 제공했지만 시간적 해상도가 부족하고 샘플링 간격 사이에 발생하는 일시적이거나 빠른 이벤트를 캡처할 수 없습니다. 대조적으로, 형광 표지된 염색체 및 미세소관의 살아있는 세포 이미징은 이러한 동적 과정을 실시간으로 모니터링하는 강력한 접근 방식을 제공합니다^2,3,7. 이를 통해 개별....

프로토콜

모든 실험은 지역 동물 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다. 실험 절차는 3R 원칙인 교체, 감소 및 개선을 엄격히 준수해야 합니다. 생쥐는 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 표준화된 환경 조건(22°C, 습도 60%)에서 공인된 동물 시설에 사육되어야 합니다.

1. 난자 채취 및 준비

참고: 모든 장비와 시약은 멸균되어야 합니다. 입체 현미경 아래에서 구강 피펫을 사용하여 모든 난모세포 처리를 수행합니다( 재료 표 참조). 모든 배양 배지 방울을 미네랄 오일로 덮습니다(그림 1A-E).

1. 호르몬 자극
   1. 난자 수집 46-48시간 전에 3-4주 된 암컷 마우스에게 임신한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG; 재료 표 참조)의 5 국제 단위(IU)를 복강 내 주사합니다.
      참고: B6CBAF1 마우스(C57BL/6J × CBA/CaCrl의 F1 자손)는 우수한 난자 생산량과 유리한 성숙 특성으로 인....

결과

그림 4A,B에서 볼 수 있듯이 이 프로토콜은 난모세포의 염색체(H2B-RFP) 및 방추 미세소관(SiR-튜불린)의 고품질 살아있는 세포 이미징을 가능하게 하여 감수 분열 성숙 전반에 걸쳐 포괄적인 시공간 정보를 제공합니다.

그림 4A의 H2B-RFP 채널은 GVBD (그림 4A, 03:00 - 08:00) 이후의 초기 정렬에서 후기 I(그림 4A, 09:00 노란색 화살표)의 분리 및 중기 II에서 염색체 정렬로 끝나는 염색체 이동의 모든 측면을 보여줍니다(그림 4A, 13:30). 고해상도 이미지를 통해 연구자들은 방추 미세소관 재배열 및 미묘한 염색체 위치 지정과 같은 미세 구조를.......

토론

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 난모세포의 미세 주입 및 살아있는 세포 이미징을 위한 강력한 방법을 간략하게 설명하여 높은 시간 및 공간 해상도로 감수 분열 동안 염색체 역학을 시각화할 수 있습니다. 이 접근 방식의 성공에 중요한 것은 수집 및 미세 주입에서 이미징에 이르기까지 절차의 각 단계에서 난모세포를 세심하게 처리하는 것입니다. 난모세포는 환경 변동에 매우 민감하며 온도, pH 또는 삼투압의 편차는 생리학적 무결성과 발달 잠재력을 손상시킬 수 있습니다 3,4,5,16,17. 따라서 37°C에서 연속 배양, 예열된 배지 및 온도 제어 현미경 단계의 사용과 같은 최적의 조건을 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1ml 주사기	테루모	SS+01T 투베르쿨린	정밀한 PMSG 주입을 위한 주사기.
아가로스 젤	인비트로젠	16500500	H2B-RFP 서열을 준수하기 위해 핵산을 크기별로 분리하기 위해 DNA 및 RNA 겔 전기영동에 사용됩니다.
알코올 버너	랩텍	LW15557-01	살균 및 입 피피트 준비에 사용됩니다.
박테리아 배양 배지(LB 국물)	시그마-알드리치	L3022	대장균 및 기타 박테리아 배양 성장에 사용되는 표준 배지.
세포 배양 접시(35 & 10 mm 및 60 & 15 mm)	시그마-알드리치	CLS430165, CLS430166	난모세포 배양에 사용됩니다. 다양한 크기로 제공됩니다.
원심분리기(벤치탑)	에펜도르프	5424 R	연구 실험실에서 일반적으로 사용되는 소량의 시료를 위한 소형 원심분리기입니다.
원심분리기 튜브(15ml 및 50ml)	코 닝	352096, 352070	세포 및 단백질 처리에 일반적으로 사용되는 원심분리용 더 큰 튜브.
클로로포름	시그마-알드리치	C2432	분자 생물학 프로토콜, 특히 DNA/RNA 추출에 일반적으로 사용되는 용매입니다.
CO2 인큐베이터	산요	(모델: MCO-18AIC)	난자 배양을 위해 제어된 CO2 분위기를 유지하도록 설계된 인큐베이터입니다.
일회용 초극세 바늘(27G &1/2")	한케 사스 울프	4710004012	난자 수집을 위한 가는 바늘
DNase I(RNase 프리)	써모 피셔 사이언티픽	EN0521 인증	RNA 제제에서 오염된 DNA를 제거하는 데 사용되는 효소.
건식 가열 블록	그랜트 인스트루먼트	(모델: QBD4)	물 없이 정확한 온도에서 샘플 또는 반응을 가열하는 데 사용되는 블록입니다.
에탄올(분자 생물학 등급)	시그마-알드리치	E7023	DNA 및 RNA 침전뿐만 아니라 멸균 절차에도 사용됩니다.
미세 해부 가위	Met-App 과학 및 수술 기기	2235	정밀한 해부 마우스 난모세포에 사용
미세 집게(Fine Forceps)	Met-App 과학 및 수술 기기	2127	정밀한 해부 마우스 난모세포에 사용
겔 전기영동 시스템	바이오 래드	1645050	겔 내 핵산 또는 단백질의 전기영동을 수행하는 시스템.
겐타마이신 설페이트	시그마-알드리치	지1264	세포 배양에서 박테리아 오염을 방지하는 데 사용되는 항생제.
유리 파스퇴르 피펫(230mm)	VWR	6121702	난자 입 피펫에 사용되는 유리 피펫
IBMX	시그마-알드리치	I5879	GVBD를 예방하기 위해 사용되는 포스포디에스테라제 억제제
도립 현미경	니콘		배양 접시 아래에서 살아있는 세포나 유기체를 관찰하기 위해 설계된 현미경입니다.
마우스 배아 배양에 적합한 경미네랄 오일	시그마-알드리치	M5310	증발을 방지하고 온도를 유지하기 위해 배양에서 난모세포를 덮는 데 사용됩니다.
염화리튬	시그마-알드리치	엘9650	RNA 침전 방법에 사용됩니다.
라이브 셀 이미징 시스템	라이카	라스 엑스	고급 현미경 기술을 사용하여 살아있는 세포를 실시간으로 관찰하도록 설계된 이미징 시스템입니다.
M16 배지(체외 배양용)	시그마-알드리치	M7292	마우스 난모세포 및 배아 배양 및 기타 시험관 내 응용을 위해 설계된 배지입니다.
미세 원심분리기 튜브(0.6ml 및 1.6ml)	해왕성	3735.X, 3745.X	분자 생물학 및 생화학 프로토콜에 자주 사용되는 원심분리용 소용량 튜브입니다.
미세 원심분리기 튜브(RNase 프리)	에펜도르프 / 넵튠	022431081 (Eppendorf)	RNA용 RNase-free 튜브는 RNA의 분해를 방지하는 역할을 합니다.
미세 주입 바늘	서터 악기	P-30 피펫 풀러	난모세포에 정밀한 미세주입을 위한 바늘
마이크로 인젝션 시스템	하버드 장치	펨토젯, 피코펌프	cRNA를 마우스 난모세포에 높은 정밀도로 주입하는 데 사용되는 시스템입니다.
미니프렙 키트	키아겐	27106 (QIAprep 스핀 미니프렙 키트)	분자 생물학 응용을 위해 박테리아 배양에서 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 키트입니다.
구강 흡인기 튜브 어셈블리	시그마-알드리치	A5177	흡인 난모세포용
펠렛 페인트	머크 밀리포어	69049-3	원심분리 중 펠릿 형성을 시각화하기 위한 제품입니다.
페놀:클로로포름:이소아밀알코올	써모 피셔 사이언티픽	15593031	상 분리를 위한 H2B-RFP 추출에 사용되는 용액입니다.
H2B-RFP를 인코딩하는 플라스미드	아드진	플라스미드 #20972	적색 형광 단백질(RFP) 로 염색체를 표지하는 데 사용되는 플라스미드;
PMSG	프로스펙	호르-272	마우스 과분발상용
프로테이나제 K	써모 피셔 사이언티픽	EO0491	DNA/RNA 추출 절차에 일반적으로 사용되는 단백질을 소화하는 데 사용되는 효소입니다.
제한 효소 NotI	뉴잉글랜드 바이오랩스(NEB)	R3189S	H2B-RFP 플라스미드 선형화를 위해 DNA 복제 및 분자 생물학 응용 분야에 사용되는 제한 효소입니다.
RNase 억제제(선택 사항)	뉴잉글랜드 바이오랩스(NEB)	M0314S	RNA 관련 실험 중 RNA 분해를 방지하는 데 사용되는 효소입니다.
RNase가 없는 장갑	VWR / 피셔 사이언티픽	크기에 따라 다름	RNA 조작 프로토콜에 사용되는 RNase 오염을 방지하기 위해 처리된 장갑.
RNase가 없는 피펫 팁	Axygen / 써모 피셔	T-300-RS	RNA 관련 응용 분야를 위해 RNase 오염이 없도록 설계된 피펫 팁.
RNase가 없는 물	써모 피셔 사이언티픽	AM9932	RNase 효소를 제거하기 위해 정제된 물은 분해를 방지하기 위해 RNA 작업에 필수적입니다.
SDS (10%)	시그마-알드리치	L3771	전기영동 및 기타 실험에서 단백질을 변성시키는 데 사용되는 도데실 황산나트륨.
SiR-튜불린	스피로크롬	SC002	방추의 살아있는 세포 이미징을 위해 튜불린에 특이적으로 결합하는 형광 염료
아세트산나트륨(3M)	시그마-알드리치	S7899	분자 생물학 절차에서 완충액 및 DNA 침전에 사용됩니다.
분광 광도계	써모 피셔(NanoDrop)	ND-원-W	흡광도를 측정하여 핵산, 단백질 및 기타 물질을 정량화하는 데 사용되는 기기입니다.
실체현미경	라이카 마이크로시스템즈	M165C	저배율로 표본을 3차원으로 관찰하도록 설계된 현미경으로 해부에 유용합니다.
주사기 필터 장치(0.22-µ m)	머 크	SLGP033RS	특히 미생물학 및 분자 생물학 응용 분야에서 액체의 멸균 여과에 사용됩니다.
주사기 및 바늘 조립	테루모	SS+01T 투베르쿨린 주사기	정확한 PMSG 배송에 사용됩니다.
T7 mMESSAGE mMACHINE 키트	써모 피셔 사이언티픽	AM1344	H2B-RFP cRNA 준비를 위한 T7 프로모터에서 RNA의 시험관 내 전사를 위한 키트입니다.
수조/가열 블록	보조금 도구	QBD4	열이 필요한 실험에서 정확한 온도를 유지하는 데 사용됩니다.