방법 논문

형광 지방산 유사체를 이용한 내피 지방산 흡수의 정량화

DOI:

10.3791/68859

⸱

2025년 8월 15일

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 장쇄 및 초장쇄 포화 지방산의 BODIPY-C12 및 BODIPY-C16 형광 유사체로 자극 시 내피 세포에서 세포 지질 흡수를 측정하기 위한 시험관 내 분석을 자세히 설명합니다. 이 방법은 효율적이고 다른 세포 유형에 적응할 수 있어 지질 대사를 연구하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

내피 세포(EC)는 혈류에서 대사 조직으로의 지방산(FA) 수송을 조절하는 데 중심적인 역할을 하지만 신뢰할 수 있고 확장 가능한 방식으로 EC FA 흡수를 정량화하는 도구는 여전히 제한적입니다. 여기에서는 형광 FA 유사체(BODIPY-C12 및 BODIPY-C16)를 사용하여 EC에서 FA 흡수를 측정하기 위한 신속하고 정량적이며 비용 효율적인 분석을 제시하며, 이를 통해 96웰 플레이트 형식에서 사슬 길이별 흡수 역학을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 양성(3-하이드록시이소부티레이트, 젖산) 및 음성(니클로사마이드) 대조군을 통합하며 1차(HUVEC) 및 불멸화(EA.hy926) EC 라인 모두에서 검증되었습니다. 이 분석은 시간 및 용량 의존적 FA 흡수를 검출하며, 결과는 Hoechst 핵 염색을 사용하여 세포 수로 정규화되고 적절한 대조군을 사용하여 배경에 대해 보정됩니다. 다양한 세포 유형, 이미징 양식, 라이브 셀 이미징 및 펄스 체이스 형식을 포함한 실험 조건에 적응 할 수 있습니다. 기존의 지질 염색 또는 방사성 표지 추적자와 비교하여 이 방법은 살아있는 세포에서 동적 FA 흡수를 포착하는 동시에 향상된 안전성, 속도 및 다양성을 제공합니다. 이 분석은 내피 지질 수송의 조절과 대사 질환에 대한 기여도를 연구하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지질과 같은 혈액 매개 영양소가 골격근과 같은 대사 조직으로 들어가기 위해서는 먼저 모세혈관 벽을 구성하는 내피 세포(EC) 장벽을 통과해야 합니다. 지방산(FA)이 단순히 이 장벽을 가로질러 확산되어 기본 조직에 도달한다고 오랫동안 믿어왔지만, 새로운 증거는 EC가 수성 세포외 및 세포내 세계를 가로질러 소수성 분자를 이동하도록 진화한 특수 수송 메커니즘을 통해 이 과정을 적극적으로 조절한다는 것을 시사합니다1.

혈류에서 FA는 알부민 결합 유리 지방산(FFA)으로 존재하거나 킬로미크론 및 초저밀도 지단백질(VLDL)과 같은 트리글리세라이드가 풍부한 지단백질(TRL) 내에 포장됩니다2. EC의 내강 표면에서 지단백질 리파아제(LPL)는 TRL을 가수분해하여 흡수를 위한 FFA를 방출합니다. FA를 세포로 실제 흡수하는 CD36을 포함하여 다양한 단백질이 FA 수송에 관여합니다. 벡터 수송을 매개하는 지방산 수송 단백질(FATP) 및 아실-CoA 합성효소(ACSL); 친유성 샤페론 역할을 하는 지방 결합 단백질(FABP)과 수많은 다른 단백질, 일부는 아직 발견되지 않고 분류되지 않았습니다 2,3. 기본 조직도 유사한 메커니즘을 사용하여 운반된 지방을 흡수하지만 존재하는 특정 이소형은 종종 세포 유형에 따라 다릅니다.

최근 연구에 따르면 EC는 측분비 신호 전달을 통해 인접 세포와 협력하여 표적 조직으로의 FA 수송을 조절하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 골격 근세포는 3-하이드록시이소부티레이트(3-HIB), 혈관 내피 성장 인자 B(VEGFB) 및 아펠린과 같은 측분비 인자 모음을 분비하여 인근 내피에 의한 FA 수송을 촉진합니다 4,5,6. 흥미롭게도, 인슐린이 지방세포를 자극하여 젖산을 방출하는 경우와 같이 내분비계도 관여할 수 있으며, 이는 또한 EC가 FA를 흡수하도록 자극합니다7.

따라서 EC는 지방의 조절 문지기 역할을 하며, 이는 심혈관 질환이나 제2형 당뇨병과 같은 지질 대사 장애에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 최근의 증거에 따르면 EC 자체는 지방 과부하에 대한 반응으로 지질 방울(LD)을 축적하여 잠재적으로 기저 조직으로의 지방산 전달을 조절하는 완충 역할을 합니다 8,9. 현대 식단의 경우와 같이 지방 섭취가 많은 경우 이러한 LD의 과도한 축적은 혈관 기능 장애 및 고혈압을 포함한 질병에 기여할 수 있습니다10. 전체적으로 EC가 FA를 흡수하고 운반하는 방법에 대한 더 나은 이해는 지질 매개 질환을 해결하기 위한 새로운 치료 방법을 제공할 수 있습니다.

이 연구에서는 형광 장쇄 FA 유사체 BODIPY-C12 및 BODIPY-C16을 사용하여 내피 FA 흡수를 측정하기 위한 간단하고 신속하며 비용 효율적인 분석을 설명합니다. 이러한 시약은 특히 전통적으로 세포 지방 흡수를 측정하는 데 사용되어 온 방사성 또는 중동위원소 표지 FA와 비교할 때 상당히 저렴하고 매우 안전합니다11,12. 이러한 시약은 주로 LD에서 세포의 소수성 영역에 수동적으로 축적되는 비접합 "유리" BODIPY 염료와 구별된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다13. 대조적으로, BODIPY를 지방족 FA 사슬(예: C12 또는 C16)에 접합하면 천연 장쇄 FA를 구조적으로 모방하는 분자가 생성됩니다. 이러한 변형은 세포 내 지질 저장 또는 액적 형성을 반영하는 대신 세포로의 동적 지방산 흡수를 구체적으로 측정할 수 있도록 합니다.

이 접근 방식의 주요 강점은 유연성입니다. 연구자들은 다른 세포 유형, 다양한 배양 시간 및 다양한 BODIPY 접합 FA 유사체를 사용하여 사슬 길이 의존적 흡수 또는 시스-파리나르 지방산과 같은 자연 형광 지질을 연구할 수 있습니다14. 전반적으로 이 프로토콜은 연구자에게 여러 조건에서 세포 FA 흡수를 테스트할 수 있는 쉬운 방법을 제공하고 지질 대사, 내피 생물학 및 대사 질환의 근본적인 질문에 답할 수 있는 길을 열어줄 것입니다(그림 1).

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에 사용된 모든 인간 유래 내피 세포(HUVEC)는 인간 생물학적 재료의 윤리적 사용에 대한 기관 및 공급업체 지침에 따라 상업적으로 이용 가능하고 식별되지 않은 출처에서 얻었습니다. 층류 후드 아래의 멸균 환경에서 모든 단계를 수행합니다. 모든 시약 및 장비 목록은 재료 표 를 참조하십시오.

1. 96웰 플레이트의 젤라틴 코팅

  1. 2% 젤라틴 스톡 25mL를 500mL 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석하여 0.1% 젤라틴 용액을 준비합니다.
  2. 완전히 혼합하고 0.2μm 진공 필터(또는 오토클레이브)를 사용하여 필터 멸균합니다.
  3. 웰당 100μL의 0.1% 젤라틴을 바닥이 투명한 검은색 96웰 플레이트에 첨가합니다.
  4. 37°C에서 최소 30분 동안 또는 이상적으로는 밤새 배양합니다.

2. 세포 파종

  1. 완전한 배지에서 EC의 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
    1. 적절한 기초 배지에 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신(둘 다에 대해 v/v)을 보충하여 완전한 배지를 준비합니다.
      참고: 기초 배지는 특정 세포 유형에 따라 다릅니다. 본 연구에서는 내피 성장 배지(EGM-2)와 Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)을 HUVECs와 EA.hy926 세포에 각각 사용하였다.
  2. 세포 현탁액 100μL를 다음 날까지 세포가 합류에 도달할 수 있도록 파종 밀도로 각 웰에 피펫팅합니다.

3. 처리시약 준비 및 적용

  1. 모든 시약을 2가 PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 포함)로 준비하고 37°C로 예열합니다.
    1. 3-HIB(양성 대조군)를 20mM 작업 용액으로 준비합니다. 원액을 1 M에서 이중 증류수에 녹이고 4 °C에서 보관합니다.
    2. 젖산(양성 대조군)을 20mM 작업 용액으로 준비합니다. 원액을 1 M에서 이중 증류수에 녹이고 4 °C에서 보관합니다.
    3. 최종 농도 1μM에서 니클로사마이드(음성 대조군)를 준비합니다. DMSO에서 10mM에서 원액을 용해시킵니다. 동결-해동 순환을 피하기 위해 더 작은 부피로 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
  2. 예열된 2가 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.
  3. 적절한 처리 시약(3-HIB, 젖산 또는 니클로사마이드)을 웰당 50μL를 첨가하고 37°C에서 30분(니클로사마이드의 경우) 또는 60분(3-HIB 및 젖산의 경우) 동안 배양합니다.

4. BODIPY-FA: BSA 복합체 준비 및 적용

  1. 2:1 FA:BSA 몰비를 사용하여 PBS에서 0.5μM, 1μM 또는 2μM 최종 농도의 BODIPY-FA: BSA 복합체를 준비합니다. 2 μM BODIPY-FA 용액의 경우, PBS에서 1 μM FA가 없는 BSA와 함께 배양합니다. 1μM BODYPY-FA의 경우 0.5μM BSA를 사용하는 식입니다. 배양하는 동안 항상 복합체를 빛으로부터 보호하십시오.
  2. 사용하기 전에 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양하십시오.
  3. 50μL의 복합체를 처리된 웰에 첨가합니다.
    참고: 가장자리 효과를 피하기 위해 중간 10개의 열만 사용하십시오. 외부 컬럼을 자가형광 대조군으로 예약하고 이러한 웰에 PBS만 추가합니다.
  4. 플레이트를 37°C에서 1분, 5분 또는 10분 동안 배양합니다.

5. 형광 소멸 및 세포내 신호 검출

  1. 세척 완충액으로 PBS에 1μM FA가 없는 BSA를 준비하고 37°C로 예열합니다.
  2. BODIPY-FA: BSA 제거하고 PBS에서 예열된 1μM FA가 없는 BSA 50μL로 전체 플레이트를 두 번 세척합니다. 각 세탁을 1.5분 동안 수행합니다.
  3. 0.08% 트리판 블루 50 μL를 첨가하여 세포외 형광을 소멸시킵니다.
  4. 다음 설정의 마이크로플레이트 리더를 사용하여 세포내 형광을 즉시 측정합니다: 여기: 488 nm, 방출: 515 nm, 컷오프: 495 nm, 모드: 하단 판독.
    참고: 4단계에서 BODIPY-FA로 처리되지 않은 세포를 포함하는 외부 컬럼 웰을 사용하여 자가형광 배경을 뺍니다.

6. 세포 정상화를 위한 Hoechst 핵 염색

  1. 트리판 블루 용액을 제거하고 PBS로 부드럽게 세척합니다.
    참고: 세포는 다소 깨지기 쉽고 벗겨지기 쉽습니다. 세탁할 때 주의하십시오.
  2. 10% 배지에 4μg/mL Hoechst를 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: Hoechst 배양 시간은 최적화가 필요할 수 있습니다. 세포 유형에 따라 균일한 핵 표지와 충분한 신호 강도를 달성하는 데 5분에서 60분이 필요할 수 있습니다. 외부 열에 Hoechst를 추가하지 마십시오.
  3. PBS로 플레이트를 한 번 세척하십시오.
  4. 새로운 PBS를 추가하고 다음 설정을 사용하여 Hoechst 형광을 측정합니다: 여기: 350 nm, 방출: 461 nm, 컷오프: 455 nm, 모드: 하단 판독.
    참고: 외부 컬럼 웰을 사용하여 Hoechst 자가형광 배경을 뺍니다.
  5. 5.3단계의 자가형광 보정 값을 6.4단계에서 얻은 해당 Hoechst 값으로 나누어 BODIPY-FA 형광을 세포 번호로 정규화합니다. BODIPY 및 Hoechst 신호 모두에 대해 배경 보정 값을 사용합니다.
    참고: 최종 값은 BODIPY 및 Hoechst 채널 모두에서 자가형광에 대해 보정된 세포 번호로 정규화된 BODIPY-FA 흡수를 나타냅니다.

7. 통계 분석

  1. 양방향 분산 분석(anova)을 사용하여 그림 2 에 대한 통계 분석을 수행하여 시간, 집중 및 상호 작용의 영향을 평가합니다. 다중 비교를 위해 Tukey의 사후 테스트를 적용합니다.
  2. 그림 3과 그림 4의 경우 두 조건을 비교할 때 스튜던트의 짝이 없는 양측 t-검정을 사용합니다. 세 개 이상의 조건이 포함된 실험의 경우 일원 분산 분석과 다중 비교를 위해 Dunnett 검정을 사용합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 1에서 볼 수 있듯이 이 분석은 EC가 웰에 직접 시딩되는 96웰 플레이트 형식을 사용합니다. BODIPY 표지 FA는 소 혈청 알부민(BSA)에 접합되어 실험 및 대조군 웰 모두에 적용됩니다. FA 치료 전에 EC는 약리학적 치료 또는 siRNA 형질감염 또는 CRISPR 유전자 편집과 같은 유전적 교란을 통해 조작될 수 있습니다. 결정적으로, 이러한 조작을 통해 분석 신뢰성을 보장하기 위해 적절한 양성 및 음성 대조군을 포함할 수도 있습니다.

HUVEC와 EA.hy926 세포 모두에서 BODIPY-C12를 0.5μM, 1μM 및 2μM에서 1분, 5분 및 10분 동안 배양한 후 세포내 BODIPY-C12 신호의 명확한 용량 및 시간 의존적 증가가 관찰되었습니다(그림 2). 웰당 세포 수의 잠재적 변화를 설명하기 위해 BODIPY-C12 값을 Hoechst 핵 염색으로 정규화하고 형광으로 측정했습니다. 배경 자가형광은 no-BODIPY 및 no-Hoechst 대조군 웰을 사용하여 보정되었습니다.

분석 재현성 및 범위를 검증하기 위해 BODIPY-C12 를 사용하여 EA.hy926 EC에서 알려진 지방산 대사 조절제를 테스트했습니다(그림 3). 젖산(0mM, 5mM, 20mM) 또는 3-HIB(0mM, 5mM, 20mM)의 농도를 증가시키는 1시간 치료는 용량 의존적 방식으로 BODIPY-C12 흡수를 향상시켜 FA 흡수의 긍정적인 조절자로서의 역할을 확인했습니다. 반대로, 화학적 니클로사마이드가 미토콘드리아 분리를 통해 지방산 흡수를 억제할 수 있다는 것이 이전에 입증되었습니다15. 실제로, 니클로사마이드(1μM)로 30분 동안 처리하면 비히클 대조군에 비해 BODIPY-C12 신호가 유의하게 감소하여 음성 대조군으로서의 유용성이 검증되었기 때문에 유사한 결과가 여기에서 재현되었습니다. 이러한 데이터는 세포 수의 차이를 설명하기 위해 Hoechst로 정규화되지만 이러한 처리 중 어느 것도 세포 생존력이나 Hoechst 형광 값을 변경하지 않았습니다.

다양한 지방산 유사체에 대한 분석의 적응성을 평가하기 위해 매우 긴 사슬 지방산의 프록시로 간주될 수 있는 BODIPY-C16을 HUVEC에 제공하고 5분 배양 후 흡수를 측정했습니다(그림 4). 젖산 처리(0mM, 10mM, 20mM)는 용량 의존적 방식으로 BODIPY-C16 신호를 증가시키는 반면, 니클로사마이드(1μM)는 신호를 감소시켜 BODIPY-C12에서 관찰된 결과를 반영하는 것으로 관찰되었습니다.

대체로 이 분석은 1차(HUVEC) 및 불멸화(EA.hy926) EC 모두에서 FA 흡수의 강력하고 재현 가능한 정량화를 가능하게 했습니다. 또한, 이러한 결과는 다양한 사슬 길이의 FA에 걸쳐 분석의 다양성을 입증할 뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군의 타당성을 보여줍니다.

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그림 1: BODIPY 표지 지방산을 사용한 지방산 흡수 분석의 개략도. 내피 세포를 검은색의 투명한 바닥 96웰 플레이트에 파종하고 BODIPY 접합 지방산(FA) 유사체와 함께 배양하여 세포 내 흡수를 가능하게 합니다. 배양 후, 세포외 형광을 트리판 블루로 소멸시키고, 세포내 신호는 하단 판독 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정됩니다. Hoechst 핵 염색은 정규화를 위한 세포 수를 정량화하기 위해 형광 측정 후에 적용됩니다. BODIPY-FA 배양 전에 약리학적 치료 또는 유전적 교란을 적용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 일차 및 불멸화 내피 세포에서 BODIPY-C12 흡수의 정량화. (A) 0.5μM, 1μM 및 2μM BODIPY-C12에서 1분, 5분 및 10분 배양 후 HUVEC에서 BODIPY-C12 흡수의 시간 및 농도 의존적 증가는 각각 0.25μM, 0.5μM 및 1μM FA가 없는 BSA에 복합화되었습니다. (B) EA.hy926 세포는 동일한 조건에서 유사한 시간 및 용량 의존적 BODIPY-C12 흡수를 나타냈습니다. 평균 형광 강도는 Hoechst 염색 핵(세포 수) 및 BODIPY 없음 대조군으로 정규화되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 양방향 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행하여 시간, 집중 및 상호 작용의 영향을 평가한 후 다중 비교를 위해 Tukey의 사후 테스트를 수행했습니다. 시간(p < 0.0001), 농도(p < 0.0001) 및 이들의 상호 작용(p = 0.0443)에 대해 유의미한 주효과가 관찰되었습니다. Tukey의 테스트에 의해 식별된 통계적으로 유의미한 쌍별 비교는 막대 그래프에 다음과 같이 표시됩니다: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 및 ****p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: EA.hy926에서 양성 및 음성 대조군을 사용한 분석의 검증. (A) 1시간 젖산 처리(0mM, 5mM, 20mM)는 용량 의존적 방식으로 BODIPY-C12 흡수를 증가시켰다. (B) 1시간 3-HIB 처리(0mM, 5mM, 20mM)는 유사하게 FA 흡수를 증가시켰습니다. (C) 30분 니클로사마이드 처리(1μM)는 비히클 대조군(DMSO)에 비해 BODIPY-C12 흡수를 유의하게 억제했습니다. 평균 형광 강도는 Hoechst 염색 핵(세포 수) 및 BODIPY 없음 대조군으로 정규화되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 2μM BODIPY-C12 (1μM 무지방산 BSA에 복합화)를 모든 실험에 대해 5분 동안 배양했습니다. (A)와 (B)에 대한 통계는 다중 비교를 위해 Dunnett's test와 함께 일원 분산 분석을 사용하였고, C에 대해서는 Student의 짝을 이루지 않은 양측 T 테스트를 사용하여 결정되었습니다. p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: HUVEC에서 BODIPY-C16 을 사용한 분석 검증. (A) 젖산 처리(1시간 동안 0mM, 10mM, 20mM)는 용량 의존적 방식으로 BODIPY-C16 흡수를 향상시켰다. (B) 니클로사마이드 처리(1시간 동안 1μM)는 비히클 처리된 대조군에 비해 BODIPY-C16 신호를 유의하게 감소시켰다. 평균 형광 강도는 Hoechst 염색 핵(세포 수) 및 BODIPY 없음 대조군으로 정규화되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 2μM BODIPY-C16 (1μM 무지방산 BSA에 복합화)을 모든 실험에 대해 5분 동안 배양했습니다. (A)에 대한 통계는 다중 비교를 위해 Dunnett의 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하였고, B에 대한 통계는 Student의 짝이 없는 양측 T 테스트를 사용하여 결정되었습니다. *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 분석은 96웰 플레이트 기반 형식과 형광 장쇄 FA 유사체를 사용하여 EC에서 FA 흡수를 측정하기 위한 신속하고 정량적이며 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 양성 및 음성 대조군을 모두 통합하고 1차(HUVEC) 및 불멸화(EA.hy926) EC에 걸쳐 검증함으로써 이 프로토콜은 견고성, 재현성 및 광범위한 적용 가능성을 보여줍니다.

형광 기반 분석은 앞서 언급한 바와 같이 내피 지질 수송의 측분비 조절자를 밝히는 데 중요한 역할을 했습니다 4,5,7. 이러한 예는 표준화된 시스템이 통제된 시험관 내 환경에서 지질 수송의 대사산물 구동 조절을 지속적으로 확실하게 밝힐 수 있는 방법을 강조합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 다중 농도(0.5-2μM) 및 배양 시간(1분, 5분 및 10분)에서 BODIPY-C12 및 BODIPY-C16의 사용을 포함하여 신뢰할 수 있는 FA 흡수 측정을 위한 주요 매개변수를 설정합니다. 또한 3-HIB와 젖산에 대한 반응으로 흡수 증가를 효과적으로 감지하고 니클로사마이드 치료 후 흡수 감소를 감지하여 민감도와 동적 범위를 모두 확인했습니다. 여기에서 EC에 최적화되어 있지만 이 분석은 BODIPY: BSA 비율 및 치료 조건을 조정하여 지방세포, 근관 또는 간세포와 같은 다른 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있습니다. 또한 호환 가능한 플레이트를 사용하여 살아있는 세포 이미징을 위해 수정하거나 세포내 FA 보유, 대사 또는 유출을 평가하기 위해 펄스 체이스 형식으로 조정할 수 있습니다.

다른 접근 방식과 비교할 때 이 방법은 확장 가능하고 정량적이며 다양한 FA 체인 길이에 적응할 수 있다는 뚜렷한 이점을 제공합니다. 또한 비용 효율적이고 몇 단계만 포함되며 일반적인 마이크로플레이트 리더보다 복잡하지 않은 장비가 필요하므로 학생을 포함한 신규 사용자가 이 프로토콜을 빠르게 마스터할 수 있습니다. 마지막으로, 누적 지질 함량을 반영하는 정성적 현미경 기반 방법 또는 Oil Red O와 같은 종점 염색과 달리 이 프로토콜은 고정이나 용해 없이 실시간 FA 흡수를 캡처합니다.

그럼에도 불구하고 몇 가지 제한 사항에 유의해야 합니다. 2D 정적 배양 시스템의 사용은 혈관 환경의 생리학적 복잡성을 완전히 요약하지 않습니다. 전단 응력 또는 LPL 매개 지방 분해와 같은 주요 요인은 물론 내피-실질 상호 작용도 이 단순화된 모델에는 없습니다. 미세유체 또는 오가노이드 기반 3D 공동 배양과 같은 고급 시스템은 더 큰 기술 전문 지식과 인프라가 필요하지만 생체 내 아키텍처 및 신호 전달을 더 잘 모방합니다16,17. 예를 들어, 미세유체 생물반응기는 EC가 미세혈관 형성을 모방하고 다른 조직 유형과 상호 작용할 수 있는 환경을 제공하여 연구자들이 보다 생리학적 환경에서 측분비 역학을 모델링할 수 있도록 합니다18. 또한, 최근 연구에 따르면 3D 하이드로겔 배양에서 라이브 형광 이미징을 수행하기 위한 특수 시스템을 개발할 수 있습니다19. 이러한 발전은 이 분석이 언젠가 생리학적으로 더 대표적인 세포 배양 시스템에 적용될 수 있다는 확신을 제공하지만 최적화를 수행해야 합니다.

요약하면, 이 분석은 다양한 조건에서 세포 FA 흡수를 조사하기 위한 유연하고 접근 가능하며 재현 가능한 플랫폼을 나타냅니다. 기계론적 시험관 내 연구에 가장 적합하지만, 이 시스템에서 얻은 통찰력은 내피 지질 수송의 보다 생리학적으로 관련된 모델을 사용하여 향후 작업에 정보를 제공할 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 존재하지 않는다고 선언했습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanisha Choudhury는 채플힐에 있는 노스캐롤라이나 대학교 학부 연구 사무국의 여름 학부 연구 펠로우십의 지원을 받았습니다. 김보아는 NHLBI(R56HL162660)와 AHA(24CDA1264317)의 지원을 받았습니다. Ayon Ibrahim은 Union College의 교수 연구 기금의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-하이드록시이소부티레이트 (3-HIB)케이맨 케미컬스26105양성 대조군, 최종 농도 5 또는 20 mM
96개의 웰 블랙, 투명 바닥 폴리스티렌 마이크로플레이트시그마-올드리치CLS3603-48EA도금 세포 분석을 위해
보디피 FL C12 (보디피-FA)써모피셔 사이언티브D3822녹색 형광 장쇄 지방산
보디피 FL C16 (보디피-FA)써모피셔 사이언티브D3821녹색 형광 매우 긴 사슬 지방산
소 혈청 알부민 용액시그마-올드리치A9205-50MLBodipy:BSA 복합체 준비에 사용됨
디메틸 설폭사이드 (DMSO)시그마-올드리치D2650의약품 용매
일회용 피펫팅 저장소VWR89094-680세포에 피펫팅할 다양한 용액을 담고 있습니다
둘벡코 수정된 독수리' s 미디엄코닝 생명과학10-013-CVEA.hy926 셀용 미디어
EA.hy926 세포ATCCCRL-2922 불멸화된 내피세포 하이브리드 계통
EGM-2 내피세포 성장 배지-2 불릿킷론자CC-3162HUVEC용 미디어
태아 소 혈청(FBS) VWR97068-085EGM-2와 DMEM에 10% 보충제
형광 마이크로플레이트 리더기다양한해당 없음형광 측정이 가능한 모든 마이크로플레이트 리더
젤라틴 용액시그마-올드리치G1393-100ml0.1% 작업 농도로 플레이트 코팅에 사용됩니다.
호에스트(Hoechst 33342) 솔루션생명과학62249세포 정규화를 위한 핵 염색(4 & μ; M)
인간 탯줄 정맥 내피세포(HUVECs)론자C2519A인간 1차 내피 세포
멀티채널 피펫VWR76627-76896웰 플레이트에 피펫팅을 할 때
니클로사마이드 밀리포어 시그마N3510-50G네거티브 컨트롤, 1 & 뮤; M  최종 집중
칼슘과 마그네슘 함유의 PBS피셔 사이언티브21031CV처리 준비 및 세척 완충제(BSA 사용)
칼슘과 마그네슘 없이 PBS제네시 사이언티브25-508젤라틴 희석, 호에스트 염색, 일반 세척
페니실린/스트렙토마이신써모피셔 사이언티브15140122EGM-2와 DMEM에 1% 보충제
나트륨 L-락테이트시그마-올드리치L7022-5G양성 대조군, 최종 농도 5 또는 20 mM
트라이판 블루 솔루션시그마-올드리치T8154-20ML0.08%에서 세포외 형광을 소광하기 위해 사용됩니다
진공 필터 시스템, 500ml PES 멤브레인, 0.45µ m젠클론25-227젤라틴 용액을 멸균하기 위해

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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