대규모 데이터 세트에 대한 사용자 친화적이고 강력한 R 분석

과학 분야에서 대규모 데이터 세트의 가용성이 높아짐에 따라 연구자가 이러한 대규모 데이터 세트를 정확하고 쉽게 신속하게 분석할 수 있도록 사용자 친화적인 도구를 개발하는 것이 중요합니다. 일반적인 대규모 데이터 세트의 한 가지 유형은 루시페라아제 유전자를 리포터로 사용하여 살아있는 세포와 유기체의 유전자 발현을 쉽고 지속적이며 비침습적으로 검사할 수 있게 해줍니다. 발광 기록의 자동화는 루시페라아제 발광 측정을 변화시켰고 특히 일주기 시계^{분야 1,2}에서 데이터 수집의 확장으로 이어졌습니다. 96웰 마이크로플레이트와 스태커가 있는 자동 플레이트 리더를 사용하여 루시페라아제 유전자를 발현하는 수천 개의 샘플을 시계열로 개별적으로 분석할 수 있으며, 때로는 며칠 동안 1시간 간격으로 한 번의 실험에서 분석할 수 있습니다. 이러한 고처리량 실험은 손 샘플 수집 후 RNA 처리를 사용하는 전통적인 유전자 발현 실험으로는 달성할 수 없는 대규모 데이터 세트를 생산하는 결과를 가져왔습니다. 이러한 대규모 데이터 세트를 적시에 분석하는 것은 중요하지만 어려울 수 있습니다.

리듬성에 대한 데이터를 분석하는 도구가 많이 존재하지만, 많은 도구는 발광 리포터 발현 ^3,4,5,6,7이 아닌 동물 행동 기반 분석을 분석합니다(보충 표 S1). 일부 도구에서는 연구자가 Python 기술 또는 MATLAB에 대한 액세스와 같은 사전 컴퓨터 프로그래밍 기술을 보유해야 합니다. 다른 도구는 소프트웨어 구매가 필요하며 비용이 많이 들 수 있습니다. 실행 가능한 일부 무료 솔루션은 온라인에서 사용할 수 있습니다. 그러한 도구 중 하나는 리듬 데이터를 분석하는 다양한 방법을 제공하는 BioDare2⁸입니다. BioDare2는 사용자 친화적인 온라인 도구이며 최소한의 계산 전문 지식이 필요합니다. 사용자는 추가 처리를 위해 입력된 데이터를 온라인으로 업로드하고 온라인 인터페이스에서 데이터 출력을 다운로드해야 합니다.

여기에서는 대규모 데이터 세트를 쉽게 분석할 수 있는 다양한 기능을 갖춘 사용자 친화적인 R 스크립트를 제시합니다. 우리는 R 및 Python용 인터페이스인 무료 오픈 소스 소프트웨어 RStudio⁹를 사용하여 스크립트를 실행합니다. RStudio는 Windows, Mac 및 Linux를 포함한 다양한 컴퓨터 시스템에서 사용할 수 있습니다. 이 보고서에서는 특히 프로토콜 섹션 1 및 2에서 R 스크립트를 사용하는 방법을 사용자에게 안내하는 자세한 단계별 지침이 제공됩니다. 이 방법을 사용하려면 사용자의 입력이 최소화됩니다. 사전 R 지식이 없고 프로그래밍 경험이 없는 초보자는 이 방법을 사용하여 루시페라아제 분석의 대규모 데이터 세트 또는 시계열 데이터가 있는 다른 유형의 데이터 세트를 분석할 수 있어야 합니다. 모든 입력 및 출력 데이터는 로컬 컴퓨터에 저장되므로 모든 관련 R 패키지를 처음으로 다운로드하면 인터넷 액세스의 제한 없이 어디서나 분석을 수행할 수 있습니다. 출력 데이터는 잘 구성된 폴더로 정렬되며 결과는 게시용으로 처리할 준비가 되어 있습니다. 통계 분석도 결과의 일부로 포함되어 샘플 간의 차이를 빠르게 평가할 수 있습니다. 따라서 R 방법은 대규모 데이터 세트를 분석하는 연구자에게 쉽고 강력한 솔루션을 제공할 수 있습니다.

1. 루시페라제 기반 일주기 시계 분석

1. 루시페라아제 분석을 위한 실험 설정
   참고: 루시페라제 분석은 일주기 시계 활동을 실시간으로 측정하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 살아있는 형질전환 유기체 및/또는 세포가 운반하는 루시페라아제 리포터에서 방출되는 발광은 자동으로 기록될 수 있어 대규모 시계열 데이터 세트를 생성할 수 있습니다. 우리 연구실에서는 주로 루시페라아제 유전자를 발현하는 애기장대 묘목을 리포터로 사용하고 있습니다. 그림 1 및 그림 2는 이전 설명²를 기반으로 수정된 당사 실험실에서 96웰 형식의 묘목을 사용한 루시페라제 분석을 위한 일반적인 실험 설정의 순서도를 보여줍니다.
   1. 3mL의 36% (w/w) HCl을 100mL 하우스 표백제에 3시간 동안 첨가하여 생성된 표백제 증기로 종자를 멸균합니다. 비커를 밀봉된 뚜껑이 있는 벨 항아리에 넣고 화학 흄 후드에 넣습니다. 멸균 후, 층류 캐비닛에서 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 0.5% 자당과 0.8% 한천(pH 5.7)을 포함하는 1/2MS 플레이트에 종자를 도금합니다. 화학 폐기물을 뚜껑이 있는 항아리에 모아 기관 환경 보건 서비스 부서와 협력하여 폐기하십시오.
   2. 플레이트를 4°C에서 2일 동안 두었다가 12시간 조명 및 12시간 암광 주기(LD)가 있는 조직 배양 챔버로 옮깁니다.
   3. 묘목이 LD에서 4일 동안 자라도록 합니다.
   4. 묘목을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에는 180μL의 분석 배지(1/2MS, 0.5% 자당, 0.4% 한천, 0.25mM 루시페린)가 포함되어 있습니다. 플레이트를 LD에 1일 동안 놓은 다음 24시간 동안 일정한 빛(LL)에 1일을 놓습니다.
   5. 웰에 처리 또는 모의 용액을 추가하고 LL에서 5-7일 동안 1시간 간격으로 발광을 기록합니다. 이득을 위해 방출 필터 렌즈를 3,600으로 설정하고 측정 간격 시간을 1초로 설정합니다.
      알림: 녹음 시작 시간은 언제든지 가능합니다. 그러나 R 스크립트는 정수(정수)만 사용하므로 기록 간격은 정수여야 합니다. 예를 들어, 1시간 간격은 허용되지만 R 스크립트에는 15분 간격이 허용되지 않습니다.
   6. 녹화가 끝나면 접시 사진을 찍어 묘목 성장을 기록합니다.
   7. 플레이트 리더용 데이터 분석 소프트웨어와 함께 다른 이름으로 저장 기능을 사용하여 R 분석을 위해 원시 데이터를 CSV 파일로 저장합니다.
2. 루시페라제 기반 일주기 데이터의 R 분석에 대한 단계별 설명
   참고: 이 R 분석은 R 스크립트를 사용합니다.보충 파일 1(LUC_2025.R), 일주기 데이터 분석을 위해 개발된 입력 파일보충 파일 2(NO7.csv). 입력 파일과 함께 R 스크립트는 온라인 저장소 플랫폼 Github(https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis)를 통해 공개적으로 사용할 수 있습니다.
   1. 컴퓨터 시스템 ^9,10과 호환되는 RStudio 소프트웨어를 다운로드합니다.
   2. 보충 파일 1(LUC_2025.R)에 필요한 RStudio 알고리즘 패키지를 다운로드합니다: MetaCycle¹¹: MetaCycle 패키지의 ARSER 알고리즘¹², ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, circular¹⁸, AICcmodavg¹⁹ 및 빗자루²⁰.
      참고: 패키지 목록은 R 스크립트의 맨 위도 참조하십시오.
   3. 사용자 입력 I을 변경합니다(작업 디렉토리, 입력 파일 이름, 처리 레이블 및 분석의 상대적 시작 시간을 포함하여 로컬 컴퓨터의 특정 데이터 세트에 따라).
      참고: 1.2.1 및 1.2.2단계는 한 번만 완료하면 됩니다. 그 후 RStudio 인터페이스 콘솔은 각각의 새 분석에 대한 수정과 함께 사용자 입력을 받을 준비가 됩니다. 사용자 입력 섹션에는 두 부분이 있습니다(보충 그림 S1).
      1. 작업 디렉터리를 선택합니다. 입력 파일이 있는 위치를 나타냅니다. 동일한 폴더가 출력 파일의 위치가 됩니다.
      2. R 스크립트에 대해 올바른 형식의 CSV 파일인 입력 파일을 선택합니다(그림 2B). 특히 맨 위 행에는 시계열이 있고 첫 번째 열에는 96웰 플레이트의 개별 샘플 위치가 포함되어 있습니다.
         참고: 이러한 입력 CSV 파일의 예는 보충 파일 2(NO7.csv)에서 찾을 수 있습니다.
      3. 샘플 및/또는 처리의 이름을 지정합니다. 이 분석은 시간 경과가 있는 96웰 설정에서 얻은 데이터에 사용되므로 플레이트당 총 12회 처리에 대해 처리당 8회 반복으로 실험을 설계하거나 플레이트당 최대 8회 처리에 대해 처리당 12회 반복으로 실험을 설계합니다. 샘플 수가 계산되므로 정확한 수의 샘플(8개 또는 12개)을 입력해야 합니다. 샘플 수가 8 또는 12가 아닌 경우 코드가 실행되지 않습니다. 그러나 빈 우물 행이 있는 경우 처리 이름 공간에 나열하기만 하면 됩니다(예: 빈 1, 빈 2로 이름 지정).
         참고: 샘플 이름의 경우 백슬래시나 유사한 기호를 사용하면 파일 이름 문제가 발생할 수 있으므로 사용하지 않아야 합니다. 또한 사용자 입력 II에서 ANOVA를 사용하도록 선택할 때 "NA"를 레이블로 사용하지 않아야 합니다. 정확히 같은 이름을 가진 모든 치료법은 하나의 큰 치료 그룹으로 결합됩니다.
      4. 분석의 상대 시작 시간을 나타냅니다. 주어진 날인 24시간 동안 주관적 새벽은 정상적인 빛/암흑 주기 동안 챔버 조명이 켜지는 때입니다. 예를 들어, 오전 7시에 불이 켜져 있다면 이 시간을 일주기 시간 0으로 생각하십시오. 루시페라아제 분석이 오전 9시에 시작되는 경우, 분석 시간은 일주기 시간 2입니다. 상대 시작 시간으로 2를 입력합니다.
         참고: 상대 시작 시간은 정수여야 하며 음수일 수 없습니다. 이는 샘플의 위상 판독값에 영향을 미칩니다.
   4. 특정 요구 사항에 따라 사용자 입력 II 옵션을 변경합니다.
      알림: 아래 지침은 사용자 입력 섹션에 대한 자세한 설명과 변경을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.
      1. 그래프를 포함합니다: 발광 곡선, 유전자형 및 치료별 기간, 위상 및 진폭에 대한 플롯.
      2. Tukey HSD와 함께 ANOVA 테스트를 사용하여 주기, 단계 및 진폭에 대한 치료를 비교합니다. ANOVA 테스트 출력에 대한 컨트롤을 선택합니다. ANOVA 검정에 대한 대조군을 지정하거나 옵션을 비워 두어 각 처리를 쌍별 비교에서 대조군으로 사용합니다. 또는 더 빠른 참조 및 구성을 위해 ANOVA 출력 파일에 번호를 매길지 여부를 선택합니다.
      3. t-검정을 사용하여 주기, 위상 및 진폭에 대한 치료를 비교합니다. t-검정이 쌍별 비교인지 여부를 선택합니다. 쌍별 t-검정을 선택한 경우 데이터가 쌍을 이루는지 여부를 선택합니다. t-검정에 대한 대조군을 선택합니다. t-검정에 대한 대조군을 지정하거나 옵션을 비워 두어 각 처리를 대조군으로 사용합니다. 더 빠른 참조 및 구성을 위해 t-검정 출력 파일에 번호를 매길지 여부를 선택합니다.
         참고: 이것은 SA 또는 Mock이 추가된 동일한 유전자형의 두 계통과 같이 한 번에 두 가지 치료를 비교하는 데만 사용해야 합니다. 표시된 p-값은 동일한 선과의 다중 비교를 설명하도록 조정되지 않습니다.
      4. 시점을 반올림할지 여부를 선택합니다. 시점이 한두 분만 벗어나면 가장 가까운 시간으로 반올림하고 이 분석을 사용합니다.
         알림: 이 코드는 ARS 방법¹²를 사용하여 주기, 위상 및 진폭을 계산합니다. 이 방법을 실행하려면 일관된 시계열(시간)이 필요합니다.
      5. 플레이트 리더가 웰을 기록하는 방법에 따라 입력을 읽는 방식을 변경합니다. A1, A2, A3에 의한 우물의 표준 데이터 목록 중 하나를 선택하십시오. 또는 A1, B1, C1에 나열된 우물에 대한 것...
   5. 콘솔의 오른쪽 상단 모서리에 있는 소스 버튼을 클릭하기만 하면 분석을 실행할 수 있습니다.
      참고: 분석을 완료하는 데 1분도 채 걸리지 않습니다. R 분석의 출력은 입력 데이터 세트와 동일한 파일 폴더에 자동으로 나타납니다.
   6. 출력 보기: 출력 폴더에는 각 유전자형 및/또는 처리의 반복에 대한 평균 기간, 단계 및 진폭에 대한 통계 정보를 포함하여 포괄적인 분석을 제공하는 여러 문서와 하위 폴더가 있습니다.
      참고: 입력 파일 보충 파일 2 (NO7.csv)의 경우, 프로토콜 섹션 1의 보충 파일 1 (LUC_2025.R) 스크립트에 의해 생성된 출력 문서의 목록이 표 1에 설명되어 있으며 보충 그림 S2의 트리 구조로 편리하게 볼 수 있다.

2. 루미놀 기반 ROS 분석

1. ROS 분석을 위한 실험 설정
   1. 생검 펀처로 25일 된 식물의 네 번째에서 일곱 번째 잎에서 직경 4mm의 잎 디스크를 자릅니다.
   2. 털이 많은 면이 위로 향하도록 잎 디스크를 96웰 플레이트에 100μL의 멸균수 위에 띄웁니다.
   3. 접시를 깨끗한 은박지로 덮고 밤새 LD 성장 챔버에 넣습니다.
   4. 물을 100 μL의 루미놀 용액(pH 7.4의 10 mM MOPS 완충액 및 1 μM flg22 또는 다른 유도체)에서 300 μM로 대체합니다. flg22 대신 모의 솔루션을 대조군으로 사용합니다.
   5. 즉시 40-60분 동안 매분 발광 판독값 기록을 시작합니다.
2. ROS 데이터의 R 분석에 대한 단계별 설명
   참고: 이 R 분석은 Rstudio, R 스크립트,  보충 파일 3(ROS_2025.R) 및 입력 파일 보충 파일 4(ROS_flg22.csv) 또는 보충 파일 5(ROS_elf26.csv)를 사용합니다. 입력 파일 ROS_flg22.csv(Supplemental File 4)와 함께 R 스크립트는 온라인 리포지토리 플랫폼 Github(https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)를 통해 공개적으로 사용할 수 있습니다.
   1. RStudio 패키지 다운로드: gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ 및 filesstrings¹⁷.
      참고: 2.2.1단계는 한 번만 완료하면 됩니다. 사용자가 컴퓨터의 특정 데이터 세트에 맞게 각 분석을 조정할 수 있도록 "사용자 입력"이라는 섹션이 만들어져 사용자가 실험에 대한 특정 매개변수를 표시할 수 있습니다(보충 그림 S3).
   2. 작업 디렉토리, 입력 파일 이름, 처리 레이블 및 분석의 상대적 시작 시간을 포함하여 로컬 컴퓨터의 특정 데이터 세트에 따라 사용자 입력 I을 변경합니다.
      1. 작업 디렉터리를 선택합니다. 입력 파일이 있는 위치를 나타냅니다. 동일한 폴더가 출력 파일의 위치가 됩니다.
      2. R 스크립트에 대해 올바른 형식의 CSV 파일인 입력 파일을 선택합니다(그림 2B). 특히 맨 위 행에는 시계열이 있고 첫 번째 열에는 96웰 플레이트의 개별 샘플 위치가 포함되어 있습니다.
         참고: 이러한 입력 CSV 파일의 예는 보충 자료인 보충 파일 4(ROS_flg22.csv) 또는 보충 파일 5(ROS_elf26.csv)에서 찾을 수 있습니다.
      3. 샘플 및/또는 처리의 이름을 지정합니다. 이 분석은 시간 경과가 있는 96웰 설정에서 얻은 데이터에 사용되므로 플레이트당 총 12회 처리에 대해 처리당 8회 반복으로 실험을 설계하거나 플레이트당 최대 8회 처리에 대해 처리당 12회 반복으로 실험을 설계합니다. 빈 우물 행이 있는 경우 처리 이름 공간에 나열하기만 하면 됩니다(예: 빈 1, 빈 2로 이름 지정).
         참고: 샘플 수가 중요하므로 정확한 수의 샘플(8개 또는 12개)을 입력하는 것이 중요합니다. 샘플 수가 8 또는 12가 아닌 경우 코드가 실행되지 않습니다. 샘플 이름의 경우 백슬래시나 유사한 기호를 사용하면 파일 이름 문제가 발생할 수 있으므로 사용하지 마세요. 또한 사용자 입력 II에서 ANOVA를 사용하도록 선택할 때 "NA"를 레이블로 사용하지 마십시오. 보충 파일 1(LUC_2025.R) 스크립트와 달리 동일한 이름의 처리는 이 보충 파일 3(ROS_2025.R) 스크립트에서 단일 그룹으로 결합되지 않습니다.
   3. 사용자의 특정 요구에 따라 사용자 입력 II 옵션을 변경합니다.
      참고: Examp사용자 입력은 보충 그림 S3에서 볼 수 있습니다.
      1. Tukey HSD와 함께 ANOVA 테스트를 사용하여 치료 발광 합계를 비교합니다.
      2. 양측 t-검정을 사용하여 한 번에 두 치료의 데이터를 비교합니다.
         참고: 표시된 p-값은 동일한 선과의 다중 비교를 고려하도록 조정되지 않았습니다.
      3. 형광 곡선과 형광의 총 합계를 비교하는 막대 플롯을 그래프로 표시합니다. 그래프에 평균의 표준 편차 또는 표준 오차를 추가합니다.
      4. 플레이트 리더가 웰을 기록하는 방법에 따라 입력을 읽는 방식을 변경합니다. A1, A2, A3의 우물 표준 데이터 목록을 사용하십시오. 또는 A1, B1, C1에 나열된 우물에 대한 것...
3. 콘솔의 오른쪽 상단 모서리에 있는 소스 버튼을 클릭하기만 하면 분석을 실행할 수 있습니다.
   참고: 분석을 완료하는 데 1분도 채 걸리지 않습니다. R 분석의 출력은 입력 데이터 세트와 동일한 파일 폴더에 자동으로 나타납니다.
4. 출력 보기: 출력 폴더에는 포괄적인 분석을 제공하기 위한 여러 문서와 하위 폴더가 있습니다.
   참고: 입력 파일 보충 파일 4(ROS_flg22.csv)의 경우, 프로토콜 섹션 2에 설명된 보충 파일 3(ROS_2025.R) 스크립트에 의해 생성된 출력 문서의 트리 구조가 보충 그림 S4에 나와 있습니다.

사례 연구 1. 애기장대 묘목을 이용한 일주기 시계 활동에 대한 발광 분석

우리는 이전에 GLYCINE-RICH RNA-BINDING PROTEIN 7(GRP7) 유전자가 마스터 시계 단백질 CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1(CCA1)에 의해 제어되고 GRP7의 일주기 발현이 야생형 GRP7 프로모터(pGRP7wt:LUC)의 제어 하에 루시페라아제 리포터를 발현하는 형질전환 Col-0 식물을 사용하여 식물 방어의 역할에 중요하다는 것을 보여주었습니다.21. 우리는 LUC_2025.R(프로토콜 섹션 1의 보충 파일 1)이라는 R 스크립트를 사용하여 대조 식물 CCA1:LUC/Col-0과 함께 이러한 형질전환 식물의 일주기 시계 활동을 분석했습니다.

NO7.csv(보충 파일 2)라는 입력 파일에는 7개의 독립적인 pGRP7wt:LUC 라인과 CCA1:LUC/Col-0 컨트롤(보충 파일 2(NO7.csv))에 대한 발광 판독값이 있습니다. 스크립트를 실행하면 입력 파일 NO7.csv(보충 파일 2(NO7.csv))과 동일한 폴더 아래에 NO7 output이라는 출력 하위 폴더가 생성됩니다. NO7 출력 폴더의 파일은 표 1에 설명되어 있으며 보충 그림 S2의 트리 구조로 편리하게 볼 수 있습니다. NO7 출력 폴더의 값은 그림 3과 그림 4를 만들기 위해 추가로 처리되었습니다. 그림 3은 CCA1:LUC 리포터가 3,000 RLU의 진폭, 23.5시간의 주기 및 3.5시간의 위상을 표시했음을 보여줍니다. 이러한 클럭 매개변수는 이전 보고서22,23과 대체로 일치합니다. pGRP7wt:Luc 계통에 대해 다른 발현 패턴이 관찰되었습니다. 모든 pGRP7wt:LUC 계통은 주기와 위상이 유사한 것으로 보였지만, 염색체에서 이식유전자의 위치 효과로 인해 이러한 계통의 진폭 값에는 차이가 있었습니다. 이러한 관측은 R 스크립트를 통해 주기, 진폭 및 위상 매개변수를 계산했을 때 추가로 확인되었습니다(그림 4). 이 분석을 검증하기 위해 일주기 데이터 분석을 위한 무료 온라인 플랫폼인 BioDare2를 사용하여 동일한 데이터 세트를 재분석했습니다8. R 분석의 결과는 BioDare2 FFT-NLLS(NLLS) 알고리즘 8,24에서 얻은 결과와 비슷했습니다(그림 4).

사례 연구 2. 포유류 세포를 이용한 일주기 시계 활동에 대한 발광 분석
R 스크립트 LUC_2025.R(보충 파일 1)은 포유류 세포에 의해 표시되는 일주기 시계 활동을 분석하기 위해 추가로 사용되었습니다25. 일주기 시계 리포터를 발현하는 U2 OS 세포주는 포유류의 일주기 시계 활동을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 모델 세포주입니다26,27. 96웰 플레이트에서 배양된 Per2d:Luc 리포터를 발현하는 U2 OS 세포로 생성된 시계열 데이터를 재분석했습니다. 세포는 특정 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자로 처리되었습니다. 도 5는 siRNA로 처리하지 않은 음성 대조군 세포가 23.3 시간의 기간, 2.8 시간의 위상 및 184.8 RLU의 진폭을 나타낸 것을 보여줍니다. 예상대로 CRY2 유전자를 표적으로 하는 siRNA는 진폭을 크게 약화시키고 리포터의 기간과 위상에 영향을 미쳤습니다. PSMD4 및 PSMD7 유전자는 단백질 분해를 위한 26S 프로테아좀 뚜껑 성분의 일부인 단백질을 암호화합니다. 이전 보고서25와 일치하게, R 분석은 각각의 siRNA에 의해 PSMD4 또는 PSMD7을 녹다운해도 클럭 매개변수에 영향을 미치지 않음을 보여줍니다. 따라서 이 R 스크립트는 일주기 시계 연구를 위한 다양한 실험 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다.

사례 연구 3. 방어 반응을 위한 ROS 분석
발광 일주기 시계 분석의 대규모 데이터 세트 외에도 R 스크립트를 다른 데이터 유형을 분석하도록 조정할 수 있습니다. 여기에서는 활성 산소종(ROS)을 정량화하기 위한 응용 프로그램 중 하나를 제시합니다. 식물은 병원균 침입에 맞서기 위해 다양한 전략을 진화시킨 것으로 알려져 있습니다. 전략 중 하나는 병원체에서 비자가 분자를 인식하고 이후에 선천적 면역 반응을 활성화하는 것입니다. 이러한 초기 면역 반응 중 하나는 숙주가 비자가 분자를 만났을 때 몇 분 이내에 발생하는 ROS 버스트입니다. 일반적인 ROS 분석은 처리당 유전자형당 12개의 잎 디스크를 포함하는 96웰 플레이트로 수행되었습니다(프로토콜 섹션 2). 여기서, 두 개의 공통 유도체 분자, 박테리아 편모 단백질28의 보존된 영역에서 유래된 22-아미노산 펩타이드인 flg22 및 신장 인자 Tu 단백질29로부터의 26-아미노산 펩타이드인 elf26을 사용하여 ROS 버스트를 유도했습니다. 스크립트인 Supplemental File 3 (ROS_2025.R)은 ROS 데이터 분석을 위해 개발되었습니다. R 분석 형식으로 변환된 ROS 분석의 두 CVS 파일인 보충 파일 4 (ROS_flg22.csv) 및 보충 파일 5 (ROS_elf26.csv)는 보충 재료 섹션에서 다운로드할 수 있습니다. R 분석 후, 출력 폴더는 통계 분석과 함께 분석 시간 동안의 ROS 버스트 곡선 및 총 ROS 값을 포함하는 자신의 컴퓨터의 각 입력 파일과 동일한 폴더에 생성되어야 합니다(보충 그림 S4). 데이터는 그림 6을 만들기 위해 추가로 처리되었습니다. 여기에 표시된 결과는 수동으로 처리된 결과와 유사합니다30.

그림 1: R 분석을 위한 루시페라제 분석의 흐름도. 클럭 프로모터에 의해 구동되는 루시페라아제 리포터를 발현하는 묘목을 멸균하고 LD의 1/2 MS 배지에서 4일 동안 성장시켰습니다. 묘목을 D-루시페린을 함유하는 180μL의 1/2 MS 배지를 포함하는 96웰 플레이트로 옮겼습니다. 각 우물에는 묘목 한 그루가 들어 있었습니다. LD에서 1일 후 LL에서 1일 후, 플레이트 리더로 발광을 기록했습니다. 플레이트 위의 묘목은 일반적으로 5-7일 동안 1시간 간격으로 LL에서 발광을 위해 기록되었습니다. 기록 후 묘목 성장을 평가하기 위해 플레이트를 촬영하고 원시 데이터를 R 분석을 위해 CSV 파일로 저장했습니다. 약어: LD = 12시간 밝음/12시간 어두움; LL = 일정한 빛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 발광 데이터 수집 및 R 분석의 순서도. ( A) R 스크립트를 사용한 일주기 시계 분석을 위한 5단계 절차가 요약되어 있습니다. 1 단계. 유전자형 및/또는 처리당 8개 또는 12개의 묘목으로 실험을 설정합니다. 2 단계. 5-7일 동안 1시간 간격으로 LL에서 발광을 기록합니다. 3 단계. CSV 파일로 데이터를 가져오고 형식을 지정합니다. 4 단계. R을 사용하여 데이터를 분석합니다. 및 5단계. 출력 데이터를 봅니다. 녹화 시작 시간은 언제든지 가능합니다. 그러나 R 스크립트는 정수(정수)만 사용하므로 기록 간격은 정수여야 합니다. (B) R 스크립트에 맞게 올바르게 형식화된 입력 CSV 파일의 스크린샷입니다. 원본 입력 파일 NO7.csv는 보충 파일 2에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 형질전환 식물에서 pGRP7wt:LUC의 일주기 발현. pGRP7wt:LUC의 발광 흔적이 표시됩니다. x축 아래의 막대는 주관적인 낮(열린 막대)과 밤(회색 막대)을 나타냅니다. 각 유전자형의 발광 흔적은 평균 12회 반복입니다. 많은 수의 곡선으로 인해 오차 막대가 표시되지 않았습니다. 약어: RLU = 상대 발광 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: R 스크립트와 BioDare2의 출력 데이터 비교. 그림 3에 표시된 것과 동일한 데이터 세트를 R 스크립트와 BioDare2로 일주기 시계 매개변수, 진폭, 주기 및 위상에 대해 분석했습니다. 데이터는 SEM± 평균을 나타냅니다(n=12). 다른 문자는 샘플 간의 유의미한 차이를 나타냅니다(P < 0.05; 사후 Tukey의 HSD 테스트를 사용한 일원 분산 분석). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 포유류 세포를 사용한 일주기 시계 활동 분석. DD의 96웰 플레이트에서 배양된 Per2dLuc 리포터를 발현하는 U2 OS 세포로 생성된 시계열 데이터는 이전에 설명되었습니다 25. CRY2, PSMD4 또는 PSMD7을 표적으로 하는 siRNA 분자를 사용하여 세포를 처리했습니다. ( A) 발광 흔적. ( b) per2d:Luc의 진폭, 주기 및 위상. 데이터는 SEM± 평균을 나타냅니다(n = 3). 패널(B)의 다른 문자는 음성 대조군과 siRNA 처리 샘플 사이의 유의미한 차이를 나타냅니다(P<0.05; 사후 Tukey의 HSD 테스트를 사용한 일원 분산 분석). 약어: RLU = 상대 발광 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: R에 의한 ROS 버스트 분석. 묘목은 1μM flg22(왼쪽) 또는 1μM elf26(오른쪽)으로 처리한 직후 상대 발광 단위에 대해 기록되었습니다. ( A) 유도 후 시간 경과에서 유전자형당 12마리의 묘목(n = 12)에서 평균적으로 나온 발광 흔적. 처리당 유전자형당 평균값은 R 출력의 일부입니다. ( B) flg22 또는 elf26 처리로 각 유전자형에 대한 평균 총 발광 수. 데이터는 SEM± 평균을 나타냅니다(n = 12). 다른 문자는 샘플 간의 유의미한 차이를 나타냅니다(P < 0.05; 사후 Tukey의 HSD 테스트를 사용한 일원 분산 분석). 약어: RLU = 상대 발광 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: R 분석의 출력 문서 목록입니다. LUC_2025.R 스크립트(보충 파일 1)와 입력 파일 NO7.csv(보충 파일 2)에 의해 생성된 출력 문서 목록입니다.

보충 그림 S1: 프로토콜 섹션 1의 입력 I 및 입력 II에 대한 스크린샷. 사용자 입력 I은 로컬 컴퓨터의 특정 데이터 세트에 맞게 분석을 조정하도록 변경해야 합니다. 사용자 입력 II에 대한 변경은 실험 설정에 따라 선택 사항입니다. 보충 파일 1 (LUC_2025.R) 스크립트는 선택되거나 사용된 웰뿐만 아니라 모든 웰이 파일에 있을 것으로 예상한다는 점에 유의해야 합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: 출력 문서의 트리 구조. 이 출력은 LUC_2025.R 스크립트(보충 파일 1)와 입력 파일 NO7.csv(보충 파일 2)를 사용하여 생성되었습니다. LUC_2025.R 스크립트는 입력 파일 이름을 기반으로 출력 폴더를 생성합니다. 출력 파일에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. 상자는 파일 폴더를 나타냅니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S3: 프로토콜 섹션 2의 사용자 입력 I 및 사용자 입력 II에 대한 스크린샷. 보충 파일 3 (ROS_2025.R) 스크립트는 보충 파일 1 (LUC_2025.R) 스크립트와 동일한 일반 입력 형식을 사용합니다. 사용자 입력 I은 로컬 컴퓨터의 특정 데이터 세트에 맞게 분석을 조정하도록 변경해야 합니다. 사용자 입력 II에 대한 변경은 실험 설정에 따라 선택 사항입니다. 보충 파일 3 (ROS_2025.R) 스크립트는 선택되거나 사용된 웰뿐만 아니라 모든 웰이 파일에 있을 것으로 예상한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S4: 출력 문서의 트리 구조. 이 출력은 ROS_2025.R 스크립트(보충 파일 3)와 입력 파일 ROS_flg22.csv(보충 파일 4)를 사용하여 생성되었습니다. ROS_2025.R 스크립트는 입력 파일 이름을 기반으로 출력 폴더를 생성합니다. 해당 폴더 안에는 Total ROS Counts 파일과 그래프 파일이 있습니다. PRISM 및 그래프 데이터, ANOVA 테스트 및 t-테스트를 위한 하위 폴더도 있습니다. 상자는 파일 폴더를 나타냅니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: 일주기 데이터 분석에 사용할 수 있는 생물정보학 도구 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: LUC_2025.R. 이것은 일주기 시계 데이터를 분석하는 데 사용되는 R 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: NO7.csv. 이것은 일주기 시계 데이터의 예를 포함하는 입력 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: ROS_2025.R. ROS 데이터를 분석하는 데 사용되는 R 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: ROS_fig22.csv. 이것은 ROS 데이터의 예가 포함된 입력 파일입니다. ROS는 1μM flg22 처리에 의해 유도되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 5: ROS_elf26.csv. 이것은 ROS 데이터의 예가 포함된 입력 파일입니다. ROS는 1μM elf26 처리에 의해 유도되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.