세 가지 방법론의 비교 분석을 사용하여 암세포 증식에 대한 SASP 요인의 영향 평가

요약

이 연구는 실시간 모니터링이 가능한 3가지 시험관 내 모델을 사용하여 노화 HeLa 세포의 노화 관련 분비 표현형(SASP) 인자가 비노화 HeLa 세포에 미치는 증식 효과를 평가합니다. 암에서 세포-세포 상호작용을 더 잘 이해하기 위해 각 방법의 장점과 한계를 체계적으로 비교했습니다.

초록

화학 요법으로 유발된 노화 암세포는 또한 세포외 미세 환경을 조절하기 위해 노화 관련 분비 표현형이라고 하는 다양한 인자를 분비합니다. 이전 연구에서는 이러한 SASP 인자가 증식, 상피-중간엽 전이(EMT), 혈관신생 및 이동 촉진을 포함하여 주변 세포에 해로운 측분비 효과를 발휘한다고 보고했습니다. 여러 시험관 내 공동 배양 기술은 동일하고 다른 유형의 세포를 함께 배양하여 상호 작용으로 인한 세포 과정을 이해하는 데 널리 사용됩니다. 여기서, 노화 HeLa 세포가 비노화 HeLa 세포에 의해 분비되는 SASP 인자의 잠재적 증식 효과를 세 가지 보완적인 시험관 내 접근법을 사용하여 조사했습니다. 첫 번째 접근법은 SASP에 의해 매개되는 측분비 신호 전달을 조사하기 위해 노화 세포와 비노화 세포를 공동 배양하는 것을 포함했습니다. 두 번째 접근법에서는 노화 암세포에서 수집된 조건화 배지를 농축한 후 증식의 실시간 모니터링과 함께 조건화된 배지의 영향을 조사하는 데 사용했습니다. 세 번째 방법에서는 노화 세포와 비노화 세포를 나란히 배양하여 직접적인 세포 간 접촉을 통해 SASP의 주치 효과를 평가했습니다. 세 가지 실험 모델 모두 SASP 인자가 노화되지 않은 암세포의 증식을 크게 향상시킨다는 것을 일관되게 입증했습니다. 특히, 노화 세포 공동 배양은 증식률을 64.6% 증가시켰고, 3x 농축 SASP 조절 배지는 대조군에 비해 증식을 50% 이상 증가시켰습니다. 형광 기반 이미징은 juxtacrine 조건에서 GFP 양성 세포 수가 49.3% 증가한 것으로 나타났습니다. 이러한 방법은 SASP로 인한 증식 변화에 대한 정량적 및 정성적 평가를 종합적으로 가능하게 했습니다. 이러한 접근법의 비교 분석은 각각의 강점과 한계를 강조하여 노화 세포의 측분비 효과에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

서론

다세포 유기체에서 세포는 미세 환경과 메시지를 교환함으로써 측분비 및 주접 신호 전달을 통해 통신하여 서로의 행동에 영향을 미칩니다. 이러한 통신은 터널링 나노튜브와 갭 접합을 통해 직접적으로 발생하거나 사이토카인, 성장 인자 및 케모카인과 같은 가용성 화학 분자가 세포외 기질로 분비되어 간접적으로 발생할 수 있습니다. 이러한 신호 전달 메커니즘은 조직 발달 및 면역 세포 반응을 포함한 다양한 생리적 과정을 조절하는 데 필수적인 역할을 하며 암, HIV, 고혈압 및 알츠하이머병과 같은 수많은 질병의 발병기전에도 관련되어 있습니다¹.

1960년대에 Leonard Hayflick은 정상적인 인간 섬유아세포가 시험관 내에서 복제하는 능력이 제한되어 있음을 발견했습니다 ². 텔로머라제 단축으로 인해 발생하는 이러한 제한된 세포 증식 상태를 복제 노화라고 합니다. 후속 연구에서는 다양한 형태의 세포 스트레스도 세포 노화를 유발할 수 있음을 밝혔습니다. 화학 요법 및 방사선 요법과 같은 일반적인 암 치료도 치료 유발 노화라고 하는 암과 간질 세포 모두에서 세포 노화를 유도하는 것으로 확인되었습니다 ^3,4. 세포 노화와 노화는 계층적으로 관련된 과정입니다. 그들은 뚜렷한 생물학적 과정을 나타냅니다. 유기체에 노화 세포가 축적되면 염증, 조직 기능 장애 및 노화 관련 질병의 발병을 촉진하여 노화에 기여합니다. 그러나 노화는 노화에 비해 훨씬 더 광범위한 전신 사건과 메커니즘을 포함합니다⁵.

노화 세포는 확장된 세포질이 정상 세포에 비해 훨씬 더 크고 편평한 형태를 갖는 것이 특징입니다⁶. 이러한 노화 세포는 리소좀 활성이 증가했으며 산성 pH 6.0에서도 활성을 유지하는 리소좀 효소인 노화 관련 β-갈락토시다제(SA-β-gal) 활성에 대해 양성입니다. SA-β-gal 염색은 노화 세포를 검출하는 데 가장 널리 사용되는 바이오마커입니다⁷. 핵의 확대 및 불규칙한 형태는 노화를 겪고 있는 세포에서 흔히 관찰됩니다. 또한, 이러한 세포는 비가역적 세포 주기 정지를 매개하는 노화 관련 이색소 병소(SAHF)라고 하는 독특한 염색질 재배열을 특징으로 합니다 ^8,9.

노화 암세포는 궁극적으로 증식 능력을 잃었지만 생존 가능하고 대사적으로 활발했습니다. 노화 세포는 또한 노화 관련 분비 표현형(SASP)^10,11이라고 하는 세포외 종양 미세 환경을 조절하기 위해 다양한 인자를 분비하는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 SASP 인자에는 가용성 신호 전달 인자(인터루킨, 케모카인 및 성장 인자), 분비된 프로테아제 및 분비된 불용성 단백질/세포외 기질(ECM) 성분이 포함됩니다. 종합적으로, 이러한 요인은 암세포 증식, 이동, 침범 및 상피-중간엽 전이(EMT^{) 유도} 촉진을 포함하여 해로운 측분비 효과를 발휘합니다^4,12. 또한, 화학 요법으로 인한 부작용은 부분적으로 노화 세포의 축적에 기인합니다¹³. 따라서 노화 세포와 비노화 세포 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 암 치료의 맥락에서 중요한 연구 분야가 되었습니다. 특히 SASP 인자, 특히 그 구성과 암 미세 환경에 미치는 영향에 대한 분석은 암 치료를 위한 새로운 표적 분자를 식별하고 이러한 분자에 대한 신약을 발견하기 위한 유망한 전략으로 간주됩니다.

시험관 내 공동 배양 기술은 세포 간 상호 작용에 대한 이해를 연구하기 위해 오랫동안 사용되어 왔습니다¹⁴. 이 방법론적 기사의 목적은 세 가지 다른 방법을 사용하여 비노화 암세포에 대한 노화 세포에서 분비된 인자의 가능한 증식 활성을 평가하는 것이었습니다. 또한 세 가지 다른 방법에서 얻은 결과를 비교하고 각 접근 방식의 각각의 장단점을 비판적으로 평가했습니다.

먼저, 실시간 세포 분석 시스템⁽¹²)을 이용하여 암세포 증식의 가능한 변화를 실시간으로 모니터링하기 위해 노화 HeLa 세포와 비노화 HeLa 세포 사이에 공동 배양 모델을 구축하였다. 이 시스템은 세포-세포 상호 작용을 평가하기 위한 두 개의 플레이트로 구성됩니다. 하부 층을 형성하는 e-플레이트 보기에는 플레이트 바닥에 미세 전극이 배치된 표적 세포가 시딩된 표면이 있습니다. 이 표면에 표적 세포가 부착되어 생성되는 전기 저항은 측정 가능한 매개변수 세포 지수(CI)로 표현됩니다. CI 값은 세포 수와 표면에 대한 접착 정도에 비례합니다¹⁵. 또한 e-plate 보기를 통해 위상차 현미경으로 세포의 형태학적 검사를 수행할 수 있습니다. 상층을 형성하는 e-플레이트 인서트는 이펙터 셀이 시딩되는 영역입니다. 이 플레이트의 바닥은 0.4μm 기공 크기의 반투막으로 덮여 있습니다. 이펙터 세포에서 분비된 인자는 멤브레인을 통과하여 전자판 보기에서 표적 세포에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 상호 작용이 세포 증식을 자극하면 CI 값의 증가로 관찰됩니다. 따라서 세포 간의 상호 작용을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

두 번째 방법에서는 노화 HeLa 세포에서 수집된 컨디셔닝 배지를 농축하여 비노화 HeLa 세포에 첨가했습니다. 이러한 세포에 대한 잠재적인 증식 효과는 실시간 세포 분석 시스템을 사용하여 모니터링되었습니다.

세 번째 방법에서는 노화 HeLa 세포와 비노화 GFP-HeLa 세포를 직접 2D로 공동 배양하고 암세포의 증식 변화를 현미경으로 실시간으로 모니터링할 계획이었습니다.

이 실험의 목표는 노화 HeLa와 비노화 HeLa 세포 간의 상호 작용을 연구하고 암세포 증식의 가능한 변화를 실시간으로 모니터링하기 위해 세 가지 모델을 설정하는 것입니다. 따라서 노화 암세포에서 분비되는 SASP 인자가 다른 암세포에 미치는 영향을 쉽게 조사할 수 있습니다. 이에 따라 세 가지 접근 방식의 장점과 한계를 체계적으로 평가하였다.

프로토콜

참고: 모든 세포 배양 절차는 인증된 안전 캐비닛 내에서 생물안전 수준 II+(BSL2+) 조건에서 수행되었습니다. 독소루비신은 위험한 화학요법제입니다. 모든 절차는 실험실 가운 및 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하여 인증된 생물 안전 레벨 II+(BSL2+) 캐비닛에서 수행해야 합니다. 배지 및 고정제를 포함하여 독소루비신이 포함된 모든 폐기물은 지정되고 명확하게 라벨이 붙은 유해 폐기물 용기에 수거하고 기관 유해 폐기물 관리 시스템을 통해 폐기해야 합니다.

1. 모델 1: 실시간 세포 분석 시스템을 이용한 공동 배양

1. 세포 배양 및 노화 유도(1-2일)
   1. 10% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 5mL의 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)이 들어 있는 T25 배양 플라스크에 8 x 10⁵ HeLa 세포를 시드하고 5%_CO2가 포함된 가습 분위기에서 37°C에서 세포를 배양합니다.
   2. 다음날, 세포의 배지를 5mL의 신선한 완전 배지로 교체합니다. 세포 노화를 유도하기 위해 배지에 첨가하여 300nM 독소루비신으로 세포를 직접 처리합니다. T25 플라스크를 37°C에서 5% CO₂ 가 포함된 인큐베이터에서 72시간 동안 유지합니다.
2. 비노화 세포 파종(4일)
   1. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 DMEM 5mL에 새로운 T25 플라스크에 8 x 10 5개의^{처리되지 않은} HeLa 세포(비노화 대조군)를 시종하고 5% CO₂로 37°C의 가습 인큐베이터에 유지합니다.
3. 노화 유도 확인(5일차)
   1. 72시간의 독소루비신 치료가 노화를 유도했는지 여부를 결정하기 위해 SA-β-gal 염색을 수행합니다⁶. 주요 실험에 사용되지 않는 별도의 세포 세트에 대해 이 분석을 수행합니다. 얻은 결과는 그림 1A,B를 참조하십시오.
   2. 노화성 암 HeLa 세포의 조절된 배지에서 IL-6을 측정하여 분비 활성을 평가합니다. 독소루비신으로 세포를 72시간 동안 처리한 후 무혈청 및 페놀 레드 프리 배지에서 추가로 2일 동안 배양합니다. 수집된 컨디셔닝 배지를 세포 번호로 정규화하고 IL-6 수준을 측정합니다.
      참고: IL-6은 SASP¹²의 특징적인 사이토카인입니다. IL-6 측정 결과는 그림 1C에 나와 있습니다.
4. 실시간 세포 분석 시스템 설정(5일차)
   1. 세포 파종 전에 실시간 세포 분석 시스템의 전원을 켭니다. RTCA 소프트웨어 2.0을 실행합니다. Exp Notes 버튼(그림 2)을 클릭하고 실험 세부 정보를 입력합니다.
   2. 스케줄 버튼을 클릭하고 두 단계를 추가합니다. 첫 번째 단계는 배경입니다. 두 번째 단계는 72시간 동안 15분마다 세포 증식을 모니터링하는 것입니다.
   3. 첫 번째 단계를 선택하고 재생을 클릭하여 e-플레이트 보기의 각 웰에 50 μL의 완전 배지를 추가하여 배경 임피던스를 기록합니다.
5. e-플레이트 보기에 세포 시딩(5일차)
   1. 세포를 파종하기 전에 10배 배율을 사용하여 위상차 현미경으로 독소루비신 처리(노화) 및 처리되지 않은(비노화) HeLa 세포를 모두 확인합니다. 현미경으로 보면 노화 세포는 정상 세포보다 훨씬 더 커진 형태를 가지고 있습니다.
   2. 노화 및 비노화 HeLa 세포를 5mL의 멸균 예열 PBS로 세척한 다음 흡인합니다.
   3. 예열된 0.05% 트립신 1mL를 넣고 플라스크를 37°C에서 2분 동안 유지하여 세포를 분리합니다. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 완전 DMEM 5mL로 트립신을 중화합니다.
   4. 실온에서 10분 동안 세포를 500 x g 으로 원심분리하고, 상청액을 버리고, 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 완전 DMEM 5mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   5. 혈구측정기를 사용하여 트리판 블루 염료 배제 방법을 사용하여 생존 세포를 계산합니다.
   6. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 완전한 100μL의 DMEM에 1개의 e-플레이트 뷰의 각 웰에 5 x 10^{3 세포} /웰의 밀도로 비노화 HeLa 세포를 시드합니다.
   7. e-플레이트 뷰를 실시간 세포 분석 시스템의 크래들에 놓아 세포가 인큐베이터의 플레이트 표면에 부착될 수 있도록 합니다.
   8. 일정 버튼에서 두 번째 단계를 선택하고 재생 버튼을 클릭하여 RTCA 소프트웨어 2.0을 사용하여 72시간 동안 임피던스 측정을 시작합니다(그림 2).
6. e-플레이트 인서트에 세포 시딩
   1. 하나의 e-플레이트에 있는 종자 세포는 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 60μL의 완전 DMEM에 웰을 삽입합니다.
   2. 세 가지 다른 실험 설정에서 e-플레이트 인서트에 세포를 시드: 그룹 1(음성 대조군): 시딩된 세포 없음(배지만 해당)
      그룹 2: 2 × 10 4개의 비노화 HeLa 세포
      그룹 3: 1 × 10⁵ 노화 HeLa 세포
   3. 부착을 위해 5% CO₂ 가 포함된 인큐베이터에서 37°C에서 6시간 동안 e-플레이트 인서트를 유지합니다.
7. 공동 배양 세포
   1. 세포 시딩 6시간 후 일시 중지 를 클릭합니다. e-플레이트 보기의 각 웰에서 배양 배지를 부드럽게 흡인하여 혈청 및 비부착 세포를 제거합니다.
   2. 37°C에서 예열된 PBS로 웰을 2회 세척합니다. e-플레이트 보기의 각 웰에 140μL의 무혈청 DMEM을 추가합니다.
   3. e-플레이트 인서트를 가져와 배양 배지를 흡인합니다. 37°C에서 PBS로 웰을 2회 부드럽게 세척하고 무혈청 DMEM 60μL를 첨가합니다.
   4. 전자 플레이트 인서트를 전자 플레이트 보기에 배치하고 인서트가 웰에 완전히 안착될 때까지 부드럽게 누릅니다.
   5. 결합된 플레이트를 실시간 세포 분석 시스템에 삽입하고 재생 을 클릭하여 소프트웨어를 사용하여 15분 간격으로 세포 지수 값의 실시간 모니터링을 재개합니다(그림 2).
   6. 실험 시간이 끝나면 실시간 세포 분석 시스템을 끕니다(그림 3A).
8. e-플레이트 인서트의 이미징 셀
   참고: e-플레이트 인서트 웰에 멤브레인이 있기 때문에 여기에 시딩된 세포는 위상차 현미경을 사용하여 멤브레인에서 시각화할 수 없습니다. 따라서 세포가 실험이 끝날 때까지 생존력을 유지했는지, 노화 세포가 구조적 완전성을 보존하는지 여부를 테스트하기 위해 DAPI로 염색했습니다(그림 3B).
   1. e-플레이트 보기에서 e-플레이트 인서트를 제거합니다. DAPI로 전자 플레이트 삽입물의 세포를 염색하고 형광 현미경¹⁶에서 세포의 존재를 확인합니다. 노화 세포의 핵은 정상 세포의 핵보다 큰 것으로 알려져 있습니다. 따라서 DAPI로 염색된 세포의 핵 크기에 따라 어떤 웰이 비노화 세포로 파종되었고 어느 웰이 노화 세포로 파종되었는지 결정합니다.
9. e-플레이트 보기에서 세포 이미징
   1. 10배 배율을 사용하여 위상차 현미경으로 e-플레이트 보기를 직접 검사합니다(그림 3B). e-플레이트 보기에서 각 웰의 중앙에서 4줄의 미세전극 센서가 제거되었기 때문에 현미경으로 세포 모니터링을 가능하게 하는 공간 6이 생성되었습니다.
10. 데이터 분석
    1. e-plate 보기와 e-plate 인서트가 결합되어 실시간 셀 분석 시스템에 삽입되는 시점에서 CI 값을 정규화합니다.
    2. 데이터 분석 버튼을 클릭하여 실시간 세포 분석 시스템에서 얻은 최대 세포 지수 및 기울기 데이터를 사용하여 증식률과 양을 계산합니다(그림 2). 그런 다음 적절한 통계 프로그램을 사용하여 데이터를 분석합니다(그림 3C,D).

2. 모델 2: 실시간 세포 분석 시스템을 이용한 컨디셔닝 배지 처리 분석

1. 세포 배양 및 노화 유도(1-2일)
   1. 10% 태아 소 혈청(FBS), 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 2.5mL의 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 포함하는 6웰 플레이트의 각 웰에 35 x 10⁴ HeLa 세포를 시드하고 5%_CO2가 포함된 가습된 분위기에서 37°C에서 세포를 배양합니다.
   2. 다음날, 세포 배지를 2.5mL의 신선한 완전 배지로 교체합니다. 세포 노화를 유도하기 위해 배지에 첨가하여 300nM 독소루비신으로 세포를 직접 처리합니다. 6-웰 플레이트를 37°C에서 5% CO₂ 가 있는 인큐베이터에서 72시간 동안 유지합니다.
2. 비노화 세포 파종(4일)
   1. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 2.5mL의 DMEM에 새로운 6웰 플레이트의 각 웰에 35 x 10 4개의^{처리되지 않은} HeLa 세포(비노화 대조군)를 시드하고 5% CO₂로 37°C의 가습 인큐베이터에 유지합니다.
3. 1.3단계에서 설명한 대로 노화 유도 확인을 수행합니다.
4. 노화 및 비노화 HeLa 세포로부터 컨디셔닝 배지의 제조
   1. 독소루비신 처리 세포(노화 세포)와 처리되지 않은 HeLa 세포(비노화 세포)를 위상차 현미경으로 모두 확인합니다. 현미경으로 보면 노화 세포는 정상 세포보다 훨씬 더 커진 형태를 가지고 있습니다.
   2. 두 개의 6웰 플레이트(노화 및 비노화 HeLa 세포) 모두에서 배양 배지를 흡인합니다. 37°C에서 예열된 PBS로 세포를 2회 세척하여 잔류 혈청과 세포 파편을 제거합니다.
   3. 페니실린(100U/mL)과 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 무혈청 DMEM 2mL를 각 웰에 추가합니다. 5% CO₂ 와 함께 37°C의 가습 인큐베이터에서 세포를 48시간 동안 배양합니다.
5. 컨디셔닝 배지 수집 및 농축(7일차)
   1. 각 웰에서 컨디셔닝된 배지를 층류 안전 캐빈의 멸균 튜브로 수집합니다.
   2. 세포를 트립신화하고 혈구측정기를 사용하여 트리판 블루 염료 배제 방법을 사용하여 세포를 계수하여 조건화된 배지를 세포 수로 정규화합니다.
   3. 멸균 2mL 튜브에 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 무혈청 DMEM을 사용하여 세포 수에 따라 정규화된 컨디셔닝된 배지를 최종 부피 2mL로 조정합니다.
   4. 수집된 컨디셔닝된 배지를 4°C에서 10분 동안 1,000 x g 로 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후 4°C에서 10분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 정화된 상청액을 얻습니다.
   5. 2mL 초원심 필터 장치를 사용하여 4°C에서 3,000 x g 에서 60분 동안 원심분리하여 농축합니다. 이 절차는 2mL 컨디셔닝 배지를 농축된 컨디셔닝 배지 400μL의 5배로 농축합니다.
   6. 얻은 40μL의 컨디셔닝 배지를 신선한 무혈청 배지로 희석하여 층류 안전 캐빈의 멸균 튜브에 1x, 2x 및 3x 농축 컨디셔닝 배지를 준비합니다.
      참고: 세포에 48시간 동안 남아 있는 배지는 세포 소비로 인해 고갈되기 때문에 수집 및 농축된 컨디셔닝된 배지는 이후에 새로운 배지로 희석됩니다.
6. e-plate 보기로 세포 시딩
   1. 1.1-1.4단계에 설명된 대로 실시간 세포 분석 시스템을 설정합니다. 비노화 HeLa 세포를 예열된 PBS로 세척한 다음 흡인합니다.
   2. 예열된 0.05% 트립신 1mL를 넣고 플라스크를 37°C에서 2분 동안 유지하여 세포를 분리합니다. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 완전 DMEM 5mL로 트립신을 중화합니다.
   3. 실온에서 10분 동안 세포를 500 x g 으로 원심분리하고, 상청액을 버리고, 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 완전 DMEM 5mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   4. 혈구측정기를 사용하여 트리판 블루 염료 배제 방법을 사용하여 생존 세포를 계산합니다.
   5. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 200μL의 완전 DMEM에 1개의 e-플레이트 뷰의 각 웰에 5 x 10³ cells/well의 밀도로 비노화 HeLa 세포를 시드합니다.
   6. e-플레이트 뷰를 실시간 세포 분석 시스템의 크래들에 놓아 세포가 인큐베이터의 플레이트 표면에 부착될 수 있도록 합니다.
   7. 일정 버튼에서 두 번째 단계를 선택하고 재생 버튼을 클릭하여 RTCA 소프트웨어 2.0을 사용하여 임피던스 측정을 시작합니다(그림 2). 비노화 HeLa 세포를 도금 6시간 후 소프트웨어에서 일시 중지 버튼을 클릭합니다(그림 2).
   8. e-플레이트 보기의 각 웰에서 배양 배지를 부드럽게 흡인하여 혈청 및 비부착 세포를 제거합니다. 37°C에서 예열된 PBS로 웰을 2회 세척합니다.
   9. 예열된 컨디셔닝된 배지를 37°C로 적절한 그룹에 추가합니다.
      그룹 1: 신선한 미디어
      그룹 2: 1x 비노화 HeLa 세포 컨디셔닝 배지
      그룹 3: 2x 비노화 HeLa 세포 컨디셔닝 배지
      그룹 4: 3x 비노화 HeLa 세포 컨디셔닝 배지
      그룹 5: 1x 노화 HeLa 세포 조절 배지
      그룹 6: 2x 노화 HeLa 세포 조절 배지
      그룹 7: 3x 노화 HeLa 세포 컨디셔닝 배지
   10. e-플레이트 보기를 실시간 세포 분석 시스템에 삽입하고 재생 을 클릭하여 48시간 동안 15분 간격으로 세포 지수 값의 실시간 모니터링을 재개합니다(그림 2).
   11. 실험 시간이 끝나면 실시간 세포 분석 시스템을 끕니다(그림 4A).
7. e-플레이트 보기에서 세포 이미징
   1. 위상차 현미경으로 10배 배율로 e-플레이트 보기를 직접 검사합니다(그림 4B). e-plate 보기에서 각 웰의 중앙에서 4줄의 미세전극 센서가 제거되었기 때문에 마이크로소피에 의한 세포 모니터링이 가능한 공간이 생겼습니다.
8. 데이터 분석
   1. 농축된 컨디셔닝 배지가 비노화 HeLa 세포에 투여된 시점에서 CI 값을 정규화합니다.
   2. 데이터 분석 버튼을 클릭하여 실시간 세포 분석 시스템에서 얻은 최대 세포 지수 및 기울기 데이터를 사용하여 증식률과 양을 계산합니다(그림 2). 그런 다음 적절한 통계 프로그램을 사용하여 데이터를 분석합니다(그림 4C,D).

3. 모델 3: 세포-세포 상호 작용의 실시간 모니터링

1. 세포 배양 및 노화 유도(1-2일)
   1. 10% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 5mL의 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)이 들어 있는 T25 배양 플라스크에 8 x 10⁵ HeLa 세포를 시드하고 5%_CO2가 포함된 가습 분위기에서 37°C에서 세포를 배양합니다.
   2. 다음날, 세포의 배지를 5mL의 신선한 완전 배지로 교체합니다. 세포 노화를 유도하기 위해 배지에 첨가하여 300nM 독소루비신으로 세포를 직접 처리합니다. T25 플라스크를 37°C에서 5% CO₂ 가 포함된 인큐베이터에서 72시간 동안 유지합니다.
2. 비노화 세포 파종(4일)
   1. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 DMEM 5mL의 새로운 T25 플라스크에 8 x 10⁵ GFP-HeLa 세포(비노화 대조군)를 시드하고 5% CO₂로 37°C의 가습 인큐베이터에 유지합니다.
   2. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 DMEM 5mL에 새로운 T25 플라스크에 8 x 10⁵ HeLa 세포(비노화 대조군)를 시드하고 5% CO₂로 37°C의 가습 인큐베이터에 유지합니다.
3. 1.3단계(5일)에 설명된 대로 노화 유도 확인을 수행합니다.
4. 공동 배양 세포
   1. 세포를 파종하기 전에 독소루비신 처리된 세포, 처리되지 않은 GFP-HeLa 및 처리되지 않은 HeLa 세포를 위상차 현미경으로 확인합니다. 현미경으로 보면 노화 세포는 정상 세포보다 훨씬 더 커진 형태를 가지고 있습니다.
   2. 3개의 T25 플라스크를 모두 5mL의 멸균 예열 PBS로 세척한 다음 흡인합니다. 예열된 0.05% 트립신 1mL를 넣고 플라스크를 37°C에서 2분 동안 유지하여 세포를 분리합니다.
   3. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 완전 DMEM 5mL로 트립신을 중화합니다.
   4. 실온에서 10분 동안 세포를 500 x g 으로 원심분리하고, 상청액을 버리고, 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 완전 DMEM 5mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   5. 혈구측정기를 사용하여 트리판 블루 염료 배제 방법을 사용하여 생존 세포를 계산합니다. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100U/ml) 및 스트렙토마이신(0.1μg/mL)이 보충된 완전 DMEM 200μL의 종자 세포.
   6. 세 가지 다른 실험 설정에서 μ-슬라이드 8웰 높이에 세포를 시드합니다.
      그룹 1: 7 x 10³ GFP-HeLa 세포
      그룹 2: 18 x 10³ 개의 비노화 HeLa 세포 + 7 x 10³ 개의 GFP-HeLa 세포
      그룹 3: 18 x 10³ 노화 HeLa 세포 + 7 x 10³ GFP-HeLa 세포
   7. 5% CO₂가 있는 인큐베이터에서 37°C에서 부착하기 위해 μ-슬라이드를 8시간 동안 유지합니다. 8시간 후, 세포에 대한 혈청의 영향을 제거하기 위해 예열된 PBS(37°C)로 세포를 2회 세척합니다.
   8. 페니실린(100U/mL)과 스트렙토마이신(0.1μg/mL)을 함유한 무혈청 DMEM 200μL를 각 웰에 첨가합니다.
5. 현미경 설정
   1. 온도 컨트롤러와 CO₂-컨트롤러를 켜고 스테이지 탑 배양 시스템이 30분 동안 안정화되도록 합니다.
   2. CO₂ 농도 및 온도 설정을 수동으로 확인하고 생리학적 조건(5% CO₂, 37°C)에 도달했는지 확인하십시오.
   3. 도립 형광 현미경을 켜고 시스템이 자체 교정을 완료하도록 합니다. 형광 광원을 켭니다. 이미징 및 분석 소프트웨어를 실행하여 이미징 매개변수 및 이미지 획득을 제어합니다.
6. 타임랩스 이미징
   1. 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 도립 형광 현미경의 스테이지 상단 배양 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 소프트웨어를 열고 파트 X, Y, Z 및 T 모드를 선택하고 획득 설정에서 실험을 단계화합니다(그림 5A).
   2. 형광 및 위상차 이미징을 위해 고대비의 20x 대물렌즈를 선택합니다(그림 5A). 위상차 및 형광(FITC 필터) 채널을 추가하여 두 모드 모두에서 이미징을 가능하게 합니다(그림 5A).
   3. 라이브 버튼을 클릭하여 살아있는 세포 이미징을 시작한 다음 위상차 하에서 세포에 초점을 맞춥니다(그림 5A). z-스택 창을 열고 관심 세포의 위치를 표시합니다(노화/비노화 HeLa 세포 및 GFP HeLa 세포 모두 포함). 자동 스테이지 컨트롤러를 사용하여 웰 사이의 스테이지를 탐색하여 위치 표시를 위해 선택한 영역의 정확한 위치를 허용합니다(그림 5A).
      참고: 이러한 방식으로 슬라이드의 동일한 웰에서 둘 이상의 영역을 선택할 수 있습니다.
   4. 채널을 형광 채널로 전환하여 형광 이미징을 시작합니다. 적절한 노출(89.506ms), 게인(10) 및 강도(136) 설정을 설정합니다(그림 5A).
      참고: 이러한 매개변수는 형광 단백질을 발현하는 세포의 형광 강도에 따라 다릅니다.
   5. μm z-스택 간격을 선택하고, 상단 및 하단 위치를 설정하고, 위상차 아래에서 z-스택을 구성합니다(그림 5A). 중지를 클릭하여 라이브 옵션을 닫습니다.
   6. 타임랩스 이미징을 위한 지속 시간 및 시간 간격 필드를 사용하여 지속 시간(48시간)과 시간 간격(30분)을 설정합니다.
   7. 시작을 클릭하여 48시간 동안 이미징을 시작합니다(그림 5A). 48시간 후에 프로젝트를 저장합니다(그림 5A).
   8. 각 시점(0시간 및 48시간)에서 z-스택에서 최상의 프레임을 선택하고 이미지를 내보냅니다(그림 5A).
   9. 0시간 및 48시간에 GFP 양성 세포를 계산하고, GFP 양성 세포의 증가율을 계산하고, 적절한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 데이터를 분석합니다(그림 1D,E).
7. 동영상 생성
   1. 갤러리 표시를 클릭하여 시점 및 z-스택 레이어별로 구성된 캡처된 모든 이미지를 표시합니다(그림 5B).
   2. 각 시점에 대해 해당 z-스택에서 가장 초점이 맞춰진 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Select Thumbs in a Row를 선택합니다. 선택한 프레임을 저장합니다(그림 5B).
   3. 각 위치에 대해 이 과정을 개별적으로 반복합니다. 가장 초점이 맞춰진 이미지를 선택하려면 가장 초점이 맞춰진 프레임 찾기 기능을 사용하십시오. 선택한 프레임 저장 옵션을 통해 선택한 이미지를 저장합니다. 저장된 이미지는 프로젝트 열기 섹션에 자동으로 업로드됩니다.
   4. 동영상을 우클릭하고 이미지 시퀀스가 완전히 로드되면 이미지 내보내기(Export Image) 를 선택합니다.
   5. 내보내기 창에서 동영상 탭으로 이동하여 원하는 프레임 속도(초당 프레임 수)를 설정하고 필요한 경우 배율 막대, 타임스탬프 등과 같은 추가 옵션을 선택한 다음 찾아보기 옵션을 사용하여 대상을 선택하여 내보내기를 완료합니다(그림 5B, 비디오 1, 비디오 2 및 비디오 3).

결과

이 대표적인 실험 세트는 노화 암세포에서 파생된 노화 관련 분비 표현형이 다른 암세포에 미치는 잠재적 영향을 조사했습니다. 따라서 72시간 동안 독소루비신으로 치료하면 SA-β-Gal 염색을 이용하여 HeLa 세포에서 노화를 유도할 수 있는지 여부를 먼저 확인하였다. 노화 세포에서 리소좀 효소 β-갈락토시다아제는 낮은 pH에서도 활성 상태를 유지하고 발색 기질 X-gal을 절단하여 파란색 침전물을 형성합니다¹⁷. 따라서 파란색으로 염색된 세포의 존재는 세포 노화의 유도를 나타냅니다. 독소루비신 치료는 대조군에 비해 HeLa 세포에서 통계적으로 유의미한 노화 유도를 가져왔고, p < 0.0001. (그림 1A,B, n=3). 형태학적 분석은 또한 노화 세포가 대조군 세포에 비해 더 크고 납작한 외관을 나타낸 것으로 나타났습니다.

토론

미세 환경에서 암세포의 동적 상호 작용은 종양 진행에 매우 중요하며, 이는 전이 유도 및 이차 종양 발생에 영향을 미칩니다. 또한 노화암과 간질 세포는 노화 세포에서 분비되는 인자를 통해 종양 미세 환경을 조절하는 것으로 보고되었습니다⁴. 이러한 인자는 세포 증식, 이동, 침범, 분화를 자극하고 다제내성을 증가시킵니다 ^4,13. 따라서 주변 암세포에 대한 SASP의 영향을 이해하는 것은 종양 미세 환경을 이해하는 데 필수적입니다.

본 연구에서는 비노화 암세포에서 SASP 인자의 가능한 증식 활성을 세 가지 다른 방법을 사용하여 평가했습니다. 첫 번째 방법에서, 이 시스템은 세포 지수 값을 추적하여 세포 증식을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. e-플레이트 보기를 사용하면 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
µ-슬라이드 8 우물 높이	비디	80806
0.05% 트립신-EDTA (1배)	깁코	25300-054
아미콘 울트라 원심 필터 유닛 (울트라셀-3K)	밀리포어	UFC200324
CO2 인큐베이터 (37° C, 5% CO2)	산요
CO2-컨트롤러 2000	Pecon
DMEM	깁코	41966-029
독소루비신	토크리스	2252
E-플레이트 삽입 16번과 nbsp;	ACEA 바이오사이언스/애질런트	6 465 382 001
E-플레이트 뷰 16	ACEA 바이오사이언스/애질런트	300 601 140
FBS	깁코	A5256701
헬라 셀	AP 연구소, 앙카라, 터키	HÜ KÜ K No: 90061901
라이카 DMi8 역형 형광 현미경	라이카
인산염 완충 식염수(PBS)	깁코	70011-044
노화 관련 &베타;-갈락토시다제(SA-β-gal) 염색 키트	세포 신호 전달	9860S
스테이지 상단 인큐베이션 시스템	Pecon
온도 조절기 2002-2	Pecon
트라이판 블루 다이	시그마	T8154
xCELLigence RTCA DP 시스템	ACEA 바이오사이언스/애질런트