방법 논문

Phos-tag SDS-PAGE 겔 전기영동 및 시험관 내 키나아제 분석을 사용한 인산화 변형 공개

DOI:

10.3791/68884

⸱

2025년 8월 8일

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Medical School of Nanjing University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 임상 샘플 및 시험관 내 키나아제 분석에서 Phos-tag 겔 전기영동을 사용하여 표적 단백질의 인산화 변형의 변화를 검출하는 절차를 설명합니다.

초록

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인산화는 단백질 기능을 조절하는 고전적인 번역 후 변형입니다. 단백질에는 일반적으로 여러 잠재적 인산화 부위가 포함되어 있으며, 이는 서로 다른 위치에서 다양한 키나아제에 의해 변형될 수 있습니다. 질병에서 표적 단백질의 인산화 변화를 연구하려면 종종 인산 특이적 항체가 필요합니다. 그러나 상용 옵션은 단일 사이트로 제한되거나 완전히 사용하지 못할 수 있습니다. 여기서, Phos-tag 겔 전기영동을 이용하여 임상 시료에서 표적 단백질의 인산화 변형의 변화를 검출하고, 시험관 내 키나아제 분석을 통해 상세한 인산화 부위를 식별하는 방법을 설명한다. Phos-tag에 결합된 인산화 단백질은 SDS-PAGE 겔 전기영동에서 더 느린 이동 속도를 나타내므로 천천히 이동하는 밴드의 평균 픽셀 강도를 기반으로 질병 조직의 인산화 변화를 반정량적으로 분석할 수 있습니다. Phos-tag SDS-PAGE를 여러 후보 단백질에 대한 범 특이적 항체를 사용하는 면역블로팅과 결합함으로써 연구자들은 인산화 변화가 있는 표적 단백질을 효율적으로 식별할 수 있습니다. 후보 키나아제를 스크리닝한 후, 표적 단백질로 시험 관 내 키나아제 분석을 수행하고, 생성된 인산화 생성물을 정확한 부위 식별을 위해 질량 분석법을 거칩니다. 이 방법은 특정 인산화 단백질 항체가 필요하지 않으므로 조직 샘플을 대규모로 스크리닝하여 질병에서 변경된 인산화 상태를 식별할 수 있습니다. 또한, 확인된 인산화 부위는 질병 조직의 정량 및 국소화 분석을 위한 특정 항체를 개발하는 데 사용될 수 있으며, 이는 기능적 역할에 대한 더 깊은 통찰력을 제공합니다.

서론

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인산화는 단백질의 세포내 국소화, 키나아제 활성 및 전사 활성을 조절하기 위한 핵심 번역 후 변형입니다. 인간 게놈에서 500개 이상의 단백질 키나아제 유전자가 발견되었으며, 이는 신호 전달, 유전자 발현 및 단백질-단백질 상호 작용에 관여합니다1. 인산화 및 탈인산화는 다양한 키나아제의 제어 하에 있으며, 이는 세포 접착, 세포 증식 및 세포 분화를 조절하기 위해 빠르게 가역적입니다2. 그러나 비정상적인 단백질 인산화 변형은 종양 형성, 자가면역 질환, 신경변성 및 난임력을 포함한 많은 인간 질병의 원인이 됩니다 3,4,5.

임상 표본의 인산단백질체학 프로파일링은 여러 후보 차등적으로 인산화된 단백질을 산출합니다6. 인간 질병의 주요 인산화 변형을 밝히기 위해서는 특정 표적 단백질의 인산화 상태를 검출하는 쉽고 효율적인 방법이 필요합니다. 서로 다른 부위의 인산화는 단백질의 뚜렷한 기능적 변화를 초래할 수 있습니다. 따라서 특정 아미노산 부위를 표적으로 하는 인산화 특이적 항체를 사용하는 것이 의심할 여지 없이 단백질 인산화의 변화를 검출하는 가장 좋은 방법입니다. 그러나 잘 특성화된 인산 특이적 항체는 많은 단백질에 대해 없습니다. 또한 새로운 잠재적 인산화 부위를 식별하기 위해서는 보다 적합한 접근 방식이 필요합니다. 특정 아미노산 잔기에서의 인산화는 종종 겔 전기영동에서 단백질의 이동 속도를 변경하며, 느리게 이동하는 밴드는 인산화 상태의 변화를 반영할 수 있습니다7. 그러나 이러한 이동성 변화는 일반적으로 미묘하여 구별하기 어렵습니다. Phos-tag는 알칼리성 포스파타제 촉매 도메인을 모델로 하여 설계된 합성 화합물로, 인산화된 Ser/Thr/Tyr 및 His/Asp/Lys 잔기를 포집할 수 있습니다. 따라서, 포스-태그 접합은 인산화 단백질과 비인산화 단백질 사이의 이동 속도 차이를 효과적으로 증폭시키는 동시에 인산화 부위 수의 변화를 구별한다8.

조직 샘플에서 표적 단백질 인산화 변화를 검출하기 위한 이 Phos-tag 기반 방법론은 기존 접근 방식에 비해 뚜렷한 이점을 제공합니다. 결정적으로, 인산 특이적 항체에 대한 요구 사항을 제거하고 대신 검출을 위해 표준 WB 등급 단백질 특이적 항체를 활용합니다. 표적 단백질의 인산화 및 비인산화 형태는 Phos-tag SDS-PAGE 동안 별개의 밴드로 분해되어 비교 밴드 강도 분석을 통해 질병 상태의 인산화 수준 변화를 반정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜의 워크플로에는 (1) 단백질 샘플의 Phos-tag SDS-PAGE 분리, (2) 인산화된 표적에 대한 면역블롯 스크리닝, (3) phospho-Ser/Thr 항체로 검증된 후보 키나아제를 사용한 시험관 내 키나아제 분석이 포함됩니다. 후속 질량 분석 분석(외부 서비스 플랫폼에서 수행)은 부위 특이적 항체 개발을 가능하게 하는 인산화 부위를 식별합니다. 자세한 방법론은 현재 프로토콜에 포함되어 있지 않습니다. 특히, 이 접근법은 임상 샘플에서 Nur77 인산화 변화를 검출하는 데 성공적으로 적용되었으며, Mst1 키나아제를 Nur77 인산화의 업스트림 조절자로 식별하고 Nur779의 트레오닌 366에서 인산화를 임상적으로 검출하기 위한 부위 특이적 인효소를 개발했습니다. 따라서 이 접근법은 상업적으로 이용 가능한 항체를 사용하여 수많은 표적에 걸쳐 인산화 상태 변화를 대규모로 스크리닝할 수 있기 때문에 여러 후보 단백질을 조사할 때 예비 연구 단계에서 특히 가치가 있음이 입증되었습니다.

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프로토콜

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난징 드럼 타워 병원의 임상시험심사위원회는 인체 연구를 승인했다(2013-408081-01). 현재 프로토콜은 자궁내막 조직을 대표 모델로 사용하여 설정되었습니다. 적절한 최적화를 통해 이 방법론은 단백질 추출 및 후속 분석을 위한 종양 조직을 포함하되 이에 국한되지 않는 다른 임상 표본으로 확장될 수 있습니다. 자궁내막 생검은 가임 여성(대조군)과체외 수정-배아 이식을 받는 재발성 배아 착상 실패 여성(질병군)의 중간 분비 단계에서 시행됩니다. 모든 환자는 샘플링 절차 전에 정보에 입각한 동의를 제공했습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 샘플 준비

  1. 얻은 신선한 조직 샘플을 예식된 PBS로 두 번 헹구어 혈액 세포를 제거하고 약 100mg의 조직을 1.5mL 원심분리기 튜브로 분리합니다.
  2. 조직 단백질 용해 완충액 1mL(150.0mmol/L NaCl, 1.0% NP-40, 50.0mmol/L Tris pH 8.0, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 프로테아제 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제 칵테일 2 및 3)가 들어 있는 2mL 둥근 바닥 분쇄 튜브에 조직을 넣습니다.
  3. 고속 조직 분산기의 속도를 레벨 5(6단계 중)로 설정하고 조직을 10초 동안 분쇄한 후 얼음 위에서 30초 동안 배양합니다. 이 과정을 5회 반복하여 조직 균질을 얻습니다.
  4. 쉐이커에서 30분 동안 셰이커에서 천천히 회전하여 균질을 용해한 다음 4°C에서 13,000× g 에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 수집합니다.
  5. BCA 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.
  6. 총 300μg의 단백질을 취하여 동일한 부피로 조정한 다음 4× Laemmli 단백질 샘플 완충액과 혼합합니다. 혼합물을 95°C에서 8분 동안 가열하고 실온으로 냉각한 다음 추가 분석을 위해 로드하여 혼합물을 변성시킵니다.
    참고: 2단계 전에 발현 수준을 평가하기 위해 총 항체를 사용하여 관심 단백질을 검출하기 위해 기존의 웨스턴 블로팅 분석이 권장됩니다.

2. Phos-tag SDS-PAGE 겔의 겔 제조

  1. 아크릴아미드 29.0g과 N'-메틸렌-비아크릴아미드 1.0g을 첨가하여 100mL 30% w/v 아크릴아미드/N'-메틸렌-비아크릴아미드 혼합 용액을 준비합니다.
    알림: 어두운 곳에서 4°C로 보관하십시오.
  2. 기존 SDS-PAGE에 사용되는 1.5 mol/L Tris-HCl 용액(pH 8.8), 0.5 mol/L Tris-HCl 용액(pH 6.8), 10% w/v SDS 용액 및 10% w/v 암모늄 과황산염 용액을 준비합니다.
  3. Phos-tag SDS-PAGE 겔에 특이적인 5.0mmol/L Phos-tag 용액 및 10mmol/L MnCl2 용액을 준비합니다.
  4. 50 μM Phos-tag 용액 및 100 μM MnCl2가 포함된 6 w/v% 폴리아크릴아미드 겔로 10 mL 용액을 제조하는 경우, 2 mL 30%(w/v) 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 혼합 용액, 2.5 mL 1.5 mol/L Tris/HCl 용액(pH 8.8), 0.1 mL 5.0 mmol/L Phos-tag 용액, 0.1mL 10mmol/L MnCl2 용액, 0.1mL 10%(w/v) SDS 용액, 10μL TEMED 및 증류수 5.14mL.
  5. 준비된 분해 겔 용액을 부드럽게 소용돌이쳐 균질성을 확보한 다음 젤 용액 튜브를 진공 데시케이터에 넣고 눈에 보이는 기포가 남지 않을 때까지 2분 동안 진공(0.1MPa)을 가합니다.
  6. 50μL의 10% 과황산암모늄을 넣고 부드럽지만 철저히 혼합합니다.
  7. 짧은 플레이트의 상단 가장자리 아래 ~1cm에 도달할 때까지 조립된 젤 카세트에 용액을 즉시 피펫팅합니다. 거품을 유입하지 마십시오.
  8. 젤 위에 0.5mL의 증류수를 조심스럽게 겹쳐 공기를 차단하고 평평한 인터페이스를 보장합니다. 실온에서 20-30분 동안 중합을 허용합니다.
  9. 동시에, 0.6mL 30%(w/v) 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 혼합 용액, 1mL 0.5mol/L Tris-HCl 용액(pH 6.8), 40μL 10%(w/v) SDS 용액, 4μL TEMED 및 증류수 2.33mL를 혼합하여 표준 Tris-HCl 완충 스태킹(4.5% w/v 폴리아크릴아미드 겔) 겔 용액을 준비합니다. 부드럽게 소용돌이치고 가스를 제거합니다.
  10. 겔이 완전히 응고되었는지 확인합니다(젤 카세트를 기울여 중간 계면의 부동성을 확인하면서 상부 액체층의 기울기를 관찰합니다). 물 오버레이를 조심스럽게 부은 다음 완전히 배수하십시오.
  11. 준비된 스태킹 겔 용액에 10% 과황산암모늄 20μL를 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 즉시 분해 겔 위에 피펫팅합니다.
  12. 기포가 생기지 않도록 10웰 또는 15웰 빗을 스태킹 젤 용액에 조심스럽게 넣습니다. 스태킹 겔을 실온에서 10분 동안 중합시키십시오.
    알림: 항상 사용 직전에 젤을 준비하십시오. 관심 있는 각 단백질에 대해 Phos 태그 및 아크릴아미드 농도를 최적화하십시오.

3. Phos-tag SDS-PAGE의 전기영동

  1. 전기영동 장비를 조립하고 전극 챔버를 기존의 Tris/Glycine/SDS Running Buffer로 채웁니다.
  2. 마이크로피펫을 사용하여 30μg의 단백질 샘플을 각 웰에 로드합니다.
  3. 브로모페놀 블루가 분해 겔의 바닥에 도달할 때까지 정전류 조건(30mA/겔)에서 전기영동을 수행합니다.
  4. 겔을 메탄올이 없는 SDS-PAGE 전사 완충액에 5mM EDTA와 함께 10분 동안 2회 담가 2가 양이온을 제거합니다.
  5. 습식/탱크 블로팅 시스템을 사용하여 90V 동안 90V에서 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다.

4. 면역블로팅 및 분석

  1. 탈지유 또는 소 혈청 알부민 분말(1×Tris-Borate-Sodium Tween-20 용액, TBST로 희석)의 5% 용액으로 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 차단합니다.
  2. 표적 단백질에 대한 1차 항체를 적절한 비율로 희석하고 멤브레인과 함께 4°C에서 밤새 배양합니다.
  3. 멤브레인을 TBST로 3회, 세척당 10분, 실온에서 부드럽게 교반합니다.
  4. 멤브레인을 HRP-접합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  5. 멤브레인을 TBST로 3회, 세척당 10분, 실온에서 부드럽게 교반합니다.
  6. 강화된 화학발광 기질과 함께 어둠 속에서 1분 동안 배양한 후 노출시킵니다.
  7. 자동화된 겔 문서화 시스템을 사용하여 이미지를 캡처하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 그레이스케일 강도에 대한 표적 밴드(느리게 이동하는 인산화 표적 단백질 및 빠르게 이동하는 인산화되지 않는 표적 단백질)를 정량화합니다.
    참고: Phos-Tag 겔의 웨스턴 블롯은 분자량 할당을 수행하는 데 사용할 수 없습니다.
  8. 각 샘플에 대해 천천히 이동하는 인산화 밴드와 빠르게 이동하는 비인산화 밴드의 비율을 계산하고 그룹 간 인산화 비율의 통계적 차이를 분석합니다.

5. 표적 단백질의 면역침전

  1. 표적 단백질의 FLAG-tagged (또는 HA, GFP, GST 또는 His를 포함하되 이에 국한되지 않는 대체 에피토프 태그) 야생형 또는 부위 특이적 인-돌연변이를 암호화하는 발현 플라스미드를 구축한다.
  2. 제조업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 3000을 사용하여 발현 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시킵니다.
  3. 1단계에서 설명한 대로 1mL 조직 단백질 용해 완충액에 세포를 용해하여 단백질 상청액을 추출합니다.
  4. 상청액을 20μL의 Anti-FLAG M2 친화성 겔과 함께 4°C에서 회전하면서 밤새 배양합니다.
  5. 원심분리(1000× g, 3분)하고 아가로스 비드를 수집한 다음 10컬럼 부피의 TBS로 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 제거합니다.
  6. TBS에 FLAG 펩타이드를 최종 농도 100μg/mL로 용해시킵니다.
  7. 5-10분 동안 5-10분 동안 5개의 단일 컬럼 용량의 FLAG 펩타이드 용액(20μL 아가로스 비드에 100μL 용액 사용)으로 경쟁적 용출하여 항-FLAG M2 친화성 겔에서 결합된 FLAG 융합 단백질을 용리합니다.
  8. 원심분리(1000 × g, 3분)하고 상청액을 수집합니다.
    참고: 키나아제가 알려진 경우 6단계로 진행합니다. 그렇지 않으면 6단계를 계속하기 전에 먼저 효모 2잡종 스크리닝 또는 생물정보학 예측(예: PhosphositePlus 또는 그룹 기반 예측 시스템 사용)을 통해 잠재적인 키나아제를 식별합니다.

6. 인산화된 아미노산을 식별하기 위한 시험관 내 키나아제 분석

  1. 키나아제 완충액 준비(반응당 30μL): 40mM HEPES pH7.6, 10mM MgCl2, 1mM EGTA, 1mM DTT, 2.5mM β-글리세로인산염, 200μM ATP, 활성 키나아제 100ng, 면역침전형 FLAG 융합 단백질.
  2. 30°C에서 30분 동안 열혼합기에서 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
  3. 10 μL 4× Laemmli 완충액을 첨가하여 반응을 중지하고 95°C에서 5분 동안 변성시킵니다.
  4. 활성 키나아제 유무에 관계없이 반응한 면역침전된 FLAG 융합 단백질을 사용하여 기존의 SDS-PAGE 전기영동을 수행합니다.
  5. 인산화된 아미노산을 식별하기 위해 Anti-phospho-Thr 항체 및 Anti-phospho-Ser 항체로 프로브합니다. Anti-Flag 항체를 대조군으로 사용하여 프로브합니다( 재료 표 참조).
  6. 4단계에서 설명한 대로 면역블로팅 및 분석을 완료합니다.

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결과

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대조군과 질병군의 인간 샘플에 대한 예비 인산단백질체학적 프로파일링은 Nur77을 차등적으로 인산화된 단백질 후보로 확인했습니다. Nur77 단백질 인산화 검출에 있어 Phos-tag SDS-PAGE의 효능을 평가하기 위해 Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE 실험을 수행했습니다. 조직 샘플에서 총 단백질을 추출한 후, 30μg의 단백질을 로딩하고 Mn2+-Phos-태그 겔 전기영동으로 분리한 다음 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. 면역블로팅은 Nur77 1차 항체에 이어 HRP 접합 항토끼 2차 항체를 사용하여 ECL 화학발광에 의해 검출하여 수행되었습니다. 두 개의 뚜렷한 띠가 관찰되었습니다(그림 1A). 더 빠르게 이동하는 밴드(아래)는 인산화되지 않은 Nur77을 나타냅니다. 느리게 이동하는 밴드(위쪽)는 인산화된 Nur77을 나타냅니다. 반정량적 분석은 대조군에 비해 불임 그룹에서 인산화 대 비인산화 Nur77 비율이 유의하...

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토론

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임상 조직에서 표적 단백질의 인산화 변화를 검출하기 위한 Phos-tag 기반 접근법은 단백질 인산화 연구에 상당한 이점을 제공합니다. 인산화된 단백질은 Phos-tag 결합으로 인해 감소된 전기영동 이동성을 나타내므로 인산 특이적 항체 없이도 후보 단백질의 인산화 상태를 고처리량 스크리닝할 수 있습니다. 이는 여러 후보 단백질의 초기 대규모 프로파일링에 특히 유용합니다. 변경된 인산화 변형이 있는 단백질은 특정 인산화 부위를 식별하기 위한 후속 시험관 내 키나아제 분석을 위해 우선 순위를 지정할 수 있습니다.

Phos-tag SDS-PAGE의 시료 전처리는 기존 웨스턴 블로팅과 유사하지만 몇 가지 중요한 기술적 고려 사항에 유의해야 합니다. EDTA는 Phos-tag 기능에 필수적인 Mn2+ 또는 Zn2+ 이온을 킬레이트화하므로 시료 처리 중에 EDTA 함유 시약...

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공개 사항

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저자는 잠재적인 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 중국 국가자연과학재단(82271698)과 장쑤성 자연과학재단(BK20231117)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% SDS 솔루션Sangon BiotechB548118
10x Tris/Glycine/SDSBIO-RAD
1610732 4×   Laemmli 단백질 샘플 완충액BIO-RAD1610747
아크릴아미드Sangon BiotechA601032
과황산암모늄Sangon BiotechA100486
Anti-FLAG M2 친화성 젤MilliporeA2220
강화 화학발광 키트ThermoFisher32106
FLAG 항체CST14793
깃발  펩타이드밀리포어F3290
HRP 접합 2차 항체Bioworld 기술BS13278
리포펙타민 3000ThermoFisherL3000015
Mini Trans-Blot CellBIO-RAD1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellBIO-RAD1658005
Mst1 항체CST3682
N, N'-메틸렌-비아크릴아미드Sangon BiotechA600025
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)Sangon BiotechA610508
Nur77 항체CST3960
포스파타제 억제제 칵테일 2시그마P5726티로신 단백질 포스파타제, 산 및 알칼리성 포스파타제
억제제 칵테일 3시그마P0044단백질 포스파타제 2A, 알칼리성 포스파타제, 단백질 포스파타제 1 및 2A의 억제용
스포-세린 항체시그마P5747
포스포-트레오닌 항체시그마P6623
포스태그 아크릴아미드와코304-93526스태그 제조용 SDS PAGE 젤
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo 23227
프로테아제 억제제 칵테일시그마S8830EDTA-Free, 정제, 세린, 시스테인, 아스파르트 및 메탈로프로테아제
PVDF 멤브레인 억제용 Roche3010040001
ThermoMixerEppendorf2231001127
조직 분산기IKAT 10 조직 균질을 얻기 위해
Tris-HCl 완충액 (0.5M, pH 6.8)Sangon BiotechB546020
Tris-HCl 완충액 (1.5M, pH 8.8)Sangon BiotechB546019
진공 데시케이터ThermoFisher5311-0250겔 용액
및 베타 - 메르캅토에탄올시그마M3148
포스파타제 포 포의 가스 제거

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science (New York, N.Y.). 298 (5600), 1912-1934 (2002).
  2. Lim, S., et al. Regulation of mitochondrial functions by protein phosphorylation and dephosphorylation. Cell Biosci. 6, 25(2016).
  3. Pang, K., et al. Role of protein phosphorylation in cell signaling, disease, and the intervention therapy. MedComm. 3 (4), e175(2022).
  4. Bollu, L. R., Mazumdar, A., Savage, M. I., Brown, P. H. Molecular Pathways: Targeting protein tyrosine phosphatases in cancer. Clin Cancer Res. 23 (9), 2136-2142 (2017).
  5. Martin, L., et al. Tau protein kinases: involvement in Alzheimer's disease. Ageing Res Rev. 12 (1), 289-309 (2013).
  6. Bhardwaj, S., et al. Integrating the analysis of human biopsies using post-translational modifications proteomics. Protein Sci. 33 (4), e4979(2024).
  7. Kristjansdottir, K., Wolfgeher, D., Lucius, N., Angulo, D. S., Kron, S. J. Phosphoprotein profiling by PA-GeLC-MS/MS. J Proteome Res. 7 (7), 2812-2824 (2008).
  8. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  9. Cai, X., et al. Mst1-mediated phosphorylation of Nur77 improves the endometrial receptivity in human and mice. EBioMedicine. 88, 104433(2023).
  10. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E. Improved Phos-tag SDS-PAGE under neutral pH conditions for advanced protein phosphorylation profiling. Proteomics. 11 (2), 319-323 (2011).
  11. Shih, H. H., et al. An ultra-specific avian antibody to phosphorylated tau protein reveals a unique mechanism for phosphoepitope recognition. J Biol Chem. 287 (53), 44425-44434 (2012).
  12. Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay. J Vis Exp. (135), e57674(2018).
  13. Mehla, J., Caufield, J. H., Uetz, P. Mapping protein-protein interactions using yeast two-hybrid assays. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (5), 442-452 (2015).
  14. Ayati, M., Yilmaz, S., Blasco Tavares Pereira Lopes, F., Chance, M., Koyuturk, M. Prediction of kinase-substrate associations using the functional landscape of kinases and phosphorylation sites. Pac Symp Biocompu. 28, 73-84 (2023).

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