Method Article

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

진핵 세포는 DNA 유지 및 소기관 항상성을 포함한 다양한 과정을 조절하는 보존된 세포 주기를 따릅니다. 세포 주기에 의존하는 방식으로 세포 과정을 연구하는 것은 실험 결과를 적절하게 해석하기 위해 종종 필요합니다. 척추동물 모델을 포함한 광범위한 유기체에 걸쳐 배양된 세포에서 세포 주기 동기화를 생성하는 데 사용할 수 있는 화학적 및 유전적 방법이 있어 세포 주기 의존적 과정을 연구할 수 있습니다. 그러나 모델 유기체 중에서 발아 효모는 특히 강력한 동기화 방법, 짧은 생성 시간 및 유전적 다루기 성으로 인해 세포 주기 분석의 강자로 남아 있습니다. 효모는 다른 진핵생물과 핵심 세포 주기 기계를 공유하여 세포 주기 조절에 획기적인 발견을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜은 균주 구성, 배양 준비 및 현미경을 포함하여 G1 정지-방출 및 유사분열 정지-방출 실험에 초점을 맞춘 효모의 세포 주기 분석 방법을 자세히 설명합니다. 세포 주기 정지 및 형광 현미경에 적합한 균주를 생산하기 위한 PCR 태깅 방법이 제시됩니다. G1 정지는 펩타이드 페로몬 α-인자를 사용하여 달성되며, 짧은 세척은 동시 방출 및 세포 주기 진행을 초래합니다. 샘플은 세포 주기로 방출된 후 서로 다른 시점에서 채취되고 현미경 검사를 위해 고정됩니다. 두 번째 방법은 세포 주기 조절자인 Cdc20을 고갈시켜 중기 정지 집단을 달성하고 선택적으로 후기 방출을 달성함으로써 유사분열에서 효모 세포를 정지시킵니다. 샘플은 방출 전후 이미징을 위해 고정 및 준비되며 이미징 및 분석됩니다. 이미지 분석은 세포 주기에서 단백질의 동적 국소화 및 개체군 풍부도 변화를 분류하는 데 중점을 둡니다. 이러한 동기화 방법은 다양한 세포 주기 조작에 적합하며, 고정 세포 이미징에 사용되는 것이 여기에서 강조되어 있지만 생화학 및 분자 분석뿐만 아니라 살아있는 세포 이미징을 포함한 다른 많은 분석에도 적용될 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

진핵 세포 분열은 세포 주기라는 프로그램을 통해 고도로 조절됩니다. 세포 주기에서 발생하는 고도로 보존되고 역동적인 과정은 그 자체로 연구하는 것을 흥미롭게 만들 뿐만 아니라 다른 세포 생물학적 과정에 대한 조사를 알리는 광범위한 의미를 가지고 있습니다.- 예를 들어, 많은 소기관은 세포 분열 중에 극적인 리모델링을 겪고 많은 단백질의 풍부함과 국소화는 1,2,3 전반에 걸쳐 고도로 조절됩니다. 효모에 비해 후생동물 시스템에는 더 다양한 조절 키나아제 및 단백질과 후생동물의 외부 신호 전달로부터의 추가 입력을 포함하여 몇 가지 추가 복잡성 층이 존재하지만, 세포 분열은 모든 진핵생물에서 전반적으로 매우 고도로 보존되어 있습니다 4,5. 세포 주기 진행 및 중요한 조절 단계에 대한 주요 통찰력을 확립하는 많은 기본 작업이 효모에서 수행되었으며, 여러 가지 이유로 세포 주기 관련 질문을 연구하는 데 매우 매력적인 유기체로 남아 있습니다 6,7. 그 중 가장 중요한 것은 세포 주기를 조작하는 데 사용할 수 있는 다양한 방법으로, 다양한 단계에서 정지하고 세포를 동기화할 수 있습니다. 추가적인 이점으로는 효모의 짧은 세포 주기(온도 및 배지 조건에 따라 ~90-150분), 유전자 조작의 용이성, 야생형 맥락에서 연구를 가능하게 하는 광범위한 조건부 대립유전자가 있습니다.

세포 주기의 여러 단계를 통한 진행은 유비쿼터스 사이클린 의존성 키나아제(Cdk), 폴로 유사 키나아제 및 오로라 키나아제를 포함한 몇 가지 주요 키나아제의 활성에 의해 주도됩니다. 세포 주기 체크포인트는 세포 주기를 통한 진행을 조절하여 특정 조건이 충족되지 않는 한 세포가 분열의 다음 단계로 진행되지 않도록 합니다 8,9. 이러한 체크포인트와 이들이 조절하는 전이를 연구자가 하이재킹하여 장기 체결을 달성하거나 세포 집단을 동기화하기 위해 일시적인 체결 및 방출을 달성할 수 있습니다(그림 1). 예를 들어, 세포 주기 커밋 체크포인트(효모에서 제한 포인트 또는 시작)는 DNA 복제를 시작하기 전에 세포가 분열에 커밋할 수 있는 충분한 영양분을 가지고 있는지 확인합니다10. 이 체크포인트는 세포 주기와 상호 작용하는 효모 짝짓기 프로그램을 활용하여 G1 정지를 달성하기 위해 반수체 효모에서 조작될 수 있습니다. 빵 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 반수체 세포는 짝짓기 유형 유전자좌에 의해 유전적으로 결정되는 MATa 또는 MATα의 두 가지 짝짓기 유형 중 하나를 가지고 있습니다. 한 짝짓기 유형의 효모는 다른 짝짓기 유형의 짝짓기 페로몬에 민감하며, 궁극적으로 Cdk 억제제 Far1을 인산화하고 안정화시키는 MAP 키나아제 신호 전달 캐스케이드를 활성화하여 반응하며, 이는 Cln1/2-Cdk 복합체에 결합하고 그 활성을 차단함으로써 세포 주기 진입을 방지합니다 11,12,13. 짝짓기 페로몬에 반응하는 세포는 짝짓기 돌출 또는 shmoo의 존재에 의해 시각적으로 결정될 수 있습니다(그림 1). 따라서, 화학적으로 합성된 α-인자를 MATa 세포의 배양에 첨가하여 G1 정지를 달성할 수 있다. 연구자들이 효모 세포를 동기화하기 위해 목표로 삼을 수 있는 또 다른 세포 주기 전이는 중기에서 후기 전이입니다. 유사분열 동안 SAC(Spindle Assembly Checkpoint)는 미세소관에 대한 동원체의 부착을 모니터링하고 부착되지 않은 동원체가 검출될 때 활성화제인 Cdc20을 격리하여 후기 촉진 복합체/사이클로솜(APC/C)을 억제합니다. APC/C는 후기 진입에 필수적인 E3 리가아제 복합체입니다. SAC가 충족되면 Cdc20은 APC/C에 결합하고 APC/C는 분해를 표적으로 삼는 여러 단백질, 주로 세큐린과 사이클린 B를 유비퀴틴화하고 염색체 분리 및 유사분열 출구를 촉진합니다14,15. Cdc20 자체는 SAC의 구성 요소는 아니지만 그 억제는 SAC 활성화의 표적입니다. 따라서 Cdc20의 유도 가능한 고갈을 활용하여 중기에서 효모 배양을 정지시킬 수 있습니다(그림 1)16.

이 프로토콜은 효모 세포 주기 조작의 두 가지 방법과 각 방법의 적용 예시를 포함합니다. 첫 번째에서는 α-인자가 G1의 세포를 정지시키는 데 사용되고, 이어서 세포가 정지에서 세포를 방출하기 위한 세척 단계가 이어지며, 그 결과 동기식 세포 주기 재진입이 발생합니다. 동기화된 세포는 전체 세포 주기를 통해 계속되므로 연구자들은 각 세포 주기 단계에서 세포를 추적하고 연구할 수 있습니다. 이 방법에서는 GFP 태그가 있는 관심 단백질인 Stu2의 동적 국소화를 전체적으로 모니터링하고 유사분열 방추와의 연관성을 추적합니다. 이 방법은 또한 유사분열 방추 길이를 측정할 수 있고 세포 주기 진행에 대한 탁월한 프록시인 태그가 지정된 SPB(spindle pole body) 구성 요소인 Spc110-mCherry를 활용합니다17. 이 방법은 세포 주기 정지 및 방출이 어떻게 세포 집단의 동기화를 가능하게 하여 세포 주기 전반에 걸쳐 단백질 또는 기타 관심 성분에 대한 연구를 용이하게 하는지 보여줍니다.

두 번째 방법에서, 유사분열 정지는 옥신 유도 데그론(AID) 시스템(18)을 사용하여 Cdc20의 고갈을 통해 달성된다. TIR1(식물 유래의 F-box 단백질)을 발현하는 세포에서 AID 태그가 있는 모든 단백질은 옥신을 첨가하면 유비퀴틴화되고 분해됩니다. 여기에서는 AID 태그가 부착된 Cdc20을 사용하여 Cdc20의 유도 가능한 분해를 가능하게 하여 중기에 정지를 일으킵니다. 그런 다음 이 세포 집단은 태그가 지정된 동원체 단백질 Mtw1-mCherry를 기준 마커로 사용하여 태그가 지정된 SAC 구성 요소 Bub1-GFP가 동원체로 모집되기 위해 모니터링됩니다. Bub1은 동원체에서 SAC 독립적인 역할을 하고 초기 유사분열에서 동원체에 국한되지만, 정지된 세포에서 지속적인 동원체 국소화는 부적절한 동원체-미세소관 부착을 신호합니다19. 우리는 동원체-미세소관 부착을 방해하는 미세소관 독인 노코다졸로 세포를 처리함으로써 이를 보여주었습니다. 이 실험은 고도로 조정 가능한 정지 방법을 사용하여 별개의 세포 주기 단계에 특정한 과정을 연구할 수 있는 방법을 강조합니다. 우리는 또한 옥신이 cdc20-AID 배양에서 씻겨 나와 후기 단계로 방출되고 새로운 세포 주기로 진입할 수 있음을 입증하지만, 우리의 경험에 따르면 이러한 배양은 α 인자 체결-방출만큼 동시에 방출되지 않습니다. 이 두 가지 체포-방출 방법은 모두 효과적이고 구현하기 쉽지만, 효모 연구자들은 상기한 세포 주기 단계20,21,22,23에서 세포를 체결시키기 위해 다른 많은 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법에 대한 자세한 내용은 토론에서 찾을 수 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포주기 분석 및 이미징을 위한 균주 구축

  1. Pringle Tagging Plasmids(pFA6a 플라스미드)24를 사용하여 관심 유전자를 C-말단으로 태그하기 위한 프라이머를 설계합니다. 요컨대, pFA6a 시리즈 플라스미드와 함께 사용할 때 효모로 직접 형질전환되어 관심 유전자의 '태그' 버전을 생성할 수 있는 PCR 산물을 생성하는 F2 및 R1 프라이머를 설계합니다. 표 1 에 포함된 프라이머 쌍과 플라스미드를 사용하여 이 프로토콜에서 관심 유전자에 태그를 지정합니다. 효모 유전자의 C-말단 태깅을 위한 플라스미드 및 프라이머 설계 전략은 Longtine et al.24에 의해 자세히 설명되어 있습니다.
    참고: 이 방법은 이미징을 위한 형광 태그 단백질 또는 세포 주기 정지 및 표적 단백질의 분해에 의해 가능한 기타 실험을 용이하게 하기 위해 Auxin Inducible Degron (AID) 태그 단백질을 생성하는 데 사용할 수 있습니다18. 예를 들어, CDC20에 AID (IAA7) 태그를 붙이기 위해, 포워드 태깅 프라이머는 STOP 코돈(5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3') 및 Pringle Plasmid F2 어댑터 서열 (5' cggatccccgggttaattaa 3')을 3' 말단에 추가하여 최종 프라이머 서열(5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). 역 CDC20 태깅 프라이머는 STOP 코돈 직후의 25-40 염기쌍의 역 보체를 포함합니다(5' ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTA 3') 및 Pringle Plasmid R1 어댑터 서열 (5' gaattcgagctcgtttaaac 3')을 생성하여 최종 프라이머 서열 (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). 40 염기쌍보다 짧은 PCR 프라이머를 사용하면 효모 게놈에 통합되는 효율성이 감소한다는 점에 유의하는 것도 중요합니다.
  2. 분자 생물학 등급의 물에 프라이머를 10μM로 희석합니다.
  3. 표 2에 포함된 열 순환기 프로그램에 따라 표준 방법을 사용하여 F2 및 R1 플라스미드 쌍과 적절한 태깅 플라스미드로 PCR을 수행한 다음 아가로스 겔 전기영동으로 PCR 산물의 크기를 확인합니다.
  4. 효모 균주를 접종하여 25mL의 효모 추출물 펩톤 아데닌 덱스트로스(YPAD) 배양액으로 형질전환하고 23°C에서 하룻밤 동안 성장시킵니다. cdc20-AID 효모(옥신으로 처리하면 Cdc20을 분해함)를 구축하기 위해, 형질전환된 균주는 이미 이소성 유전자좌에서 발현된 OsTIR1을 포함하거나 OsTIR1이 후반에 교배될 수 있습니다18.
  5. 다음날 아침, 하룻밤 배양의 OD600을 확인합니다. 문화 OD가 <2.0인 경우 1.6단계로 진행합니다. OD> 2.0이면 ~0.2-0.4로 희석하고 2-3주기의 성장을 허용합니다.
  6. OD600 = ~0.4-2.0에서 세포를 수확하여 로그 성장 단계에 있는지 확인합니다. 형질전환당 5 OD의 세포를 수확합니다(예: OD600 5mL = 1.0). 동일한 균주를 두 번 이상 변형하는 경우 이 단계에서 세포를 결합할 수 있습니다. 23°C에서 5분 동안 3,000 x g 으로 원심분리하여 세포를 수확합니다.
  7. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 물 25mL로 세척한 후 23°C에서 5분 동안 3,000 x g 으로 원심분리합니다.
  8. 상청액을 버리고 세포를 1mL의 0.1M 리튬 아세테이트(LiAc)에 재현탁하고 1.6mL 튜브로 옮깁니다. 하나 이상의 형질전환을 수행하는 경우 1mL 재현탁액을 여러 개의 튜브로 분할합니다(예: 2회 형질전환의 경우 2x 500 μL를 분할, 3회 형질전환의 경우 3x 333 μL 분할 등).
  9. 세포를 23°C에서 2분 동안 1,000 x g 으로 원심분리하고 상청액을 버립니다.
  10. 다음을 세포 펠릿에 추가하여(이 순서대로): i) PEG 240μL(50%), ii) 1.0M LiAc 36μL, iii) 5분 동안 미리 끓인 연어 정자 DNA 20μL = 50μg, iv) 물 54μL.
  11. 10μL의 PCR 산물(1.3단계에서 얻음)을 세포에 넣고 1분 동안 소용돌이치면서 모든 것이 잘 혼합되도록 합니다.
  12. 따뜻한 방의 롤러 드럼 또는 1000rpm의 열셰이커에서 30°C에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
  13. 수조에서 42°C에서 15분 동안 열 충격 셀을 가열합니다.
    참고: 최적의 열 충격 시간은 효모 균주 배경에 따라 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 W303 균주 배경에 최적화되어 있습니다.
  14. 세포를 23°C에서 2분 동안 1,000 x g 으로 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 100μL의 물에 부드럽게 재현탁합니다.
  15. KanMX 또는 기타 약물 선택을 사용한 형질전환의 경우, YPAD에 세포를 플레이트화하고 플레이트를 23°C에서 배양한 다음 다음날 플레이트를 약물 플레이트로 복제합니다.
    참고: YPAD에서 하루 동안 성장을 허용하는 것은 형질전환된 세포에서 약물 내성 유전자의 발현을 허용하는 데 중요합니다.
  16. 영양 운동 마커(URA, HIS 등)를 사용한 형질전환의 경우 선택적 배지에 직접 세포를 도금합니다.
  17. 효모 형질전환 콜로니가 성장할 수 있도록 플레이트를 23°C에서 3일 동안 배양합니다.
  18. 게놈 PCR 또는 웨스턴 블로팅을 통해 유전자의 올바른 태깅을 확인합니다. 이러한 방법은 Burnette25 및 Chu etal 26에 의해 자세히 설명되어 있습니다.
    참고: 여러 태그가 지정된 대립유전자가 있는 균주를 생산하기 위해, 형질전환은 돌연변이 유발 과정일 수 있으므로 역교배 없이 반복적인 형질전환은 권장되지 않습니다. 예를 들어, Stu2-GFP 및 Spc110-mCherry를 포함하는 균주를 생산하려면 균주를 별도로 형질전환하여 Stu2-GFP 및 Spc110-mCherry를 생산한 다음 효모 교차, 포자 형성, 사자 해부 및 유전자형 분석을 통해 이러한 대립유전자를 하나의 반수체 균주로 결합하는 것이 좋습니다. 효모 교배에 대한 자세한 내용은 Stansfield 및 Stark27 및 Morin et al.28에서 확인할 수 있습니다. α인자 정지-방출을 수행하려면 사용되는 반수체 균주가 MATa여야 합니다.

2. 효모 배양 및 세포주기 동기화: α인자 체결-방출

  1. 효모를 23°C에서 밤새 25mL의 YPAD 배양액에 접종하여 다음날 아침 OD600 = 0.5-2.0이 되도록 합니다.
    1. 아침에 세포가 OD600 = 2.0 이상이면 OD600 = 0.2-0.4로 다시 희석하고 최소 1 세포 주기(23°C에서 2-3시간) 동안 성장시키십시오.
  2. 세포를 다시 OD600 = 0.5로 희석하고 α-인자를 1μg/mL의 최종 농도(DMSO에서 스톡 10mg/mL)로 첨가합니다. 세포는 이상적으로 bar1 돌연변이(예: bar1-1)를 가지며, 이는 α 인자에 더 민감하게 만듭니다. BAR1 야생형 세포는 α인자에 덜 민감하며 적절하게 정지하기 위해 적어도 한 자릿수 더 높은 α인자 농도가 필요하므로 경제성이 떨어집니다.
  3. 체포 후 2.5-3.5시간에, 새싹이 나지 않은 세포의 비율을 세어 체포 정도를 확인합니다. 세포의 90-95%가 shmooed(G1에서 정지됨)되면 방출을 진행합니다. 시기는 효모 균주, 성장 배지 및 온도에 따라 다릅니다.
  4. 23°C에서 3-5분 동안 3,000 x g 의 원심분리기에서 회전시킨 다음 상청액을 부어 α인자 정지로부터 세포를 방출합니다.
  5. 펠릿을 25mL의 YPAD + 1% DMSO에 재현탁하여 세포를 세척합니다.
  6. 2.4-2.5단계를 총 3회 세척에 대해 두 번 반복하고 첫 번째 세척 후 사용한 튜브를 한 번 교체합니다.
  7. 세포에 YPAD를 첨가하여 최종 부피를 25mL로 만들고 세포를 새 플라스크로 옮깁니다.
    참고: 새 플라스크를 사용하는 것은 방출을 방해할 수 있는 미량의 α 인자를 제거하는 데 중요합니다.
  8. 시점(0분) 샘플을 채취하고 고정합니다(4.1-4.4단계의 고정 지침 참조).
  9. 23°C에서 성장이 일어나는 경우 15분마다 시점 샘플을 계속 채취합니다. 이 타이밍은 세포가 얼마나 빨리 자라는지에 따라 다른 온도에서 변경됩니다.
  10. 시점 60분에서 광학 현미경으로 균일한 작은 새싹(새싹 크기 < 모세포 크기 25%)을 확인하여 방출의 동시성을 판단합니다.
  11. 선택 사항) 방출 후 60분에 다음 세포 주기로의 진행을 방지하기 위해 α-인자를 최종 농도 1μg/mL로 다시 추가합니다. 첨가하기 전에 균일한 작은 새끼 형태를 확인하여 동기 세포 방출을 확인합니다.
  12. 최대 180분 또는 원하는 기간 동안 시점 샘플을 계속 채취합니다. 23°C에서 중기는 방출 후 ~45-60분에 발생하고, 후기 단계는 방출 후 ~60-90분에 발생하며, 대부분의 세포는 방출 후 120분까지 새로운 G1에 있습니다.

3. 효모 배양 및 세포 주기 동기화: Cdc20 고갈 정지-방출

  1. 다음날 아침 OD600 = 0.5-2.0이 되도록 23°C에서 하룻밤 효모를 접종합니다.
    1. 다음날 아침 세포가 OD600 = 2.0 이상이면 OD600 = 0.2-0.4로 다시 희석하고 최소 1 세포 주기(23°C에서 2-3시간) 동안 성장시키십시오.
  2. OD600 = 0.5로 다시 희석하고 1M 스톡(500x)에서 최종 농도 500μM으로 옥신을 모든 배양액에 첨가합니다. 다른 약물(노코다졸)을 투여받는 배양의 경우, 적절한 농도(예: ~10 μg/mL 노코다졸)로 옥신과 동시에 첨가하십시오.
  3. 체포 후 2시간 후에 큰 새끼 세포의 백분율을 계산하여 정지 정도를 확인합니다(큰 새기는 새싹의 존재 > 모세포 크기의 25%로 결정됨). 세포의 90-95%가 유사분열에서 정지되면 실험 응용 프로그램에 따라 샘플 수집을 진행하거나 세포를 정지에서 해제합니다. 세포의 90%가 정지되지 않으면 배양이 계속 성장하도록 하고 15-30분마다 확인합니다. 시기는 효모 균주, 성장 배지 및 온도에 따라 다릅니다.
    참고: 장기간 정지하면 세포 생존력이 감소할 수 있으므로 방출하는 경우 정지가 너무 오래(4시간 이상) 진행되도록 하는 것은 바람직하지 않습니다.
  4. Cdc20 고갈 정지에서 방출하려면 23°C에서 3-5분 동안 3000 x g 에서 원심분리하여 배양물을 수확합니다.
  5. 펠릿을 25mL의 YPAD + 1% DMSO에 재현탁한 다음 23°C에서 3-5분 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 수확하여 세포를 세척합니다.
  6. 3.4-3.5단계를 반복하여 총 2회 세탁합니다.
  7. 세포에 YPAD를 첨가하여 최종 부피를 25mL로 만들고 세포를 새 플라스크로 옮깁니다.
    참고: 방출을 방해할 수 있는 미량의 옥신을 제거하려면 새 플라스크를 사용하는 것이 중요합니다.
  8. 시점 0을 가져와 수정합니다(4.1-4.4단계의 고정 지침 참조).
  9. 원하는 시간 과정 동안 10-15분마다 시간점을 계속 취합니다. 23°C에서 대부분의 세포는 50-70분 후에 정지에서 방출되었을 것입니다.
    참고: 세포는 α인자 정지에서처럼 이 Cdc20 고갈 정지에서 동시에 방출되지 않습니다. 그러나 후기 또는 유사분열 종료 사건을 연구하는 것이 유용할 수 있습니다. 또한, 이 체포-방출의 기술적 한계는 방출 후 후기 시점에서 아직 방출되지 않은 중기 세포와 더 일찍 방출되어 다음 세포 주기의 중기에 도달한 세포를 구별하기가 더 어렵다는 것입니다. 필요한 경우, 생세포 이미징을 수행하여 개별 세포가 정지에서 방출될 때 추적하거나 배양에 α-인자를 추가하여 (세포가 MATa라고 가정) 유사분열 종료 후 G1의 세포를 정지함으로써 이를 극복할 수 있습니다.

4. 효모 고정

  1. 23°C에서 최대 속도(~20,000 x g)로 1분 동안 1mL(또는 0.5-1.5OD)의 배양액을 원심분리합니다.
  2. 상청액을 흡인하고 세포를 500μL의 고정 용액(0.1M 인산칼륨(KPi) pH 6.4에서 3.7% 포름알데히드)에 재현탁합니다.
  3. 고정액에서 2-15분 동안 세포를 배양합니다.
    23 °C. 시간 경과 실험의 경우 일반적으로 샘플을 채취할 때 세포를 원심분리하는 시기를 맞추기 위해 세포를 15분 동안 고정하는 것이 좋습니다.
    참고: 고정 타이밍은 특정 형광단 및 관심 단백질에 대해 최적화되어야 합니다.
  4. 23°C에서 최대 속도로 1분 동안 세포를 원심분리하고 상청액을 흡인한 다음 500μL의 0.1M KPi(pH 6.4)에 재현탁합니다. KPi의 세포는 이미징 준비가 될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
    참고: 고정 세포 형광 신호는 형광단에 따라 최대 2주 동안 지속될 수 있지만 형광 신호의 정량화를 위해 7일 이내에 이미지를 수집합니다.

5. 이미징을 위한 슬라이드 준비

  1. 이미징 준비가 되면 23°C에서 최대 속도로 1분 동안 세포를 원심분리하고 상청액을 버립니다. 10-100μL의 Triton/DAPI/소르비톨 용액(1.2M 소르비톨, 1% 트리톤, 0.1M KPi, pH 7.5, 2μg/mL DAPI)에 세포를 재현탁합니다.
  2. ~0.8 μL의 세포를 깨끗한 커버슬립에 직접 피펫팅합니다. 피펫 팁을 사용하여 세포 방울을 커버슬립 중앙에 있는 약 1cm2 원으로 부드럽게 퍼뜨립니다.
  3. 커버슬립을 현미경 슬라이드에 놓습니다. Kimwipe를 사용하여 슬라이드 주위를 부드럽게 눌러 샘플을 분배시킵니다.
  4. 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하십시오.
  5. 선택적으로 이미징 전 최대 4-6시간 동안 서늘하고 어두운 장소에 보관하여 세포가 정착하고 과도한 움직임을 방지하도록 돕습니다.

6. 이미징

  1. 60x/1.42 오일 대물렌즈와 적색, 녹색, 청색, 원적외선 레이저 및 필터 세트가 장착된 현미경으로 슬라이드합니다. 더 높은 배율 목표(최대 100x)도 사용할 수 있습니다.
  2. 커버슬립에 부착된 효모 세포에 현미경의 초점을 맞춥니다.
    참고: 효모 세포가 너무 많이 움직이면 슬라이드를 서늘하고 어두운 곳에 20-60분 동안 방치하여 가라앉을 수 있습니다.
  3. 효모에 초점이 맞춰지면 각 채널의 노출 설정을 조정하여 신호 대 잡음비를 최소 3:1로 생성하여 형광 점점이 과다 노출되지 않도록 합니다.
    참고: 예를 들어, 과학용 CMOS 카메라와 함께 사용하는 이미징 시스템에서 굴절률이 n = 1.516인 60x 550 대물렌즈 및 침지 오일을 사용하여 빨간색 채널의 최대 신호를 1000-2000 au, 녹색 채널을 3000 au, 파란색 채널을 3000 au로, DIC 채널을 4000-5000 au로 설정하면 고품질 이미지가 생성됩니다.
  4. 획득 설정을 조정하여 14-20개의 0.2 μm Z-스택을 총 2-4 μm에 걸쳐 사용합니다.
  5. 후처리 모듈이 장착된 현미경의 경우 각 스택에 대해 Deconvolution 및 Quick Projection 을 선택합니다.
  6. 세포의 Z-스택을 수집하여 각 조건 또는 시점에 대해 ~100-200개의 세포를 캡처할 수 있는 충분한 이미지를 촬영합니다.
  7. 이미징 소프트웨어의 스크린샷이 포함된 소프트웨어 지침은 보충 파일 1 을 참조하십시오.

7. 이미지 분석

  1. ImageJ에서 투사된 이미지를 열고 밝기와 대비를 조정하여 다양한 채널을 볼 수 있습니다. 이미징에 사용되는 현미경에 후처리 모듈이 없는 경우 이 단계에서 Z-스택의 최대 투영을 수행합니다.
  2. 세포 주기 진행을 결정하려면 시점당 100개의 세포를 세고 하나 또는 두 개의 핵을 포함하는 것으로 분류합니다. 또는 스핀들 길이 또는 스핀들 극 본체 사이의 거리를 계산하여 세포 주기 상태를 정의합니다. Spc110 병소< 1.5μm 사이의 거리는 중기 세포에 해당하고 1.5μm> 거리는 후기 세포에 해당합니다.
  3. 단백질 점점의 강도(예: Stu2-GFP)를 계산하려면 자유형 선택 도구를 사용하여 관심 신호의 경계 주위를 그립니다. T 를 누르거나 메뉴를 사용하여 이 신호를 ROI(관심 영역) 관리자에 추가합니다. ROI 관리자 에서 측정을 선택하여 선택한 각 펀크타의 강도를 계산합니다. 시간 경과에 따른 누점 신호의 변화를 보려면 각 시점에 대한 선 그래프에 95% 신뢰 구간으로 평균 강도를 표시합니다.
  4. Bub1-GFP puncta가 있는 셀의 백분율을 계산하려면 녹색 채널 최소 및 최대 밝기 설정이 서로 다른 이미지에서 동일한지 확인하십시오. Mtw1-mCherry puncta와 겹치는 Bub1-GFP puncta를 갖는 세포는 동원체에 국한된 Bub1로 계산됩니다. 그렇지 않으면 셀이 음수로 계산됩니다. 조건당 ~100개의 셀을 계산합니다. Aravamudhan et al.29 에는 동원체에 대한 Bub1 국소화에 대한 자세한 정보가 포함되어 있습니다.
  5. 큰 새싹 단핵 세포의 백분율을 계산하려면 집단에서 큰 새싹과 하나의 핵(하나의 DAPI 신호)이 있는 세포의 수를 세고 총 세포 수로 나눕니다.
  6. 이미징 소프트웨어의 스크린샷이 포함된 소프트웨어 지침은 보충 파일 1 을 참조하십시오.

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Results

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형광 현미경에 의한 세포 주기 의존적 단백질 국소화의 변화를 분석하는 것은 여기에 설명하는 방법을 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 우리 그룹은 오랫동안 유사분열 방추의 동적 조절과 기능에 관심을 가져왔습니다. 효모에서 방추 극체(성분 Spc110으로 표시됨)는 미세소관 필라멘트가 분열된 방추의 구조를 생성하기 위해 방출되는 미세소관 조직 중심으로 기능합니다(30). 미세소관 결합 단백질인 Stu2는 미세소관을 중합시켜 방추 형성에 역할을 합니다31. Stu2는 또한 동원체, 방추 극체 및 미세소관 플러스 말단을 포함한 많은 세포 위치에서 다양한 역할을 하며, 세포 주기 전반에 걸쳐 국소화의 변화는 이러한 기능을 촉진합니다 32,33,34,35.

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Discussion

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발아 효모에서 세포 주기 동기화를 활용하면 다양한 세포 과정에 대한 중요한 메커니즘을 연구할 수 있습니다. α 인자 치료와 함께 G1 정지-방출을 사용하면 세포 주기의 단계를 통해 세포 집단의 동시 진행이 가능하며, 우리가 보여준 바와 같이 Stu236과 같은 세포 조절자의 동적 국소화 패턴을 밝힐 수 있습니다. 세포 주기 정지는 중기 세포를 정지시키는 데 사용되는 Cdc20과 같은 세포 주기 조절제의 고갈 을 통해 유전적 수단을 사용하여 달성할 수도 있습니다. 이를 통해 방추 장력이 없는 상태에서 동원체에 대한 Bub1 동원과 같은 유사분열 특이적 과정을 평가할 수 있습니다37.

발아 효모에서 세포 주기 정지를 일으키는 다른 많은 유전적 수단이 있습니다. cdc34(유비퀴틴 리가아제 SCF 복합체의 구...

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

델타 비전 현미경 시설을 유지 관리해 주신 유타 대학교 세포 이미징 코어에 감사드립니다. 이 작업은 부분적으로 NIH 보조금 F31CA2717405(MGS에게) 및 T32GM141848(MGS 및 TCS), 5 For the Fight(MPM), Pew Biomedical Scholars(MPM) 및 NIH 보조금 R35GM142749(MPM에게)의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-요소유타 대학교 코어 합성 시설순서: WHWLQLKPGQPMY
1.5 mL 에펜도르프 튜브악시겐MCT-175-C
10mM dNTP 믹스써모 사이언티픽R0193
50 mL 원뿔관그레이너 바이오-원227 261
5x Phusion HF 반응 완충제뉴잉글랜드 바이오랩스B0518S
아세트산, 빙하피셔 케미컬BP2401C-212
아데닌 헤미황산염 소금시그마-올드리치A9126-100G
한천, 과립에이펙스 케미컬 및 시약20-275
아가로스에이펙스 바이오리서치 제품20-102GP
오토클레이브 암스코 센추리 스팀 살균기스테리스SV-1262
오토클레이드 DI 워터
옥신시그마-올드리치Cat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
카질 레이저 리퀴드카길 연구소20130
D-소르비톨시그마-올드리치S1876-500G
DAPI (40 ,6-디아미디노-2-페닐린돌, 디하이드로클로라이드)분자 프로브Cat#D1306
연어 고환에서 추출한 디옥시리보핵산 나트륨 소금시그마-올드리치D1626
포도당피셔 케미컬D16-10
디나트륨 에틸렌디아민 테트라아세테이트피셔 케미컬S811-10
DMSO써모 사이언티픽20688
FIJI/ImageJ2 대 2.14.0/1.54f이미지J2https://imagej.net/software/fiji/
고정 속도 와류 믹서VWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
형광 현미경 DV 울트라라이카https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE일련번호 #: NV01063. 더 이상 지원되지 않습니다
포름알데히드피셔 케미컬카테고리#F79-500
젤 장치써모 사이언티픽부엉이 이지캐스트 B1
GeneRuler DNA 사다리 혼합발효SM0333
유리 구슬피셔 사이언티브11312A
유리 슬라이드VWR48300-026
이노바 2300 플랫폼 셰이커뉴브런즈윅NB-2300
킴와이프스킴텍06-666
1.5 mL 튜브용 실험실 원심분리기에펜도르프2525
50 mL 튜브용 실험실 원심분리기에펜도르프5804
리튬 아세테이트 이하이드레이트시그마-올드리치L4158-250G
마스터 사이클러 넥서스 X2에펜도르프https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
마이크로피펫 p2, p20, p200, p1000과 해당 팁레이닌L-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
현미경 커버 유리피셔 사이언티브12541014
노코다졸칼바이오케미Cat#487928; CAS: 31430-18-9; 로트#B35705
오렌지 G시그마-올드리치O7252
페그햄튼 리서치HR2-591
펩톤 과립화;피셔 바이오리에이전트BP9725-5
푸전 HF DNA 중합효소뉴잉글랜드 바이오랩스M0530L
피펫-X레이닌PX-100R
인산칼륨, 디베이스써모 사이언티픽424195000
인산칼륨, 단염성써모 사이언티픽424200025
전원 공급바이오-래드23786
시작 획득 Ultra 1.2.2softWoRx 시티바DV 울트라로 얻기
트리스 베이스피셔 바이오리에이전트BP152-10
트리톤 X-100시그마-올드리치9002-93-1
튜브 회전기VWR10136-084
물욕VWRWBE10A11B
물, 울트라 퓨어에이펙스 바이오리서치 제품18-194
효모 추출물 과립피셔 바이오리에이전트BP9727-5

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