Method Article

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

Abstract

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진핵 세포는 DNA 유지 및 소기관 항상성을 포함한 다양한 과정을 조절하는 보존된 세포 주기를 따릅니다. 세포 주기에 의존하는 방식으로 세포 과정을 연구하는 것은 실험 결과를 적절하게 해석하기 위해 종종 필요합니다. 척추동물 모델을 포함한 광범위한 유기체에 걸쳐 배양된 세포에서 세포 주기 동기화를 생성하는 데 사용할 수 있는 화학적 및 유전적 방법이 있어 세포 주기 의존적 과정을 연구할 수 있습니다. 그러나 모델 유기체 중에서 발아 효모는 특히 강력한 동기화 방법, 짧은 생성 시간 및 유전적 다루기 성으로 인해 세포 주기 분석의 강자로 남아 있습니다. 효모는 다른 진핵생물과 핵심 세포 주기 기계를 공유하여 세포 주기 조절에 획기적인 발견을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜은 균주 구성, 배양 준비 및 현미경을 포함하여 G1 정지-방출 및 유사분열 정지-방출 실험에 초점을 맞춘 효모의 세포 주기 분석 방법을 자세히 설명합니다. 세포 주기 정지 및 형광 현미경에 적합한 균주를 생산하기 위한 PCR 태깅 방법이 제시됩니다. G1 정지는 펩타이드 페로몬 α-인자를 사용하여 달성되며, 짧은 세척은 동시 방출 및 세포 주기 진행을 초래합니다. 샘플은 세포 주기로 방출된 후 서로 다른 시점에서 채취되고 현미경 검사를 위해 고정됩니다. 두 번째 방법은 세포 주기 조절자인 Cdc20을 고갈시켜 중기 정지 집단을 달성하고 선택적으로 후기 방출을 달성함으로써 유사분열에서 효모 세포를 정지시킵니다. 샘플은 방출 전후 이미징을 위해 고정 및 준비되며 이미징 및 분석됩니다. 이미지 분석은 세포 주기에서 단백질의 동적 국소화 및 개체군 풍부도 변화를 분류하는 데 중점을 둡니다. 이러한 동기화 방법은 다양한 세포 주기 조작에 적합하며, 고정 세포 이미징에 사용되는 것이 여기에서 강조되어 있지만 생화학 및 분자 분석뿐만 아니라 살아있는 세포 이미징을 포함한 다른 많은 분석에도 적용될 수 있습니다.

Introduction

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진핵 세포 분열은 세포 주기라는 프로그램을 통해 고도로 조절됩니다. 세포 주기에서 발생하는 고도로 보존되고 역동적인 과정은 그 자체로 연구하는 것을 흥미롭게 만들 뿐만 아니라 다른 세포 생물학적 과정에 대한 조사를 알리는 광범위한 의미를 가지고 있습니다.- 예를 들어, 많은 소기관은 세포 분열 중에 극적인 리모델링을 겪고 많은 단백질의 풍부함과 국소화는 1,2,3 전반에 걸쳐 고도로 조절됩니다. 효모에 비해 후생동물 시스템에는 더 다양한 조절 키나아제 및 단백질과 후생동물의 외부 신호 전달로부터의 추가 입력을 포함하여 몇 가지 추가 복잡성 층이 존재하지만, 세포 분열은 모든 진핵생물에서 전반적으로 매우 고도로 보존되어 있습니다 4,5. 세포 주기 진행 및 중요한 조절 단계에 대한 주요 통찰력을 확립하는 많은 기본 작업이 효모에서 수행되었으며, 여러 가지 이유로 세포 주기 관련 질문을 연구하는 데 매우 매력적인 유기체로 남아 있습니다....

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Protocol

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1. 세포주기 분석 및 이미징을 위한 균주 구축

  1. Pringle Tagging Plasmids(pFA6a 플라스미드)24를 사용하여 관심 유전자를 C-말단으로 태그하기 위한 프라이머를 설계합니다. 요컨대, pFA6a 시리즈 플라스미드와 함께 사용할 때 효모로 직접 형질전환되어 관심 유전자의 '태그' 버전을 생성할 수 있는 PCR 산물을 생성하는 F2 및 R1 프라이머를 설계합니다. 표 1 에 포함된 프라이머 쌍과 플라스미드를 사용하여 이 프로토콜에서 관심 유전자에 태그를 지정합니다. 효모 유전자의 C-말단 태깅을 위한 플라스미드 및 프라이머 설계 전략은 Longtine et al.24에 의해 자세히 설명되어 있습니다.
    참고: 이 방법은 이미징을 위한 형광 태그 단백질 또는 세포 주기 정지 및 표적 단백질의 분해에 의해 가능한 기타 실험을 용이하게 하기 위해 Auxin Inducible Degron (AID) 태그 단백질을 생성하는 데 사용할 수 있습니다18. 예를 들어, CDC20에 AID (IAA7) 태그를 붙이기 위해, 포워드 태깅....

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Results

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형광 현미경에 의한 세포 주기 의존적 단백질 국소화의 변화를 분석하는 것은 여기에 설명하는 방법을 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 우리 그룹은 오랫동안 유사분열 방추의 동적 조절과 기능에 관심을 가져왔습니다. 효모에서 방추 극체(성분 Spc110으로 표시됨)는 미세소관 필라멘트가 분열된 방추의 구조를 생성하기 위해 방출되는 미세소관 조직 중심으로 기능합니다(30). 미세소관 결합 단백질인 Stu2는 미세소관을 중합시켜 방추 형성에 역할을 합니다31. Stu2는 또한 동원체, 방추 극체 및 미세소관 플러스 말단을 포함한 많은 세포 위치에서 다양한 역할을 하며, 세포 주기 전반에 걸쳐 국소화의 변화는 이러한 기능을 촉진합니다 32,33,34,35.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

발아 효모에서 세포 주기 동기화를 활용하면 다양한 세포 과정에 대한 중요한 메커니즘을 연구할 수 있습니다. α 인자 치료와 함께 G1 정지-방출을 사용하면 세포 주기의 단계를 통해 세포 집단의 동시 진행이 가능하며, 우리가 보여준 바와 같이 Stu236과 같은 세포 조절자의 동적 국소화 패턴을 밝힐 수 있습니다. 세포 주기 정지는 중기 세포를 정지시키는 데 사용되는 Cdc20과 같은 세포 주기 조절제의 고갈 을 통해 유전적 수단을 사용하여 달성할 수도 있습니다. 이를 통해 방추 장력이 없는 상태에서 동원체에 대한 Bub1 동원과 같은 유사분열 특이적 과정을 평가할 수 있습니다37.

발아 효모에서 세포 주기 정지를 일으키는 다른 많은 유전적 수단이 있습니다. cdc34(유비퀴틴 리가아제 SCF 복합체의 구.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

델타 비전 현미경 시설을 유지 관리해 주신 유타 대학교 세포 이미징 코어에 감사드립니다. 이 작업은 부분적으로 NIH 보조금 F31CA2717405(MGS에게) 및 T32GM141848(MGS 및 TCS), 5 For the Fight(MPM), Pew Biomedical Scholars(MPM) 및 NIH 보조금 R35GM142749(MPM에게)의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-요소유타 대학교 코어 합성 시설순서: WHWLQLKPGQPMY
1.5 mL 에펜도르프 튜브악시겐MCT-175-C
10mM dNTP 믹스써모 사이언티픽R0193
50 mL 원뿔관그레이너 바이오-원227 261
5x Phusion HF 반응 완충제뉴잉글랜드 바이오랩스B0518S
아세트산, 빙하피셔 케미컬BP2401C-212
아데닌 헤미황산염 소금시그마-올드리치A9126-100G
한천, 과립에이펙스 케미컬 및 시약20-275
아가로스에이펙스 바이오리서치 제품20-102GP
오토클레이브 암스코 센추리 스팀 살균기스테리스SV-1262
오토클레이드 DI 워터
옥신시그마-올드리치Cat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
카질 레이저 리퀴드카길 연구소20130
D-소르비톨시그마-올드리치S1876-500G
DAPI (40 ,6-디아미디노-2-페닐린돌, 디하이드로클로라이드)분자 프로브Cat#D1306
연어 고환에서 추출한 디옥시리보핵산 나트륨 소금시그마-올드리치D1626
포도당피셔 케미컬D16-10
디나트륨 에틸렌디아민 테트라아세테이트피셔 케미컬S811-10
DMSO써모 사이언티픽20688
FIJI/ImageJ2 대 2.14.0/1.54f이미지J2https://imagej.net/software/fiji/
고정 속도 와류 믹서VWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
형광 현미경 DV 울트라라이카https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE일련번호 #: NV01063. 더 이상 지원되지 않습니다
포름알데히드피셔 케미컬카테고리#F79-500
젤 장치써모 사이언티픽부엉이 이지캐스트 B1
GeneRuler DNA 사다리 혼합발효SM0333
유리 구슬피셔 사이언티브11312A
유리 슬라이드VWR48300-026
이노바 2300 플랫폼 셰이커뉴브런즈윅NB-2300
킴와이프스킴텍06-666
1.5 mL 튜브용 실험실 원심분리기에펜도르프2525
50 mL 튜브용 실험실 원심분리기에펜도르프5804
리튬 아세테이트 이하이드레이트시그마-올드리치L4158-250G
마스터 사이클러 넥서스 X2에펜도르프https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
마이크로피펫 p2, p20, p200, p1000과 해당 팁레이닌L-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
현미경 커버 유리피셔 사이언티브12541014
노코다졸칼바이오케미Cat#487928; CAS: 31430-18-9; 로트#B35705
오렌지 G시그마-올드리치O7252
페그햄튼 리서치HR2-591
펩톤 과립화;피셔 바이오리에이전트BP9725-5
푸전 HF DNA 중합효소뉴잉글랜드 바이오랩스M0530L
피펫-X레이닌PX-100R
인산칼륨, 디베이스써모 사이언티픽424195000
인산칼륨, 단염성써모 사이언티픽424200025
전원 공급바이오-래드23786
시작 획득 Ultra 1.2.2softWoRx 시티바DV 울트라로 얻기
트리스 베이스피셔 바이오리에이전트BP152-10
트리톤 X-100시그마-올드리치9002-93-1
튜브 회전기VWR10136-084
물욕VWRWBE10A11B
물, 울트라 퓨어에이펙스 바이오리서치 제품18-194
효모 추출물 과립피셔 바이오리에이전트BP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....

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