방법 논문

2층 미세유체 장치를 이용한 조직 항상성의 전기기계적 제어 공개

DOI:

10.3791/68894

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2025년 9월 19일

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 상피 조직 항상성의 전기기계적 조절을 연구하기 위해 고유한 2층 미세유체 장치를 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 장치는 조직 평면에 수직인 정적 생리학적 전류를 적용하여 세포 간 접착, 증식 및 압출에 영향을 미칩니다. 살아있는 세포 이미징 및 기계적 응력 측정은 이러한 과정의 메커니즘을 보여줍니다.

초록

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세포 행동과 세포 운명은 내인성 또는 외부에 적용되는 전류 또는 필드의 영향을 받습니다. 정전기 신호는 맞춤형 미세유체 장치에 적용되어 발달, 상처 치유 및 항상성과 같은 느린 생리적 과정에서 전기 환경을 모방할 수 있습니다. 세포 전기 연구의 중요한 종류는 전류 밀도가 ~0.1-1000 A/m2인 상처 전류를 모방하는 간단한 미세유체 채널에서 정적 면내 갈바닉 전류에 의한 세포 이동 제어입니다. 그러나 호환되지 않는 기하학으로 인해 이러한 장치는 세포가 치근단-기저 극성과 경상피 전위차(TEPD)를 채택하는 조직 항상성의 전기적 효과를 연구하는 데 적합하지 않습니다. 여기에서는 합류 상피 세포층의 평면에 수직인 생리학적 이온 전류를 적용하여 TEPD를 교란하고 조직 정상 상태의 전기적 조절을 조사하는 고유한 미세유체 기반 장치에 대해 자세히 설명합니다. 이 설정은 선택한 세포외 매트릭스 단백질로 코팅된 부드러운 폴리아크릴아미드 겔 기판이 내장된 2층 UV 경화 폴리머로 만들어집니다. 이 미세 유체 장치 (microfluidic device) 는 센티메시 스케일의 세포 층에 걸쳐 상대적으로 균일 한 이온 전류를 유도하기 위해 올바른 형상과 투과성 기판을 제공합니다. 이 설정은 공초점 생세포 이미징 및 견인력 현미경과 호환되어 경상피 전류에 의해 유도된 기계적 응력을 추론합니다. 놀랍게도 세포의 증식, 압출 및 이동은 이온 전류의 방향에 따라 합류 상피 내에서 집합적으로 영향을 받아 다양한 세포-세포 상호 작용 강도, 세포 사건(사멸 및 증식) 및 조직 구조를 특징으로 하는 새로운 조직 상태를 유도합니다. 전기적으로 제어되는 세포 거동은 전기적으로 유도된 기계적 응력 및 세포 반응으로 이해될 수 있습니다. 이 새로운 미세유체 장치 및 프로토콜은 기계생물학 및 생명공학 커뮤니티가 조직 항상성의 전기적 효과를 연구하고 새로운 조직 공학 응용 프로그램을 개발하는 데 필요한 도구와 문서를 제공합니다.

서론

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생체 전기 신호는 세포 행동을 지배하는 데 기여하는 중요한 생물물리학적 요소입니다. 가장 유명한 예는 뉴런과 심장 세포의 활동 전위로, 장거리(최대 1미터)와 고주파(최대 수백 헤르츠)로 전기 신호를 전송합니다.1. 전극과 함께 적용된 전기 펄스는 활동 전위 발화를 자극하는 데 사용할 수 있으며 연구 및 의료 응용 분야에 유용합니다2. 발달, 상처 치유 및 항상성 3,4,5,6,7,8 과 같은 느린 생리적 과정에서 내인성 생체 전기 신호도 몇 시간에서 며 칠에 걸쳐 측정되었습니다 9,10. 중요한 예는 몇 밀리볼트에서 수십 밀리볼트 범위의 경상피 전위차(TEPD)를 능동적으로 유지하는 합류 상피층입니다 4,11. 이러한 합류 층의 절단 또는 상처는 조직의 전기적 활동에 의해 구동되는 단락 전류를 생성합니다12,13. 최대 수십 μA/cm2의 권선 전류와 최대 수백 mV/mm의 전기장이 다양한 기술로 보고되었습니다. 연구에 따르면 이러한 전기 신호는 세포가 치유 과정에 중요한 상처 또는 감염 부위로 이동하도록 방향성 신호를 생성합니다 3,6,14. 일반적으로 정적(또는 느리게 변하는) 전기 신호와 빠르게 변하는 전기 신호는 모두 중요하며 서로 다른 세포 또는 조직 반응을 유발합니다.

느리게 변하는 신호의 영역 내에서 한 가지 중요한 현상은 "갈바노택시스"라고 하는 전기 구동 마이그레이션 프로세스입니다. 제어된 면내 갈바닉 전류는 상처 전류를 모방하기 위해 간단한 채널이 있는 미세유체 장치에 적용될 수 있으며 세포 이동은 전류 밀도의 함수로 조사됩니다15,16. 0.1-1000 V/m(0.1-1000 A/m2의 해당 전류 밀도)의 전기장은 이 시험관 내 설정에서 많은 세포 유형에서 세포 이동을 유도하는 것으로 밝혀졌으며17, PI3K와 같은 화학주성(화학적 구배에 의해 유도되는 세포 이동)에 대한 표준 신호 전달 경로는 전기주성과 관련이 있습니다 7,18. 갈바노주시 연구를 위한 "베어본" 미세유체 장치는 표준 소프트 리소그래피 및 미세 가공 기술로 제작할 수 있습니다19. 이러한 장치는 일반적으로 유리 슬라이드에 결합된 단일 채널 폴리디메틸-실록산(PDMS) 기판을 포함합니다(채널 단면 크기: 수백 마이크로미터, 길이: 센티미터). 정전류를 공급하는 데 사용되는 전극은 셀 영역에서 멀리 떨어진 곳에 설치되며 염교 유무에 관계없이 연결됩니다. 소금 다리 연결은 PDMS 기판, 미세유체 커넥터 및 한천으로 채워진 튜브를 통해 구멍을 뚫어 만들 수 있습니다. 채널 아래에 있는 간단한 유리 슬라이드(일반적으로 두께 170μm)는 또한 전기 주시 실험 중 고해상도 살아있는 세포 이미징을 지원하며, 이는 공정 연구에 중요한 기능입니다.

조직 항상성 유지에서 내인성 전기 신호의 역할은 상처 치유보다 훨씬 덜 이해됩니다. 한 가지 중요한 이유는 온전한 조직에서 이러한 효과를 연구할 수 있는 적절한 도구가 부족하기 때문입니다. 갈바노주시용 미세유체 장치는 면내 전류만 지원하는 형상으로 인해 이러한 목적에 적합하지 않습니다. 상피 항상성의 맥락에서 합류 상피층을 가로지르는 TEPD 또는 면외 전류를 제어하고 교란시키기 위한 새로운 장치가 필요합니다. 단층 전체에 비교적 균일한 이온 전류 밀도를 적용한다는 목표를 달성하기 위해 당사는 장치 형상, 재료 사용 및 현장 생체역학적 측정 기능의 혁신을 갖춘 미세유체 장치를 설계 및 제작했습니다4. 전기적 효과가 이 기능으로 연구할 수 있는 생체역학 및 기계생물학 경로와의 결합을 통해 세포 거동에 영향을 미칠 수 있기 때문에 후자의 기능은 중요합니다.

이 새로운 장치는 여러 가지 혁신적인 기능을 보여줍니다. galvanotaxis 장치(형상의 혁신)에서 발견되는 단일 채널 대신 두 개의 레이어로 설계되었으며 전극 챔버에 대한 연결을 후자와 유사하게 유지합니다. 첫 번째 미세유체 층에는 이온 전류를 조직 영역으로(또는 멀어지게) 유도하는 채널이 있는 반면, 두 번째 층에는 이 두 번째 미세유체 층 위에 있는 상피를 가로질러 이 전류를 수직으로 향하게 하는 구멍이 있습니다(그림 1A,B). 미세 가공 기술은 샘플 두께를 증가시키는 미세유체 층의 적층에도 불구하고 고해상도 공초점 이미징이 가능하도록 충분히 얇은 층을 생성하는 데 사용됩니다. 다른 중요한 혁신을 위해 폴리아크릴아미드(PA) 합성 하이드로겔이 장치 중앙에 통합되어 중요한 역할을 합니다(그림 1A,B). 세포외 기질 단백질을 코팅하는 데 사용할 수 있는 화학, 이온에 대한 투과성 및 알려진 탄성과 같은 이 겔의 물리화학적 특성은 각각 세포 부착 및 성장, 면외 전류의 적용 및 전기 자극 중 기계적 응력20 측정에 필수적입니다. 장벽 구조는 이전의 미세유체 장치21에서 수행된 것처럼 PA 겔 전구체 용액을 가두기 위해 조직 영역의 레이어 1에 통합됩니다(그림 1A,B). 마지막으로, PA 겔 중합은 산소 가스를 투과하는 PDMS 표면에서 산소 억제되기 때문에, 또 다른 재료(22)가 장치 제조에 사용되며, 이는 PA 겔의 중합 및 긴밀한 결합을 허용할 수 있다. 모든 혁신적인 기능은 새 장치가 작동하는 데 매우 중요합니다.

전반적으로, 온전한 조직의 항상성에서 정적이거나 천천히 변하는 생체 전기 신호에 대한 심층 연구는 이 새로운 장치를 통해 가능하며, 이에 대한 프로토콜은 아래에 자세히 설명되어 있습니다. 여기에 언급된 프로토콜 및 결과는 전류에 의해 유도되는 세포 사건(증식, 사멸, 압출 및 이동) 및 조직 구조 변화를 포함하는 Madin Darby Canine Kidney II(MDCK II) 상피 세포주에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 연구는 또한 이 기술을 적용하여 세포층 및 1차 세포 및 2D 오가노이드와 같은 보다 복잡한 시스템에서 세포 운명 변화의 상피 수송 및 유도 및 세포 운명 변화를 연구하는 데 관심이 있는 연구자에게도 유익합니다.

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프로토콜

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참고: 이 프로토콜은 정전기를 적용하고 합류 상피의 TEPD를 교란시키는 설정을 구성하고 살아있는 세포 이미징 및 기계생물학 기술을 통해 그 효과를 연구하는 단계를 제공합니다(그림 1). 이 설정은 현미경에서 다중화 실험을 위한 여러 장치를 수용하기 위해 카트리지, 인서트 및 홀더에 결합된 미세유체 칩으로 만들어진 장치, 소스 미터 및 장치에 연결된 한 쌍의 전극 챔버, 적절한 라이브 셀 조건 유지를 위한 라이브 셀 챔버 뚜껑으로 구성됩니다(그림 1C). 카트리지 및 설정의 기타 중요한 구성 요소의 설계 원칙 및 CAD 파일 도면은 보충 파일 1에서 찾을 수 있습니다. 단계는 다음과 같습니다: 1) PDMS 소프트 리소그래피; 2) 칩 제조 및 장치 조립; 3) 설정 완료; 4) 단층 성장 및 살아있는 세포 실험. 이 프로토콜에 사용되는 시약 및 재료에 대한 자세한 정보는 재료 표에 나와 있습니다.

1. PDMS 소프트 리소그래피

참고: 이 섹션에서는 미세유체 칩의 UV 경화 접착제 기반 층을 성형하기 위해 SU-8 웨이퍼(그림 2A, B)에서 PDMS 엘라스토머를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다.

  1. PDMS 소프트 리소그래피
    1. 포토리소그래피 기술(보충 파일 2 및 보충 파일 3)을 사용하여 각 미세유체 층, 레이어 1 및 2에 대해 별도의 SU-8 기반 웨이퍼를 제작합니다.
      참고: 웨이퍼 제조는 미세 가공/클린룸 시설로 요청을 보내는 경우 한 달이 걸릴 수 있습니다. 웨이퍼 제조를위한 실리콘 에칭 기술도 사용될 수 있습니다.
    2. PDMS의 몰딩 해제를 허용하기 위해 실리콘 웨이퍼를 실란화합니다19.
      1. 가압 질소 에어 블로우 건으로 웨이퍼를 청소하십시오. 짧은 산소 플라즈마 공정(1-3mbar의 반응기 압력에서 20sccm O2 가스 흐름에서 30초, 30W)을 적용하여 웨이퍼 표면을 활성화합니다.23.
      2. 깨끗한 플라스틱 캡(직경 60mm, 높이 15mm)에 200μL의 Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane을 피펫팅합니다. 진공 데시케이터의 웨이퍼 옆에 캡을 놓습니다(실란화에만 해당). 진공 펌프를 켜고 기화된 실란이 실리콘 웨이퍼에 단층으로 증착되는 동안 1-2시간 동안 기다립니다.
        주의: 실란은 부식성이 있고 독성이 있습니다. 안전한 작동을 위해 장갑과 보안경을 착용하고 흄 후드에서 작동하십시오.
        참고: 새로 실란화 된 웨이퍼를 사용하여 10-20 개의 PDMS 금형을 제작 할 수 있습니다. 진공 시간은 진공 펌프의 상태에 따라 다릅니다. 과도한 실란화는 두께를 고르지 않게 하고 흐린 외관을 초래하므로 피해야 합니다. 웨이퍼를 사용하지 않을 때는 습도 조절 챔버에 보관하십시오. 새로운 웨이퍼로 만든 PDMS 구조는 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 확인할 수 있습니다.
    3. 페트리 접시(직경 150mm, 높이 25mm)에서 몇 분 동안 충분한 기본 PDMS 수지와 가교제(w:w = 10:1 및 70-80g)를 철저히 혼합합니다. 혼합물에 작은 기포가 균일하게 형성되어 양호한 혼합물을 확인합니다. 혼합물을 50mL 원심분리기 튜브로 옮기고 550 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 기포를 완전히 제거합니다.
      알림: PDMS 액체는 끈적거리고 청소하기 어렵습니다. 부을 때 주의하십시오. 벤치 표면이 엎질러진 PDMS 혼합물로 오염된 경우 이소프로판올로 청소하십시오.
    4. 바닥이 평평한 플라스틱 또는 유리 접시(직경 150mm, 높이 25mm)에 PDMS 혼합물을 웨이퍼에 부드럽게 부은 다음 웨이퍼를 아래로 눌러 웨이퍼 바닥에서 PDMS를 제거합니다. 진공 펌프로 혼합물을 제거합니다.
      참고: 웨이퍼 바닥에서 액체 PDMS를 퍼지하는 것이 중요합니다. 바닥의 두꺼운 PDMS 층은 플라스틱 접시에서 웨이퍼를 제거하기 어렵게 만들어 웨이퍼가 부서질 확률을 높입니다. 또는 웨이퍼 가장자리를 따라 PDMS를 절단하고 웨이퍼를 페트리 접시에 보관할 수 있습니다. 이후 제작 단계에서 금형의 유연성을 보장하기 위해 레이어 1의 PDMS 두께를 약 1.5mm로 보장합니다. 레이어 2의 PDMS 두께를 약 2.5mm로 보장하여 이후 제작 단계에서 처짐이 발생할 가능성을 줄입니다. PDMS 두께는 PDMS 금형을 필요한 모양으로 절단한 후 눈금자로 측정됩니다.
    5. PDMS를 80°C의 오븐에서 2시간 동안 경화시키고, 이 과정에서 접시가 가능한 한 수평으로 놓이도록 합니다. PDMS 금형과 웨이퍼를 실온으로 식히십시오. 날카로운 수술용 칼날과 패딩 처리된 핀셋을 사용하여 웨이퍼에서 PDMS 몰드 전체를 조심스럽게 제거합니다.
      알림: 웨이퍼 표면이 긁히지 않도록 주의하십시오. PDMS를 벗겨낼 때 웨이퍼 표면에 PDMS 잔여물이 형성되는지 확인하십시오. 이것은 웨이퍼 표면이 다시 실리콘 화되어야 한다는 신호입니다.
    6. PDMS 금형을 관심 있는 기능이 포함된 블록으로 자르고 사용하지 않을 때는 이 블록을 깨끗한 페트리 접시(직경 150mm, 높이 25mm) 또는 진공 챔버에 보관합니다. 필수 기능을 건드리지 않고 PDMS 금형을 조작합니다.

2. 칩 제조 및 장치 조립

참고: 저점도, UV 경화성 폴리머(최대 UV 흡수 범위 350-380nm)를 사용하여 PDMS 성형을 통해 미세유체 칩을 제작합니다. UV 경화형 접착제를 사용하면 폴리아크릴아미드(PA) 하이드로겔을 투명하고 이온 투과성 및 탄성 셀 기질로 통합할 수 있습니다. PA 젤의 특성은 살아있는 세포 이미징 및 정적 전류 자극을 허용하는 조직 기계적 스트레스 센서로 이를 지원합니다. 칩은 최종적으로 배양 배지를 수용하고 전극 챔버에 연결되는 카트리지에 부착됩니다.

  1. 유리 커버슬립 베이스 준비
    1. 카트리지 치수에 맞게 다이아몬드 커터를 사용하여 필요한 양의 직사각형 유리 커버슬립(170μm)을 37 × 24mm2의 크기로 채점합니다(보충 파일 4).
      참고: 커버슬립은 고해상도 이미징과 호환되는 170μm 두께를 가지고 있지만 깨지기 쉽고 조심스럽게 다루어야 합니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오. 직사각형 유리 커버슬립의 칩이 누출될 위험이 있으므로 눈에 보이는 균열이 나타나면 직사각형 유리 커버슬립을 즉시 폐기하십시오. 또는 커버슬립 제조업체에 적절한 크기의 커버슬립을 주문하십시오. 직사각형 유리 커버슬립의 표면을 맨손으로 만지지 않도록 하고 이미징 품질을 저하시킬 수 있는 얼룩을 남기지 마십시오.
    2. 직사각형 커버슬립을 겹치지 않고 깨끗한 페트리 접시에 넣고 플라즈마 챔버로 옮깁니다. 진공 상태를 유도하되 마지막에 약간의 공기를 들여보내십시오. 공기 플라즈마를 사용하여 직사각형 유리 커버슬립의 표면을 활성화합니다(장비 상태에 따라 30초에서 5분, 29.6W).
      참고: 플라즈마에 완전히 노출된 측면(즉, 상부 표면)만 후속 단계(단계 2.1.3)에서 사용해야 합니다. 혈장 노출 후 30분 이내에 2.1.3단계를 완료하십시오. 챔버는 공기 플라즈마가 생성된 경우 이 단계에서 분홍색-보라색으로 나타나야 합니다. 후자의 결합 단계가 성공하면 편의를 위해 플라즈마 지속 시간을 줄입니다.
    3. 100% 에탄올에 용해된 0.3% 아세트산과 0.5% 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트로 만든 표면 처리 용액 10mL를 준비합니다. 이 용액으로 직사각형 유리 커버슬립을 페트리 접시(직경 150mm, 높이 25mm)에 셰이커에서 5분 동안 처리하여 UV 경화 가능한 접착제 기반 미세유체 층과 잘 접착할 수 있도록 합니다. 직사각형 유리 커버슬립이 용액에 완전히 잠기고 양면이 처리되었는지 확인하십시오.
      주의 : 표면 처리 용액은 부식성이 있습니다. 퓨임 후드에서 다루십시오.
    4. 직사각형 유리 커버슬립을 100% 에탄올로 세 번 헹구고 그 과정에서 건조시키지 마십시오. 질소 가스와 블로우 건으로 직사각형 유리 커버슬립을 하나씩 건조시킵니다. 커버슬립 베이스 표면에서 액체 방울을 깨끗하게 제거하여 액체 얼룩을 방지하는 충분한 블로우 속도를 확인하십시오. 직사각형 유리 커버슬립을 깨끗한 페트리 접시(직경 150mm, 높이 25mm)에 보관하십시오.
      알림: 블로우 건을 사용하여 커버슬립 베이스와 평행하게 공기 흐름을 유도하고 안경이 깨지는 것을 방지하기 위해 과도한 블로우 속도를 사용하지 마십시오.
  2. 레이어 1 제작(그림 2C)
    1. 깨끗한 플라스틱 접시 캡(직경 60mm, 높이 15mm)에 깨끗한 레이어 1 PDMS 몰드를 앞면이 위로 향하게 놓고 평평하게 만듭니다. 500μL 액체 UV 경화성 접착제를 금형에 천천히 피펫팅하고 주걱을 사용하여 돌출된 모든 구조물을 조심스럽게 적십니다. 습윤 과정으로 인한 기포를 제거하십시오.
      알림: 깨끗한 PDMS 금형은 테이프를 사용하여 먼지나 UV 경화 접착제 잔여물을 제거하거나 에탄올로 청소하여 준비할 수 있습니다. 추가 예방 조치를 위해 PDMS 금형을 사용하지 않을 때는 진공 챔버에 보관하십시오.
    2. 커버슬립을 PDMS 금형에 부드럽게 누릅니다. UV 경화성 접착제 잔여물이 깨끗하고 평평한 커버슬립을 방해할 수 있으므로 과도한 UV 경화 접착제가 커버슬립의 윗면을 적시는 것을 방지하십시오. 실험실 와이퍼로 과도한 UV 경화 접착제를 제거합니다.
      알림: UV 경화 접착층으로 전사된 PDMS 금형의 기능이 접착될 카트리지와 정렬되는지 확인하는 것이 중요합니다. 그렇게 하려면 카트리지 웰(3개)의 중심이 위치할 가용성 마커 펜으로 커버슬립을 표시하십시오. 이 표시를 사용하여 직사각형 유리 커버슬립을 아래로 누를 때 커버슬립을 PDMS 금형 피처에 정렬합니다.
    3. 균일하게 조명된 UV 광선(363-370nm, 224mW/cm2)에서 10초 동안 구조물을 부분적으로 경화시킵니다. 나중에 75% 에탄올로 자국을 닦아냅니다. 구조물을 평평한 표면에 단단히 고정하고 레이어 1 PDMS 몰드를 천천히 벗겨냅니다.
      참고: 부분 경화를 통해 충분히 견고한 UV 경화 가능한 접착층을 형성할 수 있어 이 단계에서 PDMS 금형을 벗겨낼 수 있습니다. 이는 또한 2층 UV 경화 접착 구조의 제작을 위한 후속 단계에서 부분적으로 경화된 레이어 2와의 결합을 용이하게 합니다. 1.5mm의 두께로 준비된 레이어 1 PDMS 금형(1.2.4단계)은 박리 과정에서 얇은 커버슬립이 부서질 가능성을 줄이는 충분한 PDMS 유연성을 보장합니다. PDMS 금형은 최대 10회에서 20회 재사용할 수 있으며, 그 후 PDMS 표면에 UV 경화 가능한 접착제 잔여물의 희끄무레한 층이 생겨 구조 두께가 줄어들 수 있습니다. 이 경우 새 PDMS 금형을 사용하십시오.
  3. 레이어 2 제작(그림 2D)
    1. 깨끗한 레이어 2 PDMS 몰드를 평평한 PDMS 슬래브(높은 강성을 보장하기 위해 슬래브 두께 > 2.5mm)에 앞면이 아래로 향하게 놓습니다. 핀셋을 사용하여 위에서 기능을 가볍게 탭합니다. 피처 아래의 어두워짐 또는 광학적 대비에 대한 인터페이스를 관찰하십시오 - 이것은 적절한 접촉을 나타냅니다.
      알림: 주요 특징(두 개의 둥근 개구부와 슬릿)을 둘러싼 지지 기둥은 PDMS 금형 표면이 처지는 것을 방지하는 데 중요합니다.
    2. 모세관 효과를 통해 PDMS 몰드와 슬래브 사이의 공간을 액체 UV 경화 접착제로 채웁니다. UV 광선(363-370nm, 224mW/cm2)에서 10초 동안 구조를 부분적으로 경화시킵니다.
    3. 부드러운 패딩 핀셋을 사용하여 PDMS 슬래브에서 복합 UV 경화 접착층과 PDMS 몰드를 부드럽게 벗겨냅니다. 필요한 경우 날카로운 가위로 UV 경화 접착층의 과도한 가장자리를 다듬습니다.
  4. 레이어 1 및 2 본딩(그림 2E)
    1. 평평한 표면에 직사각형 유리 커버슬립에 부착된 레이어 1을 놓습니다. 레이어 2(여전히 PDMS 몰드에 부착되어 있음)를 레이어 1에 맞추고 두 레이어를 모두 단단히 눌러 피처 아래에 "그림자"가 나타나도록 합니다.
    2. UV 광선(363-370nm, 224mW/cm²)에서 10초 동안 구조를 경화하여 미세유체 칩의 2층 구조를 형성하는 레이어 1과 2를 결합합니다. 칩에서 PDMS 몰드를 부드럽게 떼어냅니다.
      참고: 칩에서 PDMS 몰드를 성공적으로 벗겨내려면 핀셋을 사용하여 2.4.1단계에서 UV 경화 접착제 레이어 2에서 각 PDMS 지지 기둥을 분리합니다. 이 작업은 PDMS 금형과 레이어 2 사이의 전반적인 접착력을 줄이는 데 도움이 되며, 이는 박리에 중요합니다.
  5. 폴리아크릴아미드 겔 통합(그림 2F)
    참고: 이 섹션 전에 다중화 실험에 필요한 만큼의 칩을 준비하십시오.
    1. 선택24 의 PA 겔 강성에 해당하는 아래 표의 성분을 부드럽게 혼합하여 PA 겔 전구체 용액을 준비합니다( 표 1 확인). 산소는 겔화를 억제하므로 피펫팅 중에 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
      주의: TEMED와 APS는 독성이 있습니다. 연기 후드에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.
      참고: 소량의 액체가 포함되므로 신중한 피펫팅 및 취급이 필요합니다(PA 겔 전구체 용액 1mL에 대해 1μL TEMED). 겔 강성은 많은 기계생물학 연구에서 나타난 바와 같이 세포 거동에 영향을 미칠 수 있습니다. 실험에 가장 적합한 강성을 선택하십시오. 형광 비드는 겔 변형 및 기계적 응력 추론을 위한 기준 마커 역할을 합니다. 용액을 PA 겔 전구체 용액에 피펫팅하기 전에 Vortex 비드 용액. PA 겔 전구체 용액은 두 개시제가 모두 첨가될 때 겔화되기 시작하고 소량은 이 짧은 시간 동안 완전히 혼합하기 어렵기 때문에 소량의 TEMED를 마지막으로 혼합하지 않는 것이 좋습니다.
    2. 즉시 조직 영역의 중앙과 레이어 2의 슬릿 위에 PA 겔 전구체 용액 10μL를 피펫팅합니다(그림 1B, 2F). 둥근 유리 커버슬립(직경 10mm)으로 부드럽게 눌러 평평한 젤을 만듭니다. PA 용액이 슬릿을 통해 레이어 1로 흐르는 것을 관찰하고 배리어 기둥 행에서 멈춥니다.
      참고: 10μL 부피의 PA 겔 전구체 용액은 레이어 2 위에 100μm 두께의 겔을 생성합니다. 필요한 젤 두께에 따라 이 부피를 변경하십시오. 개시제가 추가되면 PA 용액이 중합되기 시작하므로 가능한 한 빨리 칩에 용액을 피펫팅합니다. 용액이 배리어 기둥을 가로질러 넘쳐 채널을 막는 것을 방지하기 위해 적절한 양의 힘으로 용액을 누르십시오. 채널이 차단된 경우 칩을 폐기하십시오. 강성이 5kPa 이하인 소프트젤의 경우 유리 발수제를 사용하여 둥근 유리 커버슬립을 처리하여 커버슬립을 소수성으로 만듭니다. 특히 커버슬립을 유리 발수제에 5분간 담그고 100% 에탄올로 3회 헹구고 질소 가스로 건조시킨다. 이렇게 하면 나중에 젤을 파괴하지 않고 중합된 겔에서 커버슬립을 쉽게 벗길 수 있습니다.
    3. UV 광선(363-370nm, 224mW/cm2)에서 5분 동안 미세유체 칩을 즉시 경화시킵니다. PA 젤이 완전히 응고될 때까지 최소 ~1시간 동안 기다리십시오.
      참고: 이렇게 하면 중합된 PA 겔이 구조에 결합되는 동안 칩이 완전히 경화됩니다. 2.5.1, 2.5.2 및 2.5.3 단계를 빠르게 연속적으로 완료해야 합니다.
    4. 칩을 HEPES(0.1M, pH 7.4)에서 최소 1시간 이상 완전히 배양하여 겔을 적시고 커버슬립과 겔 사이의 접착력을 느슨하게 합니다. 날카로운 핀셋으로 덮개 유리를 부드럽게 제거합니다.
      참고: 강성이 5kPa 이하인 부드러운 젤의 경우 셰이커에서 배양 기간을 최대 10시간까지 늘려 젤 구조를 방해하지 않고 젤에서 커버 유리를 깨끗하게 제거합니다. 때로는 직사각형 커버슬립 베이스와 UV 경화 접착제 기반 레이어 1 사이에 수십 및 수백 마이크로미터의 구조 패턴이 형성될 수 있습니다. 이러한 패턴은 명시야 이미징을 방해할 수 있지만 형광 이미징에는 최소한의 영향을 미칩니다. 이것은 2.1.2단계에서와 같이 직사각형 커버슬립의 플라즈마 활성화에 의해 개선될 수 있습니다.
  6. 칩 및 카트리지 본딩(그림 2F)
    1. 세척한 의료용 폴리카보네이트 카트리지(보충 파일 4)를 바닥이 위로 향하도록 평평한 표면에 놓습니다. 측면에서 실험실 물티슈로 칩의 젤을 말리십시오. 칩을 아래로 향하게 하여 카트리지에 맞춥니다.
      알림: 새로운 카트리지 디자인을 테스트할 때 기계 가공 또는 3D 프린팅 방법을 사용할 수 있습니다. 디자인이 설정되면 사출 성형을 사용하여 대량의 카트리지를 생산할 수 있습니다.
    2. UV 경화 접착제를 칩과 카트리지 사이의 틈새에 피펫팅하면 모세관 효과를 통해 채워집니다. UV 광선(363-370nm, 224mW/cm2)으로 5분 동안 경화합니다.
      알림: UV 경화 접착제가 채널이나 커버슬립 베이스의 반대쪽으로 넘치지 않도록 주의하십시오.
  7. 중합되지 않은 PA 용액 제거
    1. PDMS 마개와 주사기를 사용하여 폐기물 제거 채널을 통해 약 5mL의 HEPES(0.1M, pH 7.4)를 끌어와 세포에 독성이 있는 중합되지 않은 PA 겔 전구체 용액을 씻어냅니다.
    2. 장치당 2mL의 HEPES(0.1M, pH 7.4)와 함께 장치에서 겔을 배양하고 1-2일 동안 셰이커에 올려 중합되지 않은 PA 겔 전구체 용액을 완전히 제거합니다.

3. 설정 완료

참고: 장치가 만들어진 상태에서 세포 파종을 위해 PA 겔을 ECM 단백질로 코팅하고, 전기 자극을 위해 장치를 전극 챔버에 연결하고, 장치를 인서트, 홀더 및 다중화된 라이브 셀 이미징 실험을 위한 라이브 셀 챔버 뚜껑에 배치하여 설정(그림 1C)을 완료합니다.

  1. 멸균된 부품의 준비
    1. 장치 (재료 표)를 제외한 설정의 모든 구성 요소는 먼저 비눗물에서 30 분 동안, 그 다음 MQ 물에서 30 분 동안, 마지막으로 75 % 에탄올에서 30 분 동안 초음파 처리해야합니다. 그 후 60°C의 오븐에서 건조시킨 후 생물안전 캐비닛에서 200-280nm의 자외선으로 30분 동안 처리하여 살균을 달성합니다.
  2. ECM 단백질을 이용한 PA 겔 기능화
    1. 생물 안전 캐비닛에서 UV 광선(200-280nm)으로 장치를 멸균합니다.
    2. 얼음 위의 1x DPBS에 필요한 양의 50μg/mL 콜라겐 I 작업 용액을 준비합니다.
      참고: 겔화를 방지하기 위해 콜라겐 I 비축량을 얼음 위에 보관하십시오. 겔을 완전히 담그기 위해서는 각 장치에 100-150μL의 콜라겐 I 작업 용액이 필요합니다. 섬유질 형성을 방지하기 위해 콜라겐 I 용액을 부드럽게 피펫팅합니다.
    3. 얼음 위에 필요한 양의 Sulfo-SANPAH(SS) 작업 용액을 준비합니다. 각 겔 처리에는 약 80μL의 SS 작업 용액이 필요하며, 여기서 2μL SS 원액(무수 DMSO에 용해됨)을 80μL의 저온 HEPES(4°C 냉장고, 0.1M, pH 7.4)에 희석합니다.
      참고: SS는 습기에 민감합니다. 개봉하기 전에 스톡 바이알을 실온으로 평형을 유지하여 제품에 수분이 결로되지 않도록 하십시오. 최상의 성능을 위해 무계량 SS를 사용하고 무수 DMSO에서 스톡을 준비하십시오. 가능한 한 빨리 사용하십시오. SS 작업 용액을 준비하기 위해 SS의 가수분해 속도를 낮추기 위해 차가운 HEPES 완충액을 사용합니다. 각 젤은 PA 젤 표면이 잘 기능화되도록 SS 작업 용액으로 두 번 처리해야 합니다.
    4. 젤 가장자리에 실험실 물티슈로 두드려 장치의 젤을 건조시킵니다. 겔에 80μL의 SS 작업 용액을 피펫팅하여 겔 표면이 SS 용액에 완전히 잠기도록 합니다. 젤을 UV(363-370nm, 24.5mW/cm2)로 5분 동안 처리하여 SS를 활성화합니다. 차가운 HEPES(0.1M, pH 7.4)로 3회 헹굽니다.
      알림: SS가 벽에 끌리는 것을 방지하기 위해 카트리지 웰 중앙에 SS를 조심스럽게 피펫팅하십시오.
    5. 3.2.4단계를 반복하되 마지막에 차가운 1x DPBS로 세 번 헹굽니다.
      참고: SS 가수분해를 방지하기 위해 3.2.3 - 3.2.5단계를 빠르게 연속적으로 수행해야 합니다. 헹군 젤은 SS에 의한 표면 활성화가 성공하면 이 단계에서 더 어두운 빨간색 음영으로 나타나야 합니다.
    6. 100μL 콜라겐 I 용액을 PA 젤에 피펫팅하고 겔이 완전히 잠기도록 합니다. 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 부착되지 않은 콜라겐을 1x DPBS로 세 번 헹굽니다. 사용하기 전에 젤을 1x DPBS에 담그십시오.
      참고: 콜라겐 I 코팅 샘플은 4°C 냉장고에 며칠 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 전극 챔버에 장치 연결
    1. 나사를 사용하여 장치를 인서트에 부착합니다(그림 1C, 나사 유형: M3 X 10mm). 그런 다음 최대 4개의 장치 인서트 어셈블리를 현미경 스테이지에 장착하도록 설계된 홀더에 고정합니다(나사 유형: M3 X 5mm).
      참고: 최대 수의 장치 삽입 어셈블리를 사용하지 않는 경우 다른 모든 홀더 슬롯을 빈 장치로 채워 공간을 밀봉하여 나중에 이미징 실험을 위해 양호한 살아있는 세포 조건을 보존할 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 빈 장치는 카트리지를 벌거벗은 직사각형 유리 커버슬립에 접착하여 간단히 만들 수 있습니다.
    2. 장치에 배양 배지(DMEM++, 각 메인 웰에 2mL)를 채웁니다. 폐기물 제거 채널을 통해 배지 2mL를 추가로 당겨 1x DPBS를 씻어내고 교체합니다.
    3. 전극 챔버 역할을 할 관통 구멍이 있는 캡이 있는 50mL 튜브 2개를 준비합니다. 백금 전극과 Tygon 튜브에 단단히 맞도록 적절한 크기와 수량의 구멍을 만들어 전극 챔버를 장치에 연결합니다. 각 전극 챔버를 45mL의 배양 배지로 채웁니다.
      알림: 날카로운 수술용 칼날을 사용하여 캡에 구멍을 쉽게 만들 수 있습니다.
    4. 전극 챔버와 장치 사이의 연결 준비: 각 장치에 두 개의 튜브 커넥터를 연결합니다. 각 Tygon 튜브에 튜브 클립을 끼웁니다(그림 1C). 주사기로 배양 배지를 튜브를 통해 당겨 단단히 고정합니다. 매체로 채워진 튜브의 한쪽 끝을 전극 챔버에 연결하고 다른 쪽 끝을 장치에 연결합니다.
      알림: 예열된 매체를 사용하거나 진공 챔버에서 매체를 탈기하여 튜브에 기포가 발생할 가능성을 줄입니다. Tygon 튜빙과 튜빙 커넥터 사이의 인터페이스에서 기포가 형성되는 것을 방지하고, 튜브의 매체에 담그기 전에 튜빙 끝을 꼬집어 매체 표면을 부풀리게 하거나, 튜빙 커넥터에 물리적으로 부착합니다.
    5. 실험실 잭을 사용하여 장치의 배양 배지 표면과 전극 챔버 사이의 상대 높이를 조정합니다. 튜브 클립을 풀고 모든 중간 표면이 동일한 높이로 평형을 이루도록 합니다.
      알림: 유체가 넘치지 않도록 전체 설정을 이동할 때마다 튜브 클립을 고정하는 것을 잊지 마십시오.
    6. 전원 계량기를 사용하여 각 장치의 저항을 개별적으로 측정하여 품질 관리를 수행합니다.
      알림: 저항을 측정하는 장치의 튜브 클립만 풀고 병렬로 연결된 다른 장치의 클립은 단단히 고정하십시오.

4. 단층 성장 및 살아있는 세포 실험

참고: 적절한 합류 단층을 형성하고 단층의 합류와 전기 저항에 따라 균일하게 분포된 전류 밀도를 달성합니다. 그런 다음 장기 이미징 및 전기 자극 실험을 위해 현미경에서 적절한 살아있는 세포 조건을 확인합니다.

  1. 단층 성장
    1. T25 플라스크에서 트립신을 사용하여 MDCK 세포를 분리합니다. 원심분리하여 10만 개의 세포를 얻는 데 필요한 배지 부피를 계산합니다. 이 수의 세포를 현탁시키고 원심분리기 튜브의 2mL 배지에 잘 혼합합니다.
    2. 세포가 함유된 모든 배지를 조직 영역의 웰에 피펫팅합니다. 전체 설정을 조직 배양 인큐베이터로 천천히 옮기기 전에 세포를 15분 동안 침전시킵니다.
      참고: 각 장치에 대해 10만 개의 세포의 파종 밀도는 제곱센티미터당 006만 개의 세포(6 × 104 세포/cm2)에 해당합니다. 이 파종 밀도는 충분히 희박하며 세포는 합류 상태에 도달하기 전에 2일 동안 자랍니다. 이 과정은 조직을 교란시킬 위험이 있는 과도한 부착되지 않은 세포를 헹굴 필요 없이 적절하게 분극되고 균질한 단층을 보장합니다. 침전 단계는 세포의 파종이 균일하도록 방해받지 않고 두는 것이 중요합니다.
    3. 세포가 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 90% 습도)에서 72시간 동안 성장하여 >~50 세포/100μm2의 세포 밀도에 도달하도록 합니다. 위상차가 있는 벤치탑 현미경에서 매일 확인하여 성장 과정을 모니터링합니다.
      참고: 이 수의 세포를 시딩하면 MDCK 세포는 24시간 후에 70%-80% 컨플루언에 도달하고, 48시간 후에 완전한 컨플루언에 도달하고, 72시간까지 추가 세포 밀도 증가 및 조직 성숙에 도달합니다. 24시간 후 평균 셀 길이는 약 10-20μm입니다. 48시간에, 세포-세포 접합부와 세포체는 위상차 영상에서 명확한 대비를 갖는다. 이 대비는 72시간 후에 급격히 감소합니다.
  2. 살아있는 세포 이미징
    1. 실험 필요에 따라 낙산화 형광 또는 공초점 현미경을 선택하십시오. 세포가 발현하거나 형광 마커로 염색되는 경우 세포 모양 및 겔 기질 변형의 3차원 관찰을 위해 공초점을 선택하십시오. 2차원 관찰의 경우 광독성이 적은 위상차와 낙후형광을 선택하십시오. 설정을 현미경으로 가져오기 1시간 전에 라이브 셀 시스템을 켜면 현미경 스테이지 탑 인큐베이터가 37°C, 5% CO2 및 90% 습도로 안정화됩니다.
      알림: 라이브 셀 시스템 컨트롤러는 스테이지 상단 인큐베이터의 조건을 표시하고 조건이 최적이 아닐 때 경고음을 울립니다. 스테이지 탑 인큐베이터 뚜껑은 바깥쪽으로 확장되는 장치 튜브를 수용해야 하기 때문에 상업용 뚜껑과 다르기 때문에 장시간 실험(며칠에서 최대 일주일)을 위한 양호한 살아있는 세포 조건을 보장하기 위해 시스템을 재보정해야 합니다. 교정은 사용자 매뉴얼에 따라 수행할 수 있으며, 센서의 위치는 교정 조건에서와 실험에서 동일하게 유지되어야 합니다. 스테이지 탑 인큐베이터에서 배지의 증발 속도를 확인하고 페놀 레드 주입 배지로 pH 조건을 확인하십시오.
    2. 전극 챔버가 측면에 있는 현미경에 설정을 장착합니다. 현미경 전자 스테이지가 움직일 수 있는 충분한 공간이 있고 전극 챔버에 부딪히지 않는지 확인하십시오. 중간 표면 높이가 평형을 이루고 장치와 전극 챔버의 높이 사이의 높이가 동일한지 확인하십시오.
      참고: 조직 영역이 있는 장치 웰의 중간 표면(그림 1C)은 명시야 및 위상차 이미징에 상당한 영향을 미칩니다. 반월상연골은 원치 않는 빛 초점을 유발합니다. 배지 표면이 웰 가장자리에서 평평한지 확인하되, 살아있는 세포 챔버의 배지 증발로 인해 일정 시간이 지나면 이 평평한 표면이 왜곡될 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위한 한 가지 해결책은 평평한 유리 커버슬립을 매체 표면과 접촉시켜 이 표면을 평평하게 만드는 것입니다. 이 커버슬립은 세포 성장에 중요한 가스 교환을 방해하지 않도록 우물보다 면적이 작아야 합니다. 또 다른 옵션은 배지 위에 세포 배양 등급 미네랄 오일을 겹겹이 쌓는 것입니다.
    3. 소프트웨어를 설정합니다.
      1. 낙후형광 현미경을 사용한 전체 조직 이미징을 위한 10x 또는 20x 대물 렌즈를 선택하고 고해상도 공초점 이미징을 위해 30x 대물 렌즈(WD 0.8mm, NA 1.05)를 선택하십시오.
      2. 전체 조직 이미징의 경우 조직 영역의 직사각형 영역을 덮기 위해 여러 위치를 선택합니다(그림 1A, 예: 5행 x 5열, 중간 행은 슬릿을 덮고 나머지는 슬릿 외부). 결과 부분에 사용된 세포주에 따라 형광 및 명시야 채널을 선택합니다(녹색 형광의 경우 채널 488, 적색 형광의 경우 채널 561). 최대 며칠 동안 이 장기 이미징 실험에서 광독성을 줄이기 위해 1시간 간격을 선택하십시오.
        알림: 전체 조직의 더 큰 보기가 필요한 경우 4x와 같은 다른 대물 렌즈를 선택할 수 있습니다.
  3. 전기 자극
    1. 각 장치의 장치 수, 상대 장치 저항 및 목표 전류를 확인하십시오. 전체 설정에서 몇 시간에서 최대 일주일 동안 공급할 총 전류를 결정합니다.
    2. 전류 클램프 모드에서 전기 신호를 소싱합니다. 동일한 채널 저항을 가진 3개의 장치의 경우 하나의 제어 그룹(전류 없음, 튜브 클립 고정), 하나의 정점-기저(AtB) 전류 조건 및 하나의 기저-정점(BtA) 전류 조건(그림 1D)이 있는 경우 소스 미터로 총 20μA의 전류를 공급합니다. 이로 인해 생리학적으로 관련된 추정 전류 밀도 ~10μA/cm2 로 각 장치에 10μA가 공급됩니다(자세한 내용은 논의 참조).
      알림: 총 전압은 Tygon 튜브의 길이에 따라 약 수십 밀리볼트입니다. 이러한 전류는 며칠에서 최대 일주일 동안 지속적으로 공급될 수 있습니다. 페놀 레드 표시기는 전극 챔버(양극이 있는 챔버에서 더 산성)에서 색상이 변하지만 잘 보정된 스테이지 탑 인큐베이터에서는 변하지 않습니다. 살아있는 세포 상태가 잘 유지되는 한 세포는 건강한 상태를 유지합니다. 연구원은 격일에 한 번씩 스테이지 탑 인큐베이터의 배지를 교체하고 며칠에 한 번씩 전극 챔버의 배지를 교체할 수 있습니다. 매체가 넘치지 않도록 전극 챔버를 전환할 때 튜브 클립을 고정하십시오. 3.1.1단계에서 언급했듯이 홀더 공간을 덮을 빈 장치가 있어야 합니다. 이렇게 하면 라이브 셀 챔버가 적절한 상태에 있습니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 모든 결과는 이전 간행물4에서 채택되었습니다. 자세한 내용은 이 간행물을 참조하십시오.

이 프로토콜을 사용하면 세포 또는 조직의 평면에 수직인 외부 이온 전류 또는 전기장을 적용할 수 있습니다. 이 전기 자극은 내인성 경상피 전위차(TEPD)를 교란하고 조직 거동을 제어하는 TEPD의 역할을 연구할 수 있게 해줍니다. 프로토콜에 따라, 야생형 및 유전자 편집 MDCK 세포(GFP-액틴, H1-GFP 및 GFP-E-cadherin MDCK)를 장치에 시딩하고 3일 동안 컨플루언션으로 성장시켰습니다. 전류 방향의 영향을 연구하기 위해 홀더에 3개의 장치를 배치하고 동일한 전극 챔버와 전원 미터에 연결했습니다. 한 장치는 제어 역할을 했으며(전류 없음, Tygon 튜브 클리핑), 다른 두 장치는 전류 방향이 서로 반대되도록 반대 방향으로 배치되었습니다(BtA: 기저에서 정점 방향으로 가리키는 전류, AtB: 정점에서 기저 방향으...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 경상피 전위 섭동 실험을 수행하고 살아있는 세포 이미징 및 기계생물학 방법을 통해 생체 전기 효과를 연구하기 위한 새로운 미세유체 장치를 제작하기 위한 자세한 단계와 설계 논리를 제공합니다. 이 방법의 중요성은 다른 관련 방법과 비교할 때 분명합니다. 예를 들어, 한 가지 관련 방법은 정지된 면내 전류를 적용하여 갈바노주시스(전류 밀도의 함수로서의 세포 이동)15,16를 연구하는 단일 채널 설계의 간단한 미세유체 칩을 사용합니다. 두 칩 설계는 인가된 전류의 대칭과 전류에 의해 제어되는 셀 동작이 크게 다릅니다. galvanotaxis를 자극하는 전류는 세포의 전면 극성과 세포 이동에 작용하는 반면, TEPD를 교란시키는 전류는 세포의 정점-기저 극성과 조직 정상 상태에 작용합니다. 이 프로토콜에 제시된 것과 비교할 수 있는 또 다른 방법은 유체 펌프...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자가 모든 이해 상충을 공개했는지 확인하십시오.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XJ, PX, FF 및 TBS는 Xumei Gao 박사, Xinru Yu 및 조직 생물물리학 연구소의 다른 그룹 구성원과의 유용한 토론을 인정합니다. 원리도 도면을 도와준 Westlake University의 CTSF(Customized Technology Service Facility)에 감사드립니다. 이 작업은 Westlake Education Foundation, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, Westlake University의 RCIF(Research Center for Industries of the Future)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1x DPBS깁코14190144
3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트, TPM시그마2530850개봉 후 질소 아래에 보관하십시오.
50mL 팔콘 튜브코 닝43082950mL 팔콘 튜브 캡에 4개의 구멍을 뚫어 전극과 튜브가 캡을 통과하고 배지에 담글 수 있도록 합니다. 미세유체 장치 세트의 경우 최소 2개의 캡이 필요합니다.
아세트산시노팜10000208
아크릴아미드 용액, 40%시그마79061유독
공기펌프자리오코랩오코-AP현미경 스테이지 탑 인큐베이터의 구성 요소
과황산암모늄, APS알라딘A112447
카트리지--카트리지는 맞춤 제작되며 디자인은 보조 재료를 참조합니다. 원료는 PC Makrolon 2858 의료용 등급이며 여기에서 자세한 내용을 확인할 수 있습니다. https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
클립--로버트 클립, 튜빙용  외부 직경 4.5mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
콜라겐 I코 닝354236
DI Milli-Q 물밀리큐-
Dulbecco's Modified Eagle's Medium 배양 배지, DMEM(고포도당)깁코11965092DMEM++은 10% 가 추가된 DMEM입니다. FBS(Sigma-Aldrich) 및 100  단위/mL 페니실린-스트렙토마이신(Gibco).
인클로저 블랙 케이지오코랩H201현미경 스테이지 탑 인큐베이터의 구성 요소
Epi-Fluoresence 도립 현미경올림푸스IX83 시리즈
에탄올 절대시노팜10009218
태아 소 세럼시그마F8318
형광 구슬, 0.1 & L, 레드(580/605)열F8801
가스 처형실오코랩H201-이전-SP200/400/600현미경 스테이지 탑 인큐베이터의 구성 요소
가스 수동 믹서오코랩2GF-믹서현미경 스테이지 탑 인큐베이터의 구성 요소
유전적깁코10131027GFP– 액틴 및 H1– GFP MDCK는 0.5&thinsp가 보충된 배지를 사용하여 유지되었습니다. 유전자 발현을 유지하기 위한 mg/mL 제네티신(Gibco)
헴스시그마736459
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