Alcian Blue로 염색한 Zebrafish 두개안면 조직의 해부

요약

여기에 설명된 프로토콜은 생후 5일 된 제브라피쉬 유충의 두개안면 연골을 염색하고 해부하기 위한 간단하고 따라하기 쉬운 절차를 제시합니다. 다양한 발달 조건에서 이러한 구조의 해부학, 모양 및 크기를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

제브라피쉬는 광학적 투명성을 감안할 때 배아에서 두개안면 연골이 형성되는 메커니즘을 연구하는 데 탁월한 척추동물 모델입니다. 두개안면 연골은 크게 신경두개골과 내두개골의 두 그룹으로 분류할 수 있으며, 이는 무엇보다도 뇌를 지지하고 영양 및 호흡 장치를 구성하는 데 필요한 수많은 연골 그룹으로 세분화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 먼저 이러한 연골 그룹을 시각화하기 위해 제브라피쉬에서 간단하고 확립된 염색 절차를 설명한 다음 신경과 내장 두개를 해부하고 분리하는 방법론을 설명합니다. 이러한 해부에서 간단한 모양과 크기 메트릭을 쉽게 얻을 수 있으며, 이 프로토콜에서는 인간의 대부분의 두개안면 장애에서 종종 영향을 받는 조직인 전방 신경두개골의 일부인 입천장에 대해 이것이 입증됩니다. 이 프로토콜은 자원이 제한된 환경에서도 간단한 방식으로 복제할 수 있으므로 학부생이 두개안면 형태를 소개할 수 있는 귀중한 교육 도구를 제공합니다.

서론

척추동물의 두개안면 연골은 두개골 신경능선 세포¹라고 하는 다능성 세포 집단에서 나타납니다. 이 세포는 초기 배아에서 신경판의 등쪽 가장자리에 먼저 지정되며, 분화하기 전에 두개안면 영역과 인두궁에 도달하기 위해 먼 거리를 이동합니다 ^2,3. 이러한 이동과 분화를 유도하는 신호 전달 메커니즘은 척추동물 사이에서 대체로 보존됩니다 ^4,5. 그럼에도 불구하고 개별 연골 요소의 조직, 크기 및 모양은 종에 따라 뚜렷하여 다양한 두개안면 형태를 발생시킵니다⁶. 특히 제브라피쉬는 유충 단계까지 배아의 투명한 특성을 감안할 때 두개안면 형태 형성을 연구하는 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다. 연골을 표시하기 위한 간단한 염색 절차를 사용하여 제브라피쉬의 많은 두개안면 구조의 형태는 신호 전달 경로 ^7,8,9에 대한 다양한 교란 하에서 배아 또는 유충이 환경에 존재하는 일반적인 오염 물질에 노출될 때 특성화되었습니다¹⁰. 연골을 표시하기 위해 여기에 설명된 알시안 블루 염색은 Walker와 Kimmel¹¹에 의해 표준화된 비산성 조건의 사용을 포함하며, 이는 이후 두개안면 발달을 연구하는 많은 제브라피쉬 실험실에서 사용되었습니다 5,12,13,14,15,16,17,18,19 , 고등학교 환경에서의 사용에 대한 설명^{포함 20}. 무산 염색은 뼈 구조를 손상되지 않은 상태로 보존하여 각각 알시안 블루와 알리자린 레드를 사용하여 연골과 뼈를 함께 염색할 수 있습니다. 그러나 염색 및 두개안면 연골의 정확한 해부를 수행하기 위한 자세한 프로토콜, 특히 자원이 제한된 환경에서 수행되는 이러한 연구를 지원하기 위한 프로토콜이 누락되었습니다.

성체 제브라피쉬의 안면 골격 구조는 43개의 연골 유래 뼈로 구성되어 상당히 복잡하지만²¹, 이제 막 먹이 능력을 획득한 수정 후 5일(dpf)의 유충의 두개안면 연골은 비교적 단순하며 크게 등쪽 신경두개골과 복부 내장 두개골로 나눌 수 있다 4. 이러한 구조는 뇌를 지지하고 영양 장치에 기여하며 아가미 조직을 지지하는 연골을 생성합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 제브라피쉬 연골을 알시안 블루로 염색한 다음 신경과 내장 두개골을 별도의 구조로 해부하는 상세한 절차를 허용하며, 이는 궁극적으로 이러한 구조에서 다양한 연골의 모양과 크기를 주의 깊게 특성화할 수 있게 할 것입니다. 예를 들어, 신경두개골의 일부인 사골판이라고 불리는 구개(입천장)의 앞쪽 영역의 치수를 측정합니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 제브라피쉬 유지 관리 및 실험 절차는 기관 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(참조 TIFR/IAEC/2023-1).

1. 시약 준비

1. E3 미디어:
   1. 3.25g의 인산이염기나트륨(0.458mM Na2HPO4), 0.29g의 이수소인산칼륨(0.042mM _KH2PO4), 11.93g의 염화나트륨(4.084mM NaCl) 및 0.48g의 염화칼륨(0.128mM KCl)을 증류수 1L에 혼합하여 50x 스톡1을 준비합니다.
   2. 염화칼슘 2.43g(0.33mM CaCl₂)과 황산마그네슘 4.07g(0.33mM MgSO₄)을 증류수 1L에 혼합하여 50x 스톡2를 준비합니다.
   3. 500mL의 1x E3 배지를 준비하려면 증류수 480mL에 스톡 1과 2(pH = 7.4)를 각각 10mL씩 첨가합니다.
      알림: 이러한 용액을 준비하는 동안 장갑을 착용하십시오.
2. 1x PBS(인산염 완충 식염수)의 4% 파라포름알데히드(PFA):
   1. 100mL의 1x PBS를 68°C에서 예열합니다. PFA 4g을 첨가하고 PFA가 완전히 용해될 때까지 주기적으로 혼합하면서 용액을 68°C에서 배양합니다.
      참고: PFA는 독성이 강하므로 이 시약을 준비하는 동안 장갑과 마스크를 착용하고 가급적이면 연기 후드 아래에 착용하십시오.
3. 0.05% MS-222(일반적으로 트리카인으로 알려짐) 용액:
   1. E3에 4% 트리카인 스톡을 만들고 4°C에서 보관합니다. 트리카인 스톡 10mL를 만들려면 E3 7mL에 MS-222 0.40g을 첨가합니다. 용액이 들어 있는 튜브를 부드럽게 흔들어 혼합하고 부피를 10mL로 만듭니다. 50mL의 0.05% 트리카인 용액을 만들려면 625μL의 4% 스톡을 49.375mL의 E3에 첨가합니다.
      참고: 이 시약을 준비하는 동안 장갑과 마스크를 착용하십시오.
4. 70% 에탄올에 0.4% 알시안 블루 원액
   1. 2mL의 원액을 준비하려면 8mg의 알시안 블루를 1mL의 50% 에탄올에 녹입니다. 용액을 37°C에서 15-20분 동안 가열하고 주기적으로 혼합하여 용해시킵니다. 얼룩이 녹으면 100% 에탄올 900μL와 증류수 100μL를 첨가하여 용액을 70% 에탄올로 만듭니다.
      참고: 원액은 실온에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
5. 염색액 -- 0.02% 알시안 블루, 200mM 염화마그네슘(MgCl₂) 및 70% 에탄올
   1. 알시안 블루 염색액 5mL를 제조하려면 1M MgCl₂ 1mL, 100% 에탄올 3.5mL, 0.4% 알시안 블루 스톡 250μL(70% 에탄올 2mL에 알시안 블루 8mg)을 물 250μL에 넣고 잘 섞는다.
      참고: 최상의 염색 결과를 위해 염색액을 새로 준비하십시오.
6. 표백제 용액:
   1. 3% 과산화수소(H₂O₂)와 2% 수산화칼륨(KOH)을 같은 부피로 혼합합니다. 표백제 용액 2mL를 만들려면 3% 과산화수소 1mL와 2% 수산화칼륨 1mL를 혼합합니다.
      알림: 이 단계를 시작하기 전에 이 용액을 새로 준비하십시오. H₂O₂ 는 빛에 민감하므로 가능한 한 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. H₂O₂ 및 KOH를 취급하는 동안 장갑을 착용하십시오.
7. 용액 I: 글리세롤 20% + KOH 0.25%
   참고: 글리세롤은 점성이 높으므로 주의해서 피펫을 피펫팅하십시오. 이러한 용액을 준비하는 동안 장갑을 착용하십시오.
   1. 5mL의 용액 I을 준비하려면 2mL의 50% 글리세롤과 625μL의 2% KOH를 2.375mL의 물에 넣고 잘 섞습니다.
8. 용액 II: 50% 글리세롤 + 0.25% KOH
   1. 5mL의 용액 II를 준비하려면 3.570mL의 70% 글리세롤과 625μL의 2% KOH를 805μL의 물에 넣고 잘 섞습니다.
9. 저장 용액: 50% 글리세롤 + 0.1% KOH
   1. 5mL의 저장 용액을 준비하려면 3.570mL의 70% 글리세롤과 250μL의 2% KOH를 1.180mL의 물에 넣고 잘 혼합합니다.
10. 3% 아가로스
    1. 아가로스 3g을 증류수 100mL에 녹입니다. 용액이 맑아질 때까지 전자레인지에 돌립니다.
11. 0.1% PBST(1x PBS에서 0.1% Tween 20)
    1. 1x PBS 1L를 만들려면 증류수 1,000mL에 NaCl 8g, KCl 0.20g,_Na2HPO₄ 1.44g, KH₂PO₄ 0.24g을 첨가합니다. 용액을 혼합하고 pH를 7.4로 조정합니다. 500mL의 0.1% PBST를 만들려면 5mL의 10% Tween 20에 495mL의 1x PBS를 추가합니다.
12. 0.50 μg/mL DAPI 용액
    1. 1x PBS에 10 mg/mL DAPI 스톡을 만듭니다. 0.50 μg/mL DAPI 용액 10 mL를 만들려면 1x PBS 10 mL에 0.50 μL의 스톡을 넣고 DAPI가 완전히 용해되도록 세게 흔듭니다.
       알림: 이러한 용액을 준비하는 동안 장갑을 착용하십시오. DAPI는 빛에 민감하므로 빛으로부터 보호하십시오. DAPI 스톡은 4°C에서 1년 이상 보관할 수 있습니다.

2. 배아 수집

1. 배아가 필요하기 전날 저녁에 수컷과 암컷 제브라피쉬 쌍을 번식 수조에 설치하고 수컷과 암컷 물고기를 장벽으로 분리합니다.
2. 다음날 아침 장벽을 제거하고 장벽을 제거한 후 15-20분 이내에 배아를 수집합니다.
   참고: 장벽 제거 시기는 제브라피쉬 배아와 유충의 병기 결정에 도움이 됩니다.
3. 배아가 5dpf에 도달할 때까지 28.5°C에서 배아를 올립니다.
   참고: E3 배지를 2일에 한 번씩 28.5°C에서 예열된 E3의 새로운 배치로 교체하십시오.

3. 알시안 블루 염색

참고: 이 실험을 수행하는 동안 장갑을 착용하십시오.

1. 20mL 미세 원심분리기 튜브(MCT)에서 0.05% 트리카인을 사용하여 5일 된 제브라피쉬 유충 20-25마리를 마취합니다.
2. 유충이 일반적으로 ~4-5분이 소요되는 움직임을 멈춘 후 마취제를 제거하고 실온(RT)에서 60rpm의 로커에 2시간 동안 4% PFA 1.5mL에 고정합니다.
3. 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 고정액을 제거하고 샘플에 1.5mL의 50% 에탄올을 추가합니다. RT에서 60rpm으로 흔들면서 10분 동안 배양합니다.
4. 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 에탄올을 제거하고 1.5mL의 Alcian blue 염색 용액을 추가합니다.
5. 고정된 유충을 염색 용액에 넣어 RT에서 60rpm의 로커에서 18-20시간 동안 배양합니다.
   참고: 더 짧거나 더 긴 기간 동안 배양하면 연골의 특정 영역이 각각 과소 염색되거나 과도하게 염색될 수 있습니다. 여기에서 18-20시간의 염색이 5일 된 유충의 신경과 내장 두개골을 명확하게 시각화하는 데 가장 효과적인 것으로 보였습니다.
6. 염색액을 제거하고 증류수 1.5mL를 첨가한 후 RT에서 로커에서 1-2분 동안 배양합니다.
   참고: 해부된 연골의 세포 경계를 시각화하기 위해 이 단계에서 염색을 중지할 수 있습니다. 그러나 후속 제거 단계를 수행하지 않고 이 단계에서 염색 프로토콜을 중지하는 것의 단점은 신경과 내장 두개골의 경계가 여전히 약간 흐릿하게 남아 있고 해부를 정확하게 수행하는 것이 더 어려워진다는 것입니다.
7. 표백제 용액 1mL를 샘플에 첨가하고 플레이트나 웰 위에 덮지 않고 실습에서 20분 동안 배양합니다.
   알림: 과산화수소와 수산화칼륨 사이의 반응으로 산소 가스가 생성되어 닫히면 덮개가 튀어나올 수 있으므로 이 단계에서 MCT를 덮지 마십시오.
8. 표백제 용액을 제거하고 다음 조직 제거 단계를 수행합니다.
   1. 샘플에 1.5mL의 용액 I을 첨가하고 RT에서 40분 동안 60rpm의 로커에 유지합니다.
   2. 용액 I을 제거하고 1.5mL의 용액 II를 샘플에 첨가하고 RT에서 2시간 동안 60rpm의 로커에 유지합니다.
      알림: 제거 단계는 과도한 얼룩을 제거하는 데 도움이 되어 샘플의 광학적 선명도를 향상시켜 해부를 효율적으로 수행하는 데 도움이 됩니다. 용액을 변경하는 동안 손상이 향후 형태 분석에 영향을 미칠 수 있으므로 샘플을 주의해서 취급하십시오.
9. 용액 II를 제거하고 1.5-2mL의 저장 용액을 추가합니다. 글리세롤의 존재로 인해 염색된 샘플은 10분 이내에 점차 바닥으로 가라앉습니다.
   참고: 염색된 샘플은 4°C에서 1년 이상 보관할 수 있습니다.

4. 두개안면 골격의 해부

1. 용액이 투명해질 때까지 전자레인지에 3% 아가로스 용액을 녹입니다.
   알림: 용액이 플라스크에서 거품이 나올 수 있으므로 과열하지 마십시오. 이 단계를 수행하는 동안 솔루션을 주의 깊게 확인하십시오.
2. 페트리 접시 깊이의 1/3이 덮일 때까지 용융된 아가로스를 붓고 응고되도록 하여 90mm 페트리 접시에 3% 아가로스를 코팅합니다. 해부는 이 페트리 접시에서 수행됩니다.
   참고: 아가로스 코팅이 된 페트리 접시는 일주일 전에 준비하여 4°C에서 보관할 수 있습니다. 아가로스 코팅은 집게를 손상시키지 않고 해부를 수행할 수 있는 더 부드러운 기질을 제공합니다.
3. 70% 에탄올로 사용할 집게를 청소하고 깨끗한 표준 실험실 티슈 페이퍼로 닦습니다.
4. 파스퇴르 피펫을 사용하여 염색된 유충 3-4마리를 0.5mL의 저장 용액과 함께 아가로스로 코팅된 페트리 접시로 옮깁니다.
   참고: 저장 솔루션은 E3에서 동일한 작업을 수행하는 것과 비교하여 해부 수행을 위한 더 많은 광학적 선명도를 보장합니다.
5. 염색된 유충을 측면으로 향하게 하고(그림 1A) 집게를 사용하여 유충 몸에서 노른자를 조심스럽게 긁어냅니다
   참고: 그림 1B 는 노른자가 제거된 배아를 보여줍니다. 주변에 떠다니는 끈적끈적한 노른자 덩어리가 해부를 방해하지 않도록 추가 해부 단계를 진행하기 전에 노른자로 긁힌 배아를 새로운 페트리 접시로 옮기는 것이 좋습니다.
6. 노른자를 제거한 후 하나의 집게로 유충의 꼬리 부분을 잡고 다른 집게를 사용하여 조심스럽게 눈을 제거합니다.
   참고: 그림 1C 는 난황자와 눈이 제거된 배아를 보여줍니다. 눈은 두개안면 골격에 근접하면 해부를 방해할 수 있으므로 주의해서 제거해야 합니다.
7. 집게를 사용하여 신경 두개골 등쪽의 뇌와 기타 조직을 조심스럽게 잡아당기고 꼬집습니다. 한 쌍의 집게로 유충을 가만히 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 중간을 절개한 다음(그림 1C, 빨간색 화살표) 조직을 꼬집습니다(그림 1D).
   알림: 이 단계를 수행하는 동안 연골이 함께 벗겨질 수 있으므로 신경두개골의 가장 앞쪽 영역에 더 가까운 조직을 제거할 때 주의하십시오.
8. 유충의 머리를 몸의 나머지 부분과 분리하십시오. 이 단계 이후의 머리 영역에는 주로 신경두개골과 내장 두개골이 앞쪽 및 뒤쪽 끝의 두 지점에서 서로 부착되어 있으며 이러한 두개안면 구조에 부착된 몇 개의 작은 염색되지 않은 조직이 포함됩니다(그림 1E).
   참고: 신경두개골과 내두개에 직접 부착된 염색되지 않은 조직을 완전히 제거하는 것은 어렵습니다. 일부 잔여 조직이 존재하더라도 염색되지 않았기 때문에 다운스트림 모양이나 크기 분석에 영향을 미치지 않습니다.
9. 신경두개골과 내두개 사이의 두 연결을 조심스럽게 절단하여 분리합니다(그림 1F, 빨간색 점선). 온전한 배아와 해부된 배아의 신경두개골과 내장 두개골의 이미지는 그림 2 를 참조하십시오.
10. 깨끗한 유리 슬라이드에 100% 글리세롤 한두 방울을 추가합니다. 겸자를 사용하여 해부된 신경두개골 또는 내장 두개골을 이 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 집게를 사용하여 이 조직에 커버슬립을 부드럽게 놓고 기포가 형성되지 않도록 하고 매니큐어로 모든 슬라이드의 커버슬립을 밀봉합니다.
    참고: 이 슬라이드는 얼룩을 잃지 않고 4°C에서 1년 이상 보관할 수 있습니다.

5. 사골판의 치수 정량화

1. 실체 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 입천장 이미지를 획득합니다(그림 2D). 과학 등급 카메라가 없는 경우 표준 스마트폰을 실체 현미경에 부착하여 이미지를 획득하십시오.
2. 정량화를 위해 입천장 이미지를 FIJI²²에 로드한 다음 라인 도구를 사용하여 사골판의 너비와 높이를 미크론 단위로 측정하고(그림 3A-C 참조) 카메라의 픽셀 해상도를 사용하여 치수를 결정합니다.
3. 사골판 주위에 윤곽선을 그리고 분석 | 측정 설정 | 면적을 얻기 위해 사골판의 면적을 얻습니다(그림 3D,E).

결과

제브라피쉬 두개안면 골격은 수정 후 5일(dpf)까지 완전히 연골이므로 연골에 풍부하게 존재하는 글리코사미노글리칸에 결합할 수 있는 염기성 염료인 알시안 블루를 사용하여 염색할 수 있습니다²³. 그 결과 연골이 파란색으로 염색되어(그림 1) 대부분의 학부 실험실 환경에서 사용할 수 있는 표준 실체 현미경을 사용하여 유충에 존재하는 다른 조직과 구별할 수 있습니다. 난황을 긁어내고(그림 1B) 눈을 제거하면(그림 1C), 각각 머리의 등쪽과 복부에서 볼 때 신경과 내장 두개골을 명확하게 시각화할 수 있습니다(그림 2B,C). 그런 다음 신경과 내장 두개골을 분리할 수 있으며(그림 2D,E

토론

두개안면 기형은 인간의 모든 선천적 결함의 대부분을 차지하며 종종 영아 사망으로 이어집니다. 그러나 대부분의 두개안면 기형의 근본적인 병인은 아직 밝혀지지 않았습니다²⁵. 두개안면 구조는 주어진 척추동물에서 복잡하므로 학부 설정 관점에서 첫 번째 요구 사항은 학생들에게 두개안면 영역의 뚜렷한 구조에 대한 일반적인 개요를 제공하는 교육 도구를 갖추는 것입니다. 그러나 이러한 환경에서 포유류 배아에 접근하는 것은 대부분의 상황에서 실현 불가능합니다. 한편, 제브라피쉬는 작은 시설(²⁶ )에서 유지하기가 더 쉬운 모델 시스템으로서, 초기 유충 단계(⁴)에서 상대적으로 훨씬 더 단순한 두개안면 해부학으로 투명하다는 추가적인 이점을 갖는다.

이 연구에 설명된 프로토콜은 두개안면 형태 형성을 연구하는 대...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	론자 바이오사이언스	50004	페트리 접시 코팅용
알시안 블루 8G	시그마-알드리치	A3157	연골 염색용
염화칼슘 이수화물	시그마-알드리치	12022	버퍼를 만들기 위해
사진기	올림푸스	DP28	이미지 획득용
DAPI	로슈 생명과학	10236276001	핵 라벨링용
에탄올	니 웰	32221	알시안 블루 얼룩용 용매
피지			버전: ImageJ 1.54f
집게	뒤몽	뒤몽	해부 수행용
글리세롤	MP 바이오메디컬	193996	세척 및 샘플 장착용
과산화수소	MP 바이오메디컬	194057	표백제 용액 만들기
염화마그네슘 육수화물	SARD 바이오사이언스	SBRC0217	버퍼를 만들기 위해
황산마그네슘 칠수화물	시그마-알드리치	M2773	버퍼를 만들기 위해
MS-222 (트리카인)	시그마-알드리치	A5040	유충 마취용
염화칼륨	시그마-알드리치	피9541	버퍼를 만들기 위해
수산화칼륨	시그마-알드리치	484016	버퍼를 만들기 위해
인산칼륨 일염기성	시그마-알드리치	P0662	버퍼를 만들기 위해
소금	시그마-알드리치	S3014 시리즈	버퍼를 만들기 위해
인산이염기성 나트륨	시그마-알드리치	71640	버퍼를 만들기 위해
입체경	올림푸스	SZX61 시리즈	해부 수행용
트윈-20	히미디어	TC287 시리즈	세포 투과성에 사용되는 세제