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연구 논문

혈소판 풍부 피브린의 성장 인자의 일주기 변화 평가: 파일럿 연구

513 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68902

⸱

2025년 10월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, Faculty of Dentistry, University of Çukurova, 2Private Practice, 3Department of Biology, Faculty of Medicine, University of Çukurova

이 논문에서

요약

이 연구는 혈소판 풍부 피브린(PRF)에서 성장 인자 방출의 일주기 변화를 조사하고 PRF 기반 재생 절차의 시기를 최적화하는 것을 목표로 코르티솔 수준과의 상관관계를 탐색합니다.

초록

혈소판 풍부 피브린(PRF)은 치과, 특히 연조직과 경조직의 재생, 발치와 치유, 치주 결손 치료, 부비동 확대술 및 점막치은 시술에 광범위한 임상 응용을 가지고 있습니다. PRF는 단일 단계 원심분리 프로토콜 을 통해 제조된 혈소판 유래 성장 인자가 풍부한 생체 재료입니다. 이 연구는 PRF 유래 성장 인자가 아침과 저녁 시간 사이에 일주기 변화를 나타내는지 여부를 평가하는 것을 목표로 했습니다. 20명의 건강한 지원자가 참여하여 각각 08:00에 3개, 20:00에 3개 등 6개의 정맥혈 샘플을 제공했습니다. 각 시점에서 하나의 튜브를 전체 혈구 수에 사용하고, 다른 하나는 혈청 코르티솔 분석에 사용하고, 다른 하나는 PRF 준비에 사용되었습니다(12분 동안 708 x g에서 원심분리). PRF의 성장인자(IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1)는 ELISA를 사용하여 24시간 및 72시간에 측정되었습니다. 이들의 수치는 시점 간에 비교되었고 혈청 코르티솔 수치와 상관관계가 있었습니다. FGFR 수준은 저녁 샘플에서 24시간보다 72시간에 유의하게 높았습니다. 그러나 아침과 저녁 사이에 IGF-1, PDGF, VEGF 또는 TGFβ-1에 대해서는 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. 코르티솔 수치는 아침 샘플에서 72시간에 PDGF와 음의 상관관계가 있었고 저녁 샘플에서 72시간에 IGF-1과 음의 상관관계가 있었습니다. 그러나 다른 유의미한 상관관계는 관찰되지 않았습니다. 이러한 결과는 채혈 시기가 PRF 성장 인자 함량에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 시사하며, 이는 샘플 시기에 관한 임상 프로토콜의 유연성을 나타냅니다.

서론

혈소판 풍부 피브린(PRF)은 자가 기원, 준비 용이성 및 생물학적 활성 함량으로 인해 재생 치과에 일반적으로 사용되는 2세대 혈소판 농축액입니다1. 항응고제 없이 전혈을 원심분리하여 형성된 PRF는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자-베타 1(TGF-β1), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFr). 이러한 생체 분자는 세포 증식, 혈관신생, 세포외 기질 리모델링 및 조직 재생에서 중심적인 역할을 합니다2. 항응고제와 외인성 활성화가 필요한 혈소판 풍부 혈장(PRP)과 비교하여 PRF는 백혈구와 혈소판이 갇힌 생리학적 피브린 스캐폴드를 생성하는 단일 단계의 항응고제가 없는 공정을 통해 생산됩니다. 이 아키텍처는 성장 인자와 사이토카인의 더 느리고 지속적인 방출을 지원하여 잠재적으로 상처 안정성과 조기 조직 복구를 향상시키는 동시에 취급 복잡성과 비용을 줄입니다 1,2. 또한, 항응고제 및 활성제가 없기 때문에 조작 관련 변동성이 최소화되고 천연 혈소판 거동을 더 잘 보존할 수 있어 체어사이드 사용 및 시술자 간 표준화에 실질적인 이점을 제공할 수 있습니다2.

광범위한 임상 사용에도 불구하고 PRF의 생리 활성 성분의 시간적 역학은 잘 이해되지 않고 있습니다. 고유한 24시간 생물학적 주기인 일주기 리듬은 면역 기능, 호르몬 분비 및 혈액학적 매개변수를 포함한 다양한 생리학적 시스템에 영향을 미칩니다 3,4. 주요 일주기 호르몬인 코르티솔은 이른 아침에 최고조에 달하고 하루 종일 점차 감소합니다5. 중요한 것은 연구에 따르면 혈소판 활동, 응집 능력 및 수가 일주기 메커니즘에 의해 조절될 수 있으며 응고 및 상처 치유에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다6.

PRF는 말초 혈액에서 직접 추출되기 때문에 채혈의 일주기 시기는 잠재적으로 혈소판 활성화 상태와 피브린 중합 중 성장 인자의 후속 방출에 영향을 미칠 수 있습니다. 혈소판이 풍부한 혈장에서 혈소판 수 및 성장 인자의 주간 변화는 이전에 Aoto et al.7에 의해 분석되었지만, 하루 중 다른 시간에 준비된 PRF가 성장 인자 구성에서 측정 가능한 차이를 나타내는지 여부를 체계적으로 조사한 연구는 없습니다. 따라서 본 파일럿 연구는 건강한 개인으로부터 아침과 저녁에 채취한 샘플을 비교하여 PRF 유래 성장 인자의 일주기 변화를 조사하는 것을 목표로 합니다. 또한 각 시점에서 혈청 코르티솔 수치를 평가하고 PRF 성장 인자 방출과의 상관관계를 탐색했습니다. 이러한 시간적 변동성을 이해하면 임상 프로토콜을 최적화하고 PRF 기반 재생 치료의 표준화에 기여할 수 있습니다. 이 연구의 귀무 가설은 채혈의 일주기 타이밍이 혈소판 풍부 피브린(PRF)에서 방출되는 성장 인자의 농도에 유의한 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 그러나 혈소판 활동과 호르몬 분비의 알려진 일주기 조절을 기반으로 처음에는 채혈 시간(아침 대 저녁)이 PRF 성장 인자 함량을 변경할 수 있다는 가설이 세워졌습니다. 임상적 관점에서 PRF 성장 인자 함량이 일주기 변화에 민감한지 여부를 명확히 하는 것은 재생 프로토콜의 표준화에 중요합니다. 성장 인자 방출이 하루 종일 대체로 안정적으로 유지된다면 임상의는 정맥 천자 시기가 치료 결과에 실질적인 영향을 미치지 않을 수 있으므로 절차 일정을 유연하게 조정할 수 있다는 확신을 가질 수 있습니다. 반대로, 혈관신생이나 조직 복구와 관련된 요인과 같은 일부 요인에서 미묘한 차이가 나타나면 최대 재생 가능성이 필요한 경우(예: 손상된 치유 조건에서) 채혈 시기를 최적화할 수 있습니다.

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프로토콜

이 연구는 터키 아다나에 있는 Çukurova University 치과에서 20명의 건강한 지원자가 참여하여 수행되었습니다. 포함되기 전에 모든 참가자에게 연구의 목적, 방법론 및 절차에 대한 정보를 제공하고 서면 동의서를 얻었습니다. Çukurova University 의과대학 임상 연구 윤리 위원회(승인 번호: 125/55, 날짜: 2022년 9월 16일)에서 윤리적 승인을 받았습니다. 인간 혈액 취급에 대한 필수 생물 안전 지침과 생물학적 유해 물질 및 화학 시약에 대한 폐기물 처리 지침을 포함한 모든 절차는 NIH-CDC 지침8에 따라 수행되었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 참가자 선정

연구에 포함된 참가자는 알려진 전신 질환이 없는 18세에서 25세 사이의 건강한 개인이었고 시술 중에 적절한 협조를 보였습니다. 전신 질환이 있거나, 임신 중이거나 모유 수유 중이거나, 혈액학적 또는 호르몬 매개변수에 영향을 미칠 수 있는 약물 또는 호르몬제를 사용하는 개인은 제외되었습니다.

2. 채혈 및 그룹 할당

각 참가자로부터 총 6개의 10mL 정맥혈 샘플을 수집했으며, 아침(08:00)에 3개, 저녁(20:00)에 3개씩 수집되었습니다. 무첨가 유리(10mL)의 멸균 PRF 튜브가 연구에 사용되었습니다. 오전 세션에서는 튜브 1을 전체 혈구 수(CBC), 튜브 2를 혈청 코르티솔 분석, 튜브 3을 PRF 준비에 사용한 후 성장 인자 분석을 수행했습니다. 저녁 세션에서는 CBC에 튜브 4, 혈청 코르티솔 분석에 튜브 5, PRF 준비 및 성장 인자 분석에 튜브 6을 사용했습니다. 채혈 시간에 따라 샘플을 두 그룹으로 나누었습니다: 그룹 1은 아침 혈액(08:00)으로 준비된 순수 PRF로 구성되었고 그룹 2는 저녁 혈액(20:00)으로 준비된 순수 PRF로 구성되었습니다.

3. PRF 준비

혈액 샘플은 40° 고정각 로터와 10mL 유리관이 장착된 원심분리기를 사용하여 실온에서 12분 동안 708 x g 에서 원심분리했습니다. 사용된 장치는 88mm에서 110mm 사이에서 조정 가능한 로터 반경을 가졌습니다. 이 연구에서는 프로토콜을 표준화하기 위해 반경 88mm를 선택했습니다. 시술 중 항응고제는 사용되지 않았습니다. 원심분리 후, 생성된 PRF를 거시적으로 평가하여 매끄럽고 균질한 표면, 탄력 있고 원통형 모양, 조밀하고 견고한 일관성을 특징으로 하는 적절한 형성을 보장했습니다.

4. 성장 인자 ELISA 분석

PRF 혈전은 멸균 가위를 사용하여 적혈구층에서 조심스럽게 분리되었습니다. 각 응고의 무게를 측정하고 RPMI-1640 배양 배지를 중량(g = mL)을 기준으로 1:1 비율로 첨가하여 모든 샘플에 걸쳐 배양 환경을 표준화하고 PRF 매트릭스에서 가용성 성장 인자의 일관된 확산을 보장했습니다. 이 비율은 응고 크기에 따라 비례 추출을 허용하여 응고 질량이 동일하지 않아 성장 인자 농도의 변동성을 최소화합니다. 샘플을 100rpm 및 3°C의 궤도 셰이커에서 24시간 및 72시간 동안 배양하여 PRF 매트릭스에서 배양 배지로 성장 인자의 균일한 확산을 촉진했습니다. 배양 후, 상청액을 수집하여 분석할 때까지 -8°C에서 보관했습니다. 성장 인자 농도는 제조업체의 준비 프로토콜 9,10에 따라 FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF 및 TGF-β1을 포함한 상용 ELISA 키트를 사용하여 정량화되었습니다.

5. ELISA 단계

표준물질과 샘플(각각 100μL)을 웰에 첨가하고 3°C에서 90분 동안 배양했습니다. 그런 다음 우물을 세척 완충액으로 세 번 세척했습니다. 다음으로, 100μL의 비오틴 표지 항체를 각 웰에 첨가하고 3°C에서 60분 동안 배양한 후 3회 추가로 세척했습니다. 그런 다음 100μL의 양 고추냉이 과산화효소(HRP) 용액을 첨가하고 3°C에서 30분 동안 배양했습니다. 또 다른 세 번의 세척 후, 100μL의 기질 시약을 첨가하고 15분 동안 배양했습니다. 마지막으로 각 웰에 50μL의 정지 용액을 첨가하고 450nm에서 흡광도를 측정했습니다.

6. 통계 분석

범주형 변수는 빈도와 백분율로 표현되었고, 수치 데이터는 평균± 표준 편차 또는 중앙값(최소-최대)으로 적절하게 표시되었습니다. 수치 변수의 정규성은 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 정규성의 가정을 충족하지 못하는 변수, 특히 성장 인자 농도 및 코르티솔 수치는 쌍 비교를 위한 Wilcoxon 부호 순위 테스트와 연관성에 대한 Spearman의 순위 상관 계수를 포함한 비모수 테스트를 사용하여 분석되었습니다. 모든 통계 분석은 IBM SPSS Statistics 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. p-값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 모든 비교는 개인 간 가변성에 대한 통제 대상 내에서 수행되었습니다.

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결과

20명의 지원자 참가자(여성 10명, 남성 10명, 18세에서 25세 사이)는 샘플 손실 없이 연구를 완료했습니다. 전체 혈구 수 결과는 혈소판 및 혈액학적 매개변수가 모든 샘플에서 정상 참조 범위 내에 있음을 확인하여 PRF 제제의 신뢰성을 검증했습니다.

아침과 저녁의 혈액 매개변수 비교
코르티솔 수치는 저녁에 비해 아침 샘플에서 유의하게 높았으며(p < 0.001), 이는 생리적 일주기 리듬을 반영합니다. WBC 수치는 저녁 샘플에서 더 높았고(p = 0.001), RBC, HGB 및 HCT 값은 아침에 유의하게 증가했습니다(모두 p < 0.001). (표 1) PLT 또는 PDW 값에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 그러나 저녁 샘플에서 MPV(p < 0.001), PLCR(p = 0.002) 및 PCT(p < 0.001)가 유의하게 증가했습니다.

코르티솔, W...

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토론

혈소판 활동과 호르몬 분비의 알려진 일주기 조절을 기반으로 처음에는 채혈 시간(아침 대 저녁)이 PRF 성장 인자 함량을 변경할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이 연구는 그러한 시간적 변화가 존재하는지, 존재한다면 혈청 코르티솔 수치 및 혈액학적 매개변수와 상관관계가 있는지 여부를 테스트하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구는 PRF 유래 성장 인자 방출의 일주기 변화를 탐색하기 위한 파일럿 조사로 설계되었습니다. 따라서 공식적인 표본 크기 계산은 수행되지 않았습니다. 그러나 사후 검정력 분석은 현재 표본(n = 20)이 향후 연구를 위한 효과 크기를 추정하기에 충분한 예비 데이터를 제공한다는 것을 시사합니다.

연구 결과는 대부분의 성장 인자(IGF-1, PDGF, VEGF 및 TGF-β1)가 아침과 저녁 샘플 간에 유의한 차이가 없는 반면, FGFR 수치는 72시간 후 저녁 샘플에서 유의하게 증가한 것으...

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공개 사항

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
원심분리기 기계듀오913023410238
엘리사 키트미세 테스트, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. IGF-1 (카탈로그 번호: EH0165)
엘리사 키트미세 테스트, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. PDGF (카탈로그 번호:EH3531)
엘리사 키트미세 테스트, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. FGFR (카탈로그 번호:EH0715)
엘리사 키트미세 테스트, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. VEGF (카탈로그 번호 : EH0327)
엘리사 키트미세 테스트, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. TGF-&베타; 1(카탈로그 번호:EH0287)
PRF 튜브figure-materials-16370

참고문헌

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