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방법 논문

환자 유래 전립선암 오가노이드의 확립 및 유지: 상세한 실험 프로토콜

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/68912

⸱

2025년 11월 14일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

이 논문에서

요약

전립선암 이질성과 치료 저항성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 우리는 주요 부모 종양 특성을 보존하는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 표준화된 모델은 약물 스크리닝 및 정밀 의학 발전을 지원합니다.

초록

전립선암(PCa)은 매우 이질적인 악성 종양이며 남성의 암 관련 사망의 주요 원인이며, 치료 저항성 및 질병 진행을 해결하는 데 중요한 임상적 과제가 있습니다. 2차원(2D) 세포주 및 환자 유래 이종이식편(PDX)과 같은 기존 전임상 모델은 종양 이질성, 안드로겐 수용체(AR) 의존성 신호 전달 및 미세 환경 상호 작용을 포함하여 PCa의 복잡성을 충실하게 요약하는 데 한계가 있습니다. 이러한 격차를 해결하기 위해 이 연구는 부모 종양의 유전적, 표현형 및 조직학적 특징을 보존하는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 확립하기 위한 강력하고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 국소 및 고급 PCa 모두에서 오가노이드를 배양할 수 있게 하여 질병 메커니즘, 약물 반응 및 바이오마커 발견을 연구하기 위한 생물학적으로 관련된 모델을 제공합니다. 결과는 다양한 임상 표본에서 오가노이드를 생성하는 프로토콜의 능력을 입증하고 고처리량 약물 스크리닝 및 정밀 의학에 적용됩니다. 주요 기술적 과제를 해결하는 표준화된 작업 흐름을 제공함으로써 이 연구는 전립선암 연구를 발전시키고 보다 효과적인 치료 전략을 개발하기 위한 다목적 도구로서 PDO의 중요성을 강조합니다.

서론

전립선암(PCa)은 전 세계적으로 남성에게 가장 널리 퍼진 악성 종양 중 하나로 남아 있으며, 암 관련 사망률에서 폐암에 이어 두 번째입니다. 최근 역학 연구에 따르면 PCa의 전 세계 발병률은 꾸준히 증가하고 있으며, 매년 새로운 전립선암 발병 건수는 2020년 140만 건에서 2040년까지 290만 건으로 증가할 것으로 예상됩니다1. 안드로겐 차단 요법(ADT) 및 표적 제제를 포함한 조기 발견 및 새로운 치료법의 개발의 발전에도 불구하고 전립선암은 특히 진행된 단계에서 이질적인 특성과 불가피한 치료 저항성 발생으로 인해 중요한 임상적 과제로 남아 있습니다2. ADT 실패 후 나타나는 거세 저항성 전립선암(CRPC)은 치명적인 형태의 질병을 나타내며 생존 결과가 좋지 않고 치료 옵션이 제한되어 있습니다3. 따라서 질병 진행과 내성을 유도하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 새로운 치료 표적을 식별하고 환자 결과를 개선하는 데 중요합니다.

인간 전립선암의 복잡성을 정확하게 모방하는 전임상 모델의 개발은 이 분야의 연구를 발전시키는 데 매우 중요합니다. 전통적인 2D 세포 배양은 널리 사용되지만 생체 내에서 관찰된 세포 이질성, 종양 구조 및 미세 환경을 요약하지 못합니다 4. 결과적으로, 이러한 모델의 번역 유용성은 특히 종양 진행, 약물 내성 및 암세포와 종양 미세 환경 사이의 동적 상호 작용을 연구하는 데 제한적입니다5. 대조적으로, 환자 유래 이종이식편(PDX) 및 오가노이드 배양은 기존 세포주와 임상 종양 사이의 격차를 해소하는 보다 정교한 도구로 등장했습니다 4,5,6.

오가노이드 배양 시스템은 암 모델링에 혁명을 일으켰습니다. 이러한 3차원(3D) 구조는 환자 조직에서 파생되며 원래 종양 7,8,9,10의 조직학적, 게놈 및 표현형 특성을 유지할 수 있습니다. 중요한 것은 전립선암 오가노이드가 AR 신호 전달, 치료 내성 및 게놈 불안정성을 포함하여 질병 이질성의 중요한 특징을 보존하여 중개 연구에 이상적인 도구라는 것입니다11. PDX 모델에 비해 오가노이드는 비용 효율적이고 확장 가능하며 유전자 조작이 가능하여 고처리량 약물 스크리닝, 바이오마커 발견 및 기능 연구를 용이하게 합니다. 오가노이드 플랫폼은 이미 대장암, 유방암, 췌장암을 포함한 다른 악성 종양에서 유망한 결과를 보여 맞춤형 종양학에 대한 잠재력을 강조했습니다 4,12.

그러나 전립선암 오가노이드(PCO)를 확립하고 유지하는 데는 고유한 기술적 과제가 있습니다. 전립선 상피는 본질적으로 안드로겐 신호 전달 및 세포외 기질(ECM) 지원에 의존하므로 전문적인 배양 조건이 필요합니다. 더욱이, 전립선암은 국소 호르몬 민감성 종양에서 매우 공격적이고 치료 불응성인 CRPC에 이르기까지 광범위한 임상 행동을 나타내며, 이는 재현 가능한 오가노이드 시스템의 개발을 더욱 복잡하게 만듭니다11,12. PCO 생성을 위한 성공적인 프로토콜은 조직 처리, 효소 소화, ECM 포매, 중요한 성장 인자, 호르몬 및 소분자 보충을 포함한 주요 단계를 최적화하여 이러한 생물학적 복잡성을 해결해야 합니다. 이러한 프로토콜은 부모 종양에 대한 오가노이드의 충실도를 보장하고 다운스트림 분석에 적용을 용이하게 하는 데 필수적입니다.

이 연구에서 우리는 PDO의 설정 및 장기 유지 관리를 위한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 당사의 워크플로우는 생검 및 수술 표본의 조직 획득 및 처리부터 오가노이드 계대, 냉동 보존 및 소생술에 이르기까지 전체 프로세스를 포괄합니다(그림 1). 이 프로토콜은 전립선암 조직의 표현형 및 게놈 무결성을 보존하도록 최적화되어 게놈 프로파일링, 약물 반응 테스트 및 기능 분석을 포함한 광범위한 응용 분야에 적합한 강력한 3D 배양 시스템을 가능하게 합니다. 특히, 우리의 방법은 오가노이드 배양의 낮은 성공률, 최적이 아닌 성장, 후속 계대의 어려움과 같은 일반적인 기술적 장애물을 해결하고 표준화된 지침을 제공하여 실험실 전반에 걸쳐 재현성을 촉진합니다.

신뢰할 수 있는 전립선암 오가노이드 모델의 개발은 기초 및 중개 연구 모두에 엄청난 의미를 갖습니다13. 이러한 시스템은 질병 메커니즘을 해독하고, 새로운 치료 표적을 식별하고, 개별 환자에 맞는 정밀 의학 접근 방식을 발전시키기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 기존의 기술적 격차를 해소하고 포괄적인 프로토콜을 제공함으로써 우리의 연구는 전립선암 연구에서 오가노이드 기술의 채택을 가속화하고 이 어려운 질병과 싸우기 위한 전 세계적인 노력을 지원하는 것을 목표로 합니다14.

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프로토콜

본 연구는 우시 제2인민병원 의료윤리위원회의 심사 및 승인을 받았습니다(승인번호: Y-38(2023)). 모든 참가자는 서면 동의서를 제공했습니다. 환자 데이터는 윤리적 기준에 따라 개인 정보 보호를 보장하기 위해 비식별화되었습니다.

1. 샘플 수집

  1. 조직 획득
    1. 샘플링 전 준비
      1. 포함 기준: 모든 참가자가 병리학적 또는 영상 검사를 통해 결정된 전립선암 진단을 받았는지 확인하십시오. 외과적 절제, 생검 또는 기타 임상 표본에서 종양 샘플을 추출합니다. 전립선암 연구에서 다른 암의 잠재적인 간섭을 배제하기 위해 모든 참가자가 18세 이상이고 다른 악성 종양이 없는지 확인하십시오. 모든 참가자로부터 연구 참여에 대한 서면 동의서를 수집하고 샘플을 과학 연구에 사용할 수 있도록 허용합니다.
      2. 제외 기준: 샘플에 배양 또는 분석을 위한 충분한 종양 조직이 포함되어 있지 않은 환자는 제외합니다. 동의를 철회하거나 연구 중에 필요한 샘플을 제공할 수 없는 환자는 제외합니다.
    2. 전립선 코어 바늘 생검 샘플: 특수 바늘을 사용하여 전립선 조직에서 샘플을 채취합니다. 즉시 조직을 보존 용액(Advanced DMEM/F-12(adDMEM/F-12) 배지 + 암석 억제제 용액(1:2000 희석액))에 넣고 얼음 위에서 실험실로 운반하여 24시간 이내에 전달되도록 합니다.
      참고: 전립선암 조직을 정확하게 표적으로 삼고 다양한 해부학적 영역에 걸쳐 다중 부위 샘플링을 수행합니다. 부위당 1-2번의 천공을 수행하고 각 구멍은 ≥ 1cm 코어 샘플을 생성합니다.
    3. 근치적 전립선 절제술 샘플: 수집 후 샘플을 보존 용액(adDMEM/F-12 배지 + 암석 억제제 용액(1:2000 희석))에 신속하게 넣고 얼음 위에 운반하여 24시간 이내에 실험실로 전달할 수 있도록 합니다.
      참고: 더 많은 조직 조각은 근치적 전립선 절제술을 통해 얻을 수 있습니다15.
      직경 1g(≈ 5mm)≥ 샘플을 수집하여 정상 조직에 의한 오염을 최소화합니다. 수술 전 임상의와 협력하여 다음을 지정합니다. 1) 종양 코어; 2) 종양 주위 조직; 3) 정상적인 제어. 회황색 변색이 있는 단단한 조각을 우선시하십시오. 없는 경우 체계적인 무작위 샘플링을 구현합니다. 샘플 수집 정보는 표 1 을 참조하십시오.
  2. 샘플 처리
    1. 라벨링 및 분류: 수집된 조직 샘플(환자 이름, 입원 번호, 조직 이름, 조직 부위 및 조직 유형 포함)에 명확하게 라벨을 붙입니다.
    2. 냉동 보존: 조직 샘플을 즉시 처리합니다(수집 후 ≤ 12시간). 샘플을 예냉된(4°C) 보존 용액(adDMEM/F-12 배지 + 암석 억제제 용액(1:2000 희석액))에 넣고 4°C에서 보관합니다. 최적의 결과를 위해 4-6시간 이내에 추가 실험 단계를 진행하십시오.
  3. 운송 및 보관
    1. 콜드체인 운송: 저온 조건에서 조직 샘플을 실험실로 운송합니다.
    2. 샘플 등록: 실험실에 도착하면 환자의 기본 개인 정보, 조직 유형, 이름, 샘플 사이트 등 샘플 정보를 자세히 확인하고 등록합니다.
  4. 실험실 수령 및 검사:
    1. 샘플 검사: 생물안전 캐비닛에서 샘플을 열고 손실, 오염 또는 눈에 보이는 이상이 있는지 검사합니다.
    2. 샘플 해부: 샘플을 추출하여 배양 접시에 넣습니다. 조직 가위나 메스를 사용하여 후속 실험에 사용할 수 있도록 샘플을 작은 조각(약 1-3mm³)으로 나눕니다.

2. 실험 절차

  1. 1차 조직 세포 현탁액의 제조
    1. 보존: 수집된 조직 블록을 50mL 멸균 원추형 원심분리기 튜브에 넣고 조직이 유형별로 분류되도록 합니다. 각 튜브에 적절하게 라벨을 붙입니다. 조직이 완전히 잠길 때까지 보존 용액(adDMEM/F-12 배지 + 암석 억제제 용액(1:2000 희석액))을 각 튜브에 첨가합니다. 추가 처리가 될 때까지 샘플을 4°C에서 보관합니다.
      참고: 조직 유형에는 종양 조직과 비종양 조직이 모두 포함되어야 합니다. 샘플 라벨에는 일반적으로 의료 기록 번호가 포함되어야 합니다.
    2. 조직 분리: 멸균된 핀셋을 사용하여 전립선암 조직 샘플을 중간 크기의 배양 접시로 옮깁니다. 혈액과 파편을 제거하기 위해 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS) 2mL로 조직을 2-3회 세척합니다. 끝이 가는 핀셋을 사용하여 지방 조직, 근육 및 기타 비상피 구성 요소를 조심스럽게 제거하고 상피 영역만 유지합니다. 그런 다음 세척된 조직을 가위로 약 1-3mm³ 크기의 작은 조각으로 다집니다.
      참고: 간질 또는 지방 조직을 오염시키면 세포 분리의 효율성과 특이성이 감소할 수 있으므로 비상피 성분의 완전한 제거는 다운스트림 응용 분야에 매우 중요합니다. 미생물 오염 위험을 최소화하기 위해 절차 전반에 걸쳐 멸균 상태를 유지하십시오.
    3. 조직 소화: 준비된 조직 조각을 조직 처리 튜브로 옮깁니다. 종양 조직 소화 용액 (표 2) 을 각 튜브에 추가합니다. 효소-기계적 해리를 위한 Medium-Hard Tissue Dissociation Program을 사용하여 소화 장치(단일 세포 현탁액 준비 장치)를 활성화합니다.
      참고: 분해 프로토콜은 다음과 같습니다: 200rpm에서 3초 동안 정회전, 200rpm에서 3초 동안 역회전, 300rpm에서 4초 정회전, 300rpm에서 4초 동안 역회전, 600rpm에서 5초 동안 정회전, 600rpm에서 5초 동안 역회전, 400rpm에서 3초 동안 정회전, 400rpm에서 3초 동안 역회전합니다. 이 시퀀스는 하나의 주기를 구성하며 세 번 반복해야 합니다. 처음 두 사이클을 완료한 후 약 20분 동안 25rpm에서 느린 회전을 계속합니다. 기간은 실험 조건에 따라 조정될 수 있습니다. 조직을 37°C에서 40분에서 1시간 동안 소화합니다.
    4. 분해 종료: 효소 활성을 종료하기 위해 세포 현탁액에 동일한 또는 두 배의 FBS 보충 adDMEM/F-12 배지를 추가합니다.
      참고: 소화되지 않은 잔류물이 남아 있으면 상청액을 수집하고 잔류물에 신선한 소화 효소를 첨가한 다음 37°C에서 추가로 15-20분 동안 분해를 계속합니다. 주기적으로 프로세스를 모니터링하고 두 분해 단계에서 세포 현탁액을 결합합니다.
    5. 여과: 100μm 세포 여과기를 1mL의 adDMEM/F-12 배지로 미리 적시킨 다음 세포 현탁액을 여과합니다. 암석 억제제 용액(1:2000 희석)이 보충된 adDMEM/F-12 배지 5mL로 조직 처리 튜브와 세포 스트레이너를 두 번 헹구십시오. 여과액을 50mL 멸균 원추형 원심분리기 튜브에 모으십시오. 현탁액을 70μm 스트레이너에 통과시키고 모든 세포 현탁액을 새로운 50mL 튜브에 모으십시오.
      알림: 여과 단계 수와 스트레이너의 기공 크기는 샘플 특성에 따라 조정될 수 있습니다.
    6. 적혈구 용해: 수집된 세포 현탁액을 25°C에서 5분 동안 200× g 으로 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 버린 다음 세포 펠릿을 2mL의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다. 현탁액을 얼음 위에서 2-3분 동안 배양합니다.
      참고: 적혈구 용해를 위한 배양 시간은 용해 효율에 따라 조정될 수 있습니다. 장기간 배양하면 세포 사멸이 증가할 수 있습니다. 다른 세포 유형에 과도한 손상 없이 적혈구가 완전히 용해되도록 현미경으로 샘플을 모니터링하는 것이 좋습니다.
    7. 용해 종료: 암석 억제제 용액(1:2000 희석)이 보충된 adDMEM/F-12 배지 6mL를 세포 현탁액에 첨가합니다. 혼합물을 15mL 멸균 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 25°C에서 5분 동안 200 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 동일한 보충 배지로 1-2회 세척하고 최종 세포 현탁액을 1.5mL Eppendorf 튜브로 옮깁니다.
    8. 생존율 평가: 10μL의 세포 현탁액을 같은 부피의 트리판 블루 용액과 혼합하고 현미경으로 세포 생존력을 관찰합니다.
      참고: 상당한 양의 죽은 세포 또는 파편이 관찰되면 계수를 진행하기 전에 25°C에서 5분 동안 50 x g 에서 저속 원심분리를 수행하여 제거합니다.
    9. 세포 계수: 펠릿을 adDMEM/F-12 배지 1mL에 재현탁하고, 필요에 따라 현탁액을 희석하고(일반적으로 1:20 희석), 희석된 현탁액 6μL를 혈구측정기에 올려 현미경으로 세포를 계수합니다.
    10. 세포 펠릿 수집: 200 x g, 25°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 최종 세포 펠릿을 1.5mL Eppendorf 튜브에 수집합니다.

3. 일차 세포 현탁액으로부터의 오가노이드 확립

  1. 파종: 세포 수를 기반으로 필요한 매트릭스 겔의 부피를 결정합니다. 미리 냉각된 피펫 팁(-20°C에서 보관)을 사용하여 적절한 양의 매트릭스 겔을 세포 펠릿으로 조심스럽게 옮깁니다. 균일한 파종과 최적의 매트릭스 겔 무결성을 보장하기 위해 기포 형성을 피하면서 얼음 위에 세포-겔 혼합물을 부드럽게 혼합합니다.
    참고: 사용 전에 매트릭스 겔을 4°C에서 밤새 해동하십시오. 조기 겔화를 방지하기 위해 피펫 팁과 튜브를 포함한 모든 취급 도구가 미리 냉각되었는지 확인하십시오.
  2. 도금: 세포-기질 겔 혼합물을 저접착 24웰 배양 플레이트에 분주하고 방울당 약 30μL를 도포합니다. 효과적인 3차원(3D) 구조 형성을 지원하기 위해 각 방울에 10,000개 이상의 세포가 포함되어 있는지 확인하십시오.
    참고: 매트릭스 겔을 과도하게 희석하지 마십시오. 구조적 무결성을 유지하고 3D 배양 형성을 지원하려면 매트릭스 겔이 혼합물 전체 부피의 70% 이상을 구성해야 합니다. 인간 생검 및 전립선 절제술 표본에서 유래한 오가노이드는 본질적으로 동일하며 주로 생존 가능한 세포 수율이 다르며 동일한 파종 밀도가 이 프로토콜에 적용되었습니다.
  3. 배양: 배양 플레이트를 5% CO2 와 함께 37°C의 가습 인큐베이터에 5분 동안 넣어 매트릭스 겔이 예비적으로 응고되도록 합니다. 플레이트를 뒤집고 20분 동안 그대로 두어 매트릭스 겔을 3D 형태로 유지합니다. 각 웰에 800-1000μL의 배양 배지(표 3)를 추가합니다. 2-3일마다 배양 배지를 교체하십시오.
    참고: 3D 구조를 유지하기 위해 반전 단계 중에 매트릭스 겔이 방해받지 않도록 하십시오.

4. 오가노이드 계대

  1. 오가노이드 수집 및 준비: 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 매트릭스 겔을 기계적으로 파괴하여 오가노이드 클러스터를 단편화합니다. adDMEM/F-12 배지 + 암석 억제제 용액(1:2000 희석)으로 각 웰을 1-2회 헹구십시오. 배양 배지와 함께 조각화된 클러스터를 15mL 멸균 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 25°C에서 5분 동안 200× g 에서 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    참고: 오가노이드가 직경 100μm에 도달하는 경우(일반적으로 배양 14일째). 과도한 배지 부피가 기계적 파괴를 방해하는 경우 클러스터를 분해하기 전에 배지의 일부를 흡인하십시오. 플레이트 표면에 부착된 잔류 매트릭스 겔의 경우 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 긁어내고 adDMEM/F-12 배지 + 암석 억제제 용액(1:2000 희석)으로 2-3회 헹굽니다. 모든 헹굼은 최대 수율을 위해 초기 컬렉션과 함께 풀링해야 합니다.
  2. 오가노이드 해리: 생성된 펠릿을 예열된 재조합 트립신 유사 효소 용액 2mL에 재현탁합니다. 위아래로 피펫을 사용하여 해리를 시작한 다음 37°C에서 15-30분 동안 배양합니다. 작은 세포 클러스터(클러스터당 약 5-6개의 세포)가 필드를 지배할 때까지 현미경으로 5분마다 해리를 모니터링한 다음 다음 단계로 진행합니다.
    참고: 과잉 해리를 피하고 세포 생존력을 보존하려면 적시에 소화를 종료하는 것이 중요합니다. 빈번한 현미경 관찰을 통해 클러스터 형성을 위한 최적의 시간에 소화가 중단됩니다.
  3. 소화 종료: 효소 활성을 소멸시키기 위해 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 동일한 용량의 adDMEM/F-12 배지를 동일하거나 두 배로 첨가하여 소화를 종료합니다. 25°C에서 5분 동안 200 x g 으로 원심분리하고 상층액을 버립니다.
  4. 매트릭스 겔 제거: 펠릿을 2mL의 세포 회수 용액에 재현탁하고 4°C에서 20-40분 동안 배양하여 잔류 매트릭스 겔을 용해시킵니다. 4°C에서 5분 동안 200 x g 으로 원심분리하고, 상청액을 버리고, 잔류 매트릭스 성분을 제거하기 위해 adDMEM/F-12 배지로 세척을 두 번 반복합니다. 추가 처리를 위해 최종 펠릿을 1.5mL 멸균 Eppendorf 튜브로 옮깁니다.
    참고: 저온 배양은 세포 무결성을 유지하면서 효과적인 매트릭스 겔 해중합에 매우 중요합니다. 조기 재겔화를 방지하기 위해 추운 환경 밖에서 보내는 시간을 최소화하십시오.
  5. 파종 및 배양: 3.1-3.3단계에 설명된 절차에 따라 해리된 오가노이드 클러스터를 다시 파종합니다. 최적의 3D 구조 개질을 위해 적절한 세포 밀도와 매트릭스 겔 비율을 보장합니다.
    참고: 오가노이드 동결 보존, 해동, 재매입 및 조직학적 처리에 대한 자세한 프로토콜은 요청 시 제공됩니다.

5. 오가노이드 동결보존

  1. 오가노이드 수집: 인큐베이터에서 배양 플레이트를 제거하고 사전 냉각된 피펫 팁을 사용하여 오가노이드 하이드로겔 응집체를 기계적으로 해리합니다. 해리된 응집체를 배양 배지와 함께 15mL 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. adDMEM/F-12 배지로 웰을 2-3회 헹구고 세척액을 1차 현탁액과 결합합니다. 200 × g 에서 25°C에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다.
    참고: 최대 수율을 보장하려면 과도한 손상을 일으키지 않고 오가노이드 응집체를 부드럽게 파괴하십시오. 모든 세척은 수집 과정에서 오가노이드의 손실을 줄이기 위해 1차 수집과 결합되어야 합니다.
  2. 효소 해리: 원뿔형 튜브의 오가노이드 펠릿에 예열된 재조합 트립신 유사 효소 용액 2-4mL를 첨가하고 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 현탁액을 37°C에서 15-20분 동안 배양합니다. 해리 과정을 5분마다 현미경으로 모니터링합니다.
    참고: 필요한 경우 더 큰 클러스터를 더 작은 응집체(클러스터당 약 5-6개의 세포)로 분해하는 데 도움이 되도록 부드럽게 피펫팅하십시오. 과도한 해리 및 세포 생존력 손실을 방지하기 위해 냉동 보존을 위해서는 더 짧은 소화 시간이 필요합니다. 빈번한 관찰을 통해 오가노이드 무결성을 보존하기 위해 적절한 단계에서 소화가 종료되도록 합니다.
  3. 분해 종료: 효소 활성을 멈추기 위해 FBS 보충 adDMEM/F-12 배지를 동일하거나 더 많이 추가합니다. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    알림: 펠릿에 잔류 매트릭스 겔이 없는 경우 냉동 보존을 위해 5.5단계로 진행합니다. 매트릭스 겔 오염이 지속되면 5.4단계를 진행합니다.
  4. 매트릭스 겔 제거(선택 사항): 4.4단계에 설명된 절차에 따라 매트릭스 겔을 제거합니다. 펠릿을 2mL의 세포 회수 용액에 재현탁하고 4°C에서 20-40분 동안 배양합니다. 200×g에서 4°C에서 5 분 동안 원 심분리하고 상청액을 버리고 세척 과정을 1-2회 반복하여 매트릭스 겔을 완전히 제거합니다.
    참고: 잔류 매트릭스 겔의 제거는 해리된 세포만 동결 보존되도록 하는 데 중요합니다. 불완전한 겔 제거는 해동 시 오가노이드의 생존력과 구조적 완전성에 영향을 미칠 수 있습니다.
  5. 냉동 보존: 균일한 현탁을 보장하기 위해 부드러운 피펫팅을 통해 세포 펠릿을 1.5mL의 오가노이드 동결 배지에 재현탁합니다. 현탁액을 냉동 보관소에 옮기고 단기 보존을 위해 -80°C에서 보관합니다. 24시간 후, 장기 보관을 위해 바이알을 액체 질소로 옮깁니다.
    알림: 세포 손상으로 이어질 수 있는 고르지 않은 동결을 방지하기 위해 냉동 보존 배지가 세포와 완전히 혼합되었는지 확인하십시오. 바이알은 장기 보존을 보장하고 세포 분해를 방지하기 위해 단기 보관 기간 후에 즉시 액체 질소로 옮겨야 합니다.

6. 오가노이드 회수

  1. 냉동 보존된 오가노이드의 해동: 액체 질소 또는 -80°C 보관에서 오가노이드를 포함하는 냉동 바이알을 제거합니다. 즉시 바이알을 37°C 수조에 담그고 내용물이 완전히 해동될 때까지 부드럽게 저어줍니다. 해동이 완료되자마자 예식된(-20°C) 피펫 팁을 사용하여 오가노이드 현탁액을 15mL 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    참고: 신속하고 균일한 해동은 극저온 유발 세포 손상을 최소화하는 데 중요합니다. 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 이송 중 조기 가열 및 매트릭스 겔 형성을 방지하십시오.
  2. 냉동 보호제 제거: 원뿔형 튜브의 벽을 따라 1-2mL의 adDMEM/F-12 배지를 조심스럽게 첨가하여 냉동 보호제를 점차적으로 희석합니다. 반전으로 부드럽게 섞습니다. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    참고: 갑작스러운 삼투압 이동과 기계적 응력이 오가노이드 생존력을 손상시킬 수 있으므로 이 단계에서 격렬한 피펫팅 또는 소용돌이를 피하십시오. 느린 희석 접근법은 세포 쇼크를 최소화합니다.
  3. 세척 및 재현탁: 펠릿에 신선한 adDMEM/F-12 배지 1mL를 추가합니다. 조기 매트릭스 겔 부착을 방지하기 위해 미리 냉각된(-20°C) 피펫 팁을 사용하여 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    참고: 세척 중 낮은 온도를 유지하는 것은 후속 오가노이드 개질을 방해할 수 있는 매트릭스 겔 성분의 열 유도 재조립을 방지하는 데 필수적입니다.
  4. 수집: 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세척 단계를 2-3회 반복하여 잔류 냉동 보호제와 오염 물질을 완전히 제거합니다.
  5. 파종 및 배양: 실험적 필요에 따라 준비된 오가노이드 배양 배지에 최종 세포 펠릿을 재현탁합니다. 3.1-3.3단계에 설명된 프로토콜에 따라 시딩을 진행하여 3D 구조 재확립을 지원하기 위해 적절한 매트릭스 겔 비율과 세포 밀도를 보장합니다.
    참고: 해동 후 세포 생존력 및 회복은 부드러운 취급, 냉동 보호제의 적절한 희석 및 지지적인 3D 매트릭스 겔 환경의 즉각적인 재구축에 크게 좌우됩니다.

7. 오가노이드 특성화를 위한 사전 분석 처리

  1. 오가노이드 수확: 오가노이드 직경이 70-100μm에 도달하면 응집체를 기계적으로 해리하고 후속 배양을 위해 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. adDMEM/F-12 배지로 웰을 2-3회 헹구고 세척액을 오가노이드 현탁액과 결합합니다. 200 × g 에서 25°C에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다.
    참고: 소규모 수집(예: 1-2웰)의 경우 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 사용하여 효율적인 취급을 보장하고 샘플 손실을 줄이십시오. 해리 중에 오가노이드 구조가 파괴되지 않도록 주의하십시오.
  2. 재현탁: 펠릿을 1mL의 adDMEM/F-12 배지에 재현탁하고 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 200×g에서 25°C에서 5 분 동안 원 심분리하고 상청액을 버립니다.
    알림: 응집을 방지하고 후속 단계에서 균일한 처리를 용이하게 하기 위해 원심분리 전에 펠릿이 완전히 재현탁되었는지 확인하십시오.
  3. 세척 및 고정: 펠릿에 1mL의 D-PBS를 첨가하고 피펫팅 또는 반전으로 부드럽게 혼합합니다. 200 × g 에서 25°C에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버리고 세척 단계를 1-2회 반복합니다. 펠릿을 1-2mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
    알림: 잔류 매체 및 기타 오염 물질을 철저히 제거하려면 세척 단계를 조심스럽게 수행하십시오. 파라포름알데히드에 고정하는 것은 후속 분석을 위해 오가노이드 형태를 보존하는 데 중요합니다.
  4. 고정 후 세척: 샘플을 200× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 고정된 샘플을 D-PBS로 2-3회 세척하고, 세척 완충액의 적절한 분포를 보장하고 오가노이드의 손실을 방지하기 위해 손가락으로 튕기거나 부드럽게 반전시켜 부드럽게 혼합합니다.
    참고: 과도한 파라포름알데히드를 제거하고 면역조직화학과 같은 다운스트림 응용 분야에서 배경 염색을 줄이기 위해서는 적절한 고정 후 세척이 필수적입니다.
  5. 에탄올 재고정: 펠릿을 70% 에탄올 혼합물 1mL에 손가락으로 부드럽게 재현탁하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    참고: 이 단계에서 에탄올 고정은 오가노이드 무결성을 보존하고 포매 또는 추가 처리를 위해 샘플을 준비하는 데 도움이 됩니다. 고르지 않은 고정을 방지하기 위해 에탄올에 균일한 현탁액을 확보하십시오.
  6. 매트릭스 겔 클리어런스(선택 사항): 잔류 매트릭스 겔이 펠릿에 남아 있는 경우 4.4단계에 설명된 프로토콜에 따라 제거합니다. 이 단계에는 펠릿을 세포 회수 용액에 재현탁하고 4°C에서 20-40분 동안 배양한 후 완전한 겔 제거를 보장하기 위해 원심분리 및 여러 번 세척하는 작업이 포함됩니다.
    참고: 잔류 겔이 조직 절편 및 분석을 방해할 수 있으므로 매트릭스 겔을 제거하는 것은 다운스트림 조직학적 분석 또는 이미징에 특히 중요합니다.
  7. 아가로스 포매: 오가노이드 에탄올 고정 동안 96°C에서 녹여 약 6mL의 2% 아가로스를 준비합니다. 녹은 아가로스 100μL를 오가노이드 펠릿과 혼합하여 기포 형성을 최소화합니다. 혼합물을 금형에 옮기고 4°C에서 응고시킨 다음 파라핀 포매를 위해 가공합니다.
    알림: 막힘을 방지하기 위해 피펫 팁(끝이 다듬어진 부분)을 예열하십시오. 아가로스 포매는 오가노이드 구조의 보존을 용이하게 하는 동시에 취급 및 절편이 용이합니다. 균일한 매립과 최적의 조직 절편을 보장하기 위해 혼합 중 기포 형성을 피하십시오.

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결과

환자 유래 전립선암 오가노이드의 형태학적 및 동적 성장 특징
환자 유래 전립선암 오가노이드는 임상 시술 중에 수집된 신선한 종양 조직에서 성공적으로 확립되었습니다. 초기 오가노이드 형성은 일반적으로 배양 후 5-7일 이내에 관찰되었습니다(그림 2). 명시야 현미경 검사에서 오가노이드는 뚜렷한 형태학적 특징을 나타내며 조밀하고 잘 정의된 스페로이드 또는 선과 유사한 구조를 형성했습니다. 선암종 샘플에서 유래한 오가노이드는 더 규칙적이고 상피와 유사한 조직을 보인 반면, 더 공격적이거나 저분화된 종양에서 유래한 오가노이드는 종종 불규칙하고 느슨하게 응집된 클러스터를 형성했습니다.

특히, 오가노이드는 원래 종양의 구조적 특징을 보존하여 조직학적 절편에서 볼 수 있는 선 구조를 밀접하게 모방했습니다. 오가노이드는 시간이 지남에 따라 안정적...

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토론

PCa용 PDO의 확립은 전임상 모델링의 중요한 발전을 나타내며 기존 2D 세포 배양 및 PDX에 비해 상당한 이점을 제공합니다16. 이 연구에서 제시된 방법은 원래 종양의 조직학적, 유전적 및 표현형 특성을 충실하게 요약하는 오가노이드의 생성을 가능하게 합니다. AR 신호 전달 및 세포 구조를 포함한 종양 이질성을 보존함으로써 오가노이드는 전립선암 진행, 치료 저항성 및 맞춤형 치료 반응을 연구하기 위한 보다 생물학적으로 관련성이 높은 플랫폼을 제공합니다17. 국소 및 진행성 전립선암 모두에서 오가노이드를 배양할 수 있는 능력은 다양한 질병 단계에 대한 적용 가능성을 보장하여 현재 전립선암 연구에서 충족되지 않은 요구를 해결합니다18.

이 프로토콜의 주요 장점은 재현성과 확장성에 있으며, 게...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 중국 국가자연과학재단(보조금 번호 82172831)과 장쑤성 보건 및 가족계획위원회의 핵심 연구 프로젝트(보조금 번호 X20240121)의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
83-01토크리스2939
adMEM/F12깁코12634010
생물안전 캐비닛지난신베이시 생명공학 유한회사
셀 복구 솔루션코닝354253
원심분리기선전 루이워드 생명 기술 유한회사M1416R
원심분리관난징 아이리서치 생명공학 유한회사
컬트렉스 패스클리어 BMR& D3533-010-02
컬트렉스 감소 성장 인자 BME, 제2형R& D3533-005-02
배양 용기 (24웰 저접착 플레이트)열역학넌크-174930-ZX
DHT이소레그521-18-6
전자 저울난징 아이리서치 생명공학 유한회사
태아 소 혈청깁코10099141
글루타민플러스-200mMR& DB90210
젠장R& D1254/10
가습 세포 배양 인큐베이터 (37° C, 5% CO2)상하이 헤톈 과학기기 유한회사HY-160SY
아이스박스난징 아이리서치 생명공학 유한회사
중간 크기 배양 접시압생ABS7005
N21-MAX 미디어 보조 자료 (50X)R& DAR008
N-아세틸시스테인시그마A9165-5G
니코티나마이드R& D3533-010-02
노르모신인비보젠앤-NR-2
피펫 보조 피펫 장치난징 핫스팟 과학기기 유한회사
피펫난징 핫스팟 과학기기 유한회사
프리모신인비보젠ANT-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-스폰딘 1R& D4656-RS-100
SB 202190토크리스1264
단일 셀 현탁 준비 장치후륜구동DSC-400
조직 가위/메스난징 아이리서치 생명공학 유한회사
트라이플 익스프레스깁코126A04013
종양 해리 키트, 인간밀텐이 바이오텍130-095-929
핀셋난징 아이리서치 생명공학 유한회사
물욕창저우 중계 실험기기 제조 유한회사HH-600
Y-27632 이하이드로클로라이드R& D1254/10

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  19. Zhao, H., et al. Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment. Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).
  20. Polak, R., Zhang, E. T., Kuo, C. J. Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment. Nat Rev Cancer. 24 (8), 523-539 (2024).

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