방법 논문

다점 티오프플라빈 T 형광을 이용한 돌연변이 P53 V157F 유방암 세포에서 집단 발생 촉진 행동 검출

DOI:

10.3791/68921

⸱

2025년 12월 30일

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1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p53 V157F 돌연변이를 가진 Hs578T 유방암 세포는 MCF7 세포에 비해 티오프플라빈 T 형광이 유의미하게 높으며, 이는 단백질 응집이 강화되었음을 나타냅니다. 다점 형광 측정은 β 시트가 풍부한 집합체 식별의 검출 정확도와 신뢰성을 높여, 암 연구에서 응집 취약한 p53 돌연변이와 치료 전략 개발의 중요성을 강조합니다.

초록

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TP53 유전자에 의해 암호화된 종양 억제 p53은 유전체 안정성 유지에 중심적인 역할을 합니다. TP53 돌연변이, 특히 핫스팟 변이(hotspot variant)는 인간 암의 약 50%에서 발견되며, 종양 억제 기능 상실이나 기능 획득 특성, 예를 들어 프리온 유사 구조로의 집집을 유발할 수 있습니다.

본 연구에서는 Hs578T 유방암 세포에서 p53 V157F 돌연변이의 집합 경향을 야생형 p53을 발현하는 MCF7 세포와 비교하여 평가했습니다. 단백질 응집은 티오프플라빈 T(ThT) 염색 후 96웰 플레이트 검사에서 형광 정량을 통해 평가하였습니다. 세포는 ThT/Hoechst 용액으로 염색한 후 세척된 후 정의된 흥분/방출 매개변수 하에 마이크로플레이트 리더로 분석하였습니다. 단일 점 및 4점 형광 측정값을 이용한 정량 분석 결과, Hs578T 세포는 MCF7에 비해 ThT 형광 강도가 3.20배에서 4.26배 증가하여 β 시트 풍부 또는 아밀로이드 유사 집합체 수준이 유의미하게 증가함을 나타냈다. 다점 측정을 통해 유정 표면 전반에 걸쳐 단백질 집합체가 광범위하고 일관되게 존재함을 확인했습니다. 이 발견들은 세포 기반 분석에서 단백질 응집을 정확히 검출하기 위해 다점 판독을 사용하는 것을 지지합니다.

서론

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종양 억제 단백질 p53을 암호화하는 TP53 유전자는 인간 암의 약 50%에서 돌연변이가 발생한다 1,2. 이러한 돌연변이는 p53의 종양 억제 기능을 없애버릴 뿐만 아니라, 특정 핫스팟 변이에서는 프리온 유사 집합체 형성도 촉진합니다 3,4. 이러한 돌연변이 p53의 집합형은 항암 치료에 대한 내성 증가를 포함한 기능 향상 특성을 자주 획득합니다 5,6. 따라서 어떤 p53 핫스팟 돌연변이가 집집에 취약한지 규명하는 것은 p53 돌연변이 암에서 효과적인 치료 전략 개발을 안내하는 데 매우 중요하다 7,8.

이전 연구들에서 우리는 두경부 편평세포암(HNSCC)과 유방암 세포주에서 특정 p53 돌연변이가 강한 티오프플라빈 T(ThT) 염색 신호를 보이며, 이는 집합된 단백질의 존재를 나타낸다는 것을 관찰했습니다. ThT는 β 시면이 풍부한 아밀로이드 구조에 특이적으로 결합하여 결합시 형광이 증진되는 벤조티아졸 염료입니다. 예를 들어, p53 R175H 돌연변이를 가진 디트로이트 562 HNSCC 세포주는 강한 ThT 형광 신호를 보였다10. 마찬가지로, p53 R280T 돌연변이를 가진 두 다른 HNSCC 세포주인 TW01과 HONE-1도 ThT 염색11을 나타냈습니다. 이 경우 ThT 신호는 p53과 동일 위치하여 집계된 p53의 존재를 지지한다10,11.

유방암 세포에서는 MDA-MB-231(p53 R280K 돌연변이)과 T47D(p53 L194F 돌연변이)도 강한 ThT 염색과 명확한 p53/ThT 공동 위치를 보였다12. 반면, 야생형 p53을 발현하는 MCF7 세포와 MDA-MB-468 세포(p53 R273H 돌연변이)는 모두 약한 ThT 신호만 보였다12. 마찬가지로, p53 V173L 돌연변이를 가진 OECM-1 HNSCC 세포는 낮은 수준의 ThT 염색을 보였다10.

필터 트랩 분석법, 투과 전자현미경(TEM), 또는 응집체 특이적 항체를 이용한 면역염색과 같은 다른 단백질 응집 검출 방법과 비교할 때, ThT 형광 분석은 여러 가지 장점을 제공합니다. 비파괴적이고 빠르며, 광범위한 처리 없이도 생세포와 고정 세포 모두에 적용할 수 있습니다. 필터 트랩 분석은 불용성 응집체를 효과적으로 포착하지만, 강한 변성을 필요로 하며 생세포 사용에는 적합하지 않습니다13. TEM은 섬유 형태를 직접 시각화할 수 있지만, 노동 집약적이고 처리량이 적습니다. 집합체 특이적 면역염색은 구조 의존 항체를 이용한 현장 검출을 가능하게 하지만, 항체 가용성과 특이성은 제한될 수있습니다. 반면, ThT 형광은 특히 다점판 판독과 결합될 때 β 시트가 풍부하거나 아밀로이드 유사 구조를 검출하는 간단하고 정량적이며 공간적으로 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다.

재현성을 위해서는 실용적인 고려사항도 중요합니다. ThT 형광은 넓은 농도 범위(0.2-500 μM)에서 아밀로이드 농도와 선형적으로 상관관계를 가지며, 최대 신호는 단백질에 따라 20-50 μM에서 보통 달성됩니다. 다만 ThT 자가 형광은 ≥5 μM에서 나타날 수 있으며, 높은 농도는 응집 동역학에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 감도 균형을 맞추고 응집 과정에 미치는 잠재적 영향을 최소화하기 위해 약 10-20 μM 정도의 작용 ThT 농도가 일반적으로 권장됩니다16. 저희 프로토콜에서는 1,000x ThT 스톡(12 mM)을 1:1,000으로 희석하여 약 12의 작동 농도를 만듭니다. 이 권장 범위 내에 해당하는 μM.

ThT는 아밀로이드 섬유의 특징인 β-시트 풍부한 아밀로이드 구조에 우선적으로 결합합니다. 이 특이성은 염료가 아밀로이드 섬유의 교차 β 구조와 상호작용하면서 발생하는데, β가닥이 형성하는 표면이 ThT의 결합 부위를 제공합니다. 따라서 ThT는 이 β 시트 풍부한 구조를 보이지 않는 다른 잘못 접히거나 비아밀로이드 응집체를 효과적으로 검출하지 못할 수 있습니다17. 따라서 ThT는 아밀로이드 섬유를 식별하는 데 유용한 도구이지만, p53 면역형광과의 공동 위치화나 생물물리학적 접근법과 같은 보완적 검증 방법을 사용하여 검출된 응집체의 동일성과 특이성을 검증하는 것이 권장됩니다10,18.

구조적 예측 연구는 p53 V157F 돌연변이가 야생형 단백질보다 응집에 더 취약한 구조를 채택함을 시사한다. 본 연구에서는 응집 가능성이 높은 p53 V157F 돌연변이를 가진 Hs578T 유방암 세포와 야생형 p53을 발현하는 MCF7 유방암 세포 간의 ThT 형광 신호를 비교했습니다. 다점 판 판독기 기반 ThT 염색 분석을 사용하여 야생형 p53에 비해 p53 V157F의 응집 경향을 평가하려 했습니다.

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프로토콜

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1. 세포 시딩

  1. 세포 생존 가능성을 평가하기 위해, 10 μL 트리판 블루와 10 μL 재현탁 세포를 1x Dulbecco's 인산염 완충 식염수(DPBS)에 넣어 미세원심분리관 내에서 혼합하여 충분히 혼합합니다.
  2. 혼합물 10 μL을 카운터 슬라이드에 적재한 후 자동 셀 카운터를 사용해 살아있는 셀 수를 세는 것입니다.
  3. 생존 가능 개체수를 기준으로, 웰당 30,000개의 생존 가능한 세포를 96웰 배양판에 시딩하며, 한 웰은 비염색 대조군으로 지정하고 나머지 세 웰은 염색용으로 사용한다.

2. 부화

  1. 배양 플레이트를CO2 인큐베이터에 넣고 37°C에서 12시간 배양합니다.

3. 신선한 ThT 염색 재료 준비 (1,000회)

  1. ThT 분말 0.02g(20mg)을 무게로 5.0mL 가루에 녹입니다. 가루가 완전히 녹을 때까지 충분히 섞으세요.
    참고: 이 제제는 최종 농도가 4 mg/mL인 1,000배 ThT 스톡 용액을 생성하며, 이는 12.5 mM에 해당합니다(ThT의 분자량은 ~318.85 g/mol입니다. 4 mg/mL 용액은 4 g/L에 해당합니다. 4 g/L을 318.85 g/mol로 나누면 0.0125 mol/L, 즉 ~12.5 mM이 됩니다.

4. 핵 반염색제로 ThT 염색 완충제 준비

  1. 다음 성분을 1mL 1x DPBS에 첨가하여 염색액을 준비하고, 균일함을 위해 부드럽게 섞습니다.
    1. 갓 준비한 1,000x ThT 스톡 1 μL 첨가하면 최종 ThT 농도는 12.5 μM(1x)이 됩니다.
    2. 1 μL 1 mg/mL Hoechst 33342 스톡 용액을 첨가하면 최종 농도는 ~1 μg/mL(=1.6 μM)가 됩니다.

5. 얼룩

  1. 각 웰에서 배양지를 제거하세요. 각 염색 웰에 준비된 ThT/Hoechst 염색 완충액 100 μL을 첨가합니다. 비염색 방제에 1x DPBS 100 μL 추가.

6. 부화

  1. 접시를 실온(25°C)에서 어두운 곳에 30분간 두세요.

7. 세탁

  1. 각 웰에서 착색액을 조심스럽게 흡입하거나 버리며, 세포 단층을 건드리지 않도록 주의하세요.
  2. 각 웰에 1× DPBS 100 μL 주입을 추가하고, 선택적으로 30초간 부드러운 담임을 허용합니다.
  3. DPBS 세척액은 조심스럽게 흡입하거나 버리세요.
  4. 세척을 반복하여 각 웰에 신선한 1x DPBS를 100 μL 추가하고, 다시 선택적으로 30초간 부드럽게 담글 수 있게 한 뒤 DPBS 세척액을 버립니다.
  5. 두 번째 세척 후에는 각 웰에 신선한 1x DPBS 100 μL을 추가합니다.

8. 형광 측정

  1. 형광 신호를 읽기 전에 96웰 플레이트의 캡을 제거하세요. 형광을 측정하는 방법은 단일 점 측정법 또는 4점 측정법 중 하나입니다.
  2. 96웰 플레이트를 마이크로플레이트 리더기에 넣고 다음 설정으로 형광을 측정합니다: ThT 형광: 450nm 여기, 490nm 방출; Hoechst 33342 형광: 360nm에서 여기, 460nm에서 방출; 리더 설정: 떨림: 읽기 5초 전; 읽기 방향: 상단 읽기; 통합 시간: 140 ms; 읽기 높이: 1.00 mm; 1웰당 점수: 1점(종점) 또는 4점(우물 스캔); 웰 스캔 설정: (밀도 설정: 2; 포인트 간격: 2.5).

9. 데이터 분석

  1. 단백질 집합 계산은 다음과 같습니다:
    figure-protocol-1
  2. MCF7 세포 내 비율을 1(기준선 대조)로 설정하여 ThT 형광 강도를 정규화합니다.

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결과

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유방암 세포 내 β시트 풍부한 단백질 집합체의 존재를 조사하기 위해 MCF7과 Hs578T 세포주를 ThT 염색 후 형광 정량을 적용하였습니다. 그림 1에서 보듯, 세포는 96웰 플레이트의 네 개의 웰에 씨앗되었으며, 그 중 한 웰은 염색되지 않은 대조군으로 지정되었습니다. 나머지 세 개의 우물은 표준 프로토콜에 따라 ThT 염색이 이루어졌습니다. 형광은 두 가지 방법으로 측정되었습니다: (1) 각 웰 중심에서 단일 점 측정, (2) 공간적 변동성을 고려해 각 웰 내 네 개의 서로 다른 위치에서 신호를 평균하여 얻는 4점 측정. 정량적 분석 결과, 두 세포주 간 ThT 형광 차이가 뚜렷하게 나타났습니다(그림 2). 단일 점 측정법을 사용할 때, Hs578T 세포는 MCF7 세포에 비해 ThT 형광 강도가 3.20± 0.05배 증가하였습니다(보충 표 ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

셀을 96웰 플레이트에 시딩할 때, 플레이트를 부드럽게 흔들거나 두드려 셀을 넓히는 것이 항상 가능하지 않아 웰 표면 전체에 균일한 분포를 달성하기 어렵습니다. 이러한 불균일한 분포는 우물 전반에 걸친 신호 세기의 변동성을 초래할 수 있습니다. 다점 형광 측정 결과, 동일한 우물 내 서로 다른 영역 간에 유의미한 차이가 나타나 이러한 편향과 단일 점만 측정할 경우 오해를 불러일으킬 수 있음을 강조했습니다. 따라서 단일 중심 측정 지점에 의존하면 신호 이질성을 과소평가하고 세포주나 처리 조건 간 ThT 형광의 미묘한 차이를 가릴 수 있습니다. 이러한 편향은 표준편차(SD) 추정치를 낮추어 정밀도에 대한 잘못된 인상을 줄 수 있습니다. 더 신뢰할 수 있고 객관적인 데이터를 얻기 위해 ThT 형광 측정에 대해 다점 측정 방식을 강력히 권장합니다. 이 방법은 웰 전체의 신호를 평균화하고, 고유한 데이터 변동성을 더 잘 반영하며, 약물 치료로 유도된 단백질 응집의 미미한 변화를...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이슈대학교 의과대학 기초 의학 핵심 연구소의 기술 지원에 깊이 감사드립니다. 이 연구는 E-DA 병원[EDAHJ114001 C.-C.C.로]과 대만 국가과학기술위원회[NSTC 112-2813-C-214-032-B에서 B.-H.]의 보조금으로 지원받았습니다. C]

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 배양판간단히PC396-0100
카운터 슬라이드인비트로젠C10228
카운티스 II FL 자동 셀 카운터서모 피셔 사이언티픽  AMQAF1000
dPBS간단히CC704-0500
에펜도르프 튜브간단히PC101-5000
호에슈트 33342AAT 바이오퀘스트17530
스펙트라맥스 iD3분자 장치735-0391  
티오프플라빈 T시그마-올드리치T3516
트리판 블루인비트로젠T10282

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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태그

P53Thioflavin TTP53Hs578T

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