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연구 논문

NF-κb 신호 전달 연쇄반응 조절 을 통한 저산소증-재산소화로 인한 심근세포 손상에서 클로토의 보호 역할

308 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68946

⸱

2025년 12월 5일

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Jinan Lixia District People's Hospital, 2Department of Nuclear Medicine, Jinan Central Hospital, 3Department of Infectious Diseases, Jinan Central Hospital, 4Department of Coronary Heart Diseases, Jinan Central Hospital

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 분자 및 기능적 분석을 통해 H9C2 심근세포에서 저산소-재산소화 하에서 클로토 과발현의 보호 역할을 평가합니다.

초록

이 연구는 저산소증/재산소화(H/R) 손상을 입은 심근세포에서 클로토의 보호 역할을 조사하는 것을 목표로 했습니다. H9C2 쥐 심근모세포를 이용해 클로토 과발현 렌티바이러스 벡터를 형질전환하여 시험 관 내 H/R 모델을 구축하였다. 세포는 대조군, H/R, 음성 대조군(NC), 클로토 과발현군, PDTC(NF-κB 억제제), 그리고 클로토와 지단다당류(LPS) 조합군의 여섯 가지 실험군으로 나뉘었습니다. 클로토 발현 수준은 정량적 실시간 PCR과 서부 블롯팅으로 결정되었습니다. 세포 생존력은 MTT 분석 법을 통해 측정되었고, 세포자멸사는 유세포분석법을 이용해 평가되었습니다. NF-κB 신호 전달 경로에 관여하는 단백질의 발현은 웨스턴 블롯팅으로 분석되었고, 면역형광 염색을 통해 염증성 사이토카인의 세포 발현을 평가하였다. Klotho 과발현은 H9C2 세포에서 Klotho 수치를 유의미하게 높였고, H/R 그룹에 비해 세포 생존율 향상, 세포자사멸사 감소, 염증성 사이토카인 세포 발현 감소로 이어졌습니다. 서부 블롯 분석 결과, 클로토 과발현과 PDTC 처리가 NF-κB 경로 활성화를 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 p-P65/P65 비율 감소와 p-IκBα/IκBα 수치 증가로 나타났습니다. 이러한 효과는 LPS와의 공동 치료 시 부분적으로 역전되었습니다. 이 결과는 클로토가 NF-κB 신호를 조절하여 염증을 줄이고 세포 생존을 촉진함으로써 H/R 유발 손상에 대한 심장 보호를 제공한다는 것을 시사합니다. 이 프로토콜은 심근 허혈-재관류 손상의 분자 기전과 심장 염증에서 클로토의 치료 잠재력을 연구할 수 있는 재현 가능한 방법을 제공합니다.

서론

급성 심근경색(AMI)은 주로 허혈 후 재관류로 인해 발생하며, 이로 인해 심근 저산소증/재산소화(H/R) 손상 1,2,3의 기전에 대한 광범위한 연구가 이루어지고 있습니다. 심근 H/R 손상의 핵심 요인 중 하나는 세포 세포자멸사로, 이는 AMI 4,5의 병리학적 진행에 크게 기여합니다.

최근 연구들은 핵 인자 카파 B(NF-κB) 신호 전달 경로가 지지다당류(LPS)와 같은 자극에 대한 염증 반응을 조절함으로써 심근 H/R 손상에 연관이 있음을 지적했습니다. NF-κB의 활성화는 두 가지 뚜렷한 메커니즘, 즉 정준 경로와 비정준 경로9를 통해 일어납니다. 정규 경로에서 활성화는 인산화에 의해 유도된 카파 B 알파(IκBα)10 억제제의 분해에 의존합니다. 그러나 NF-κB 소단위체 p65의 인산화가 IκBα 분해와는 독립적으로 세포자사멸사를 유도할 수 있다는 보고도 있다11. 클로토는 단일 통과 막 단백질로, 인산염과 칼슘 대사를 조절하고 인슐린 신호 전달을 억제합니다 12,13,14. 새로운 증거는 클로토가 신장, 해마, 노화 세포 등 다양한 조직에서 NF-κB 활성화에 억제 효과를 발휘하여 염증과 조직 손상을 완화한다는 것을 보여줍니다 15,16,17. 이러한 진전에도 불구하고, AMI에서 Klotho의 역할과 심근 H/R 손상 시 NF-κB 경로와의 잠재적 상호작용은 여전히 크게 탐구되지 않았습니다.

방법론적 관점에서 H9C2 쥐 심근모세포를 이용한 시험관 내 H/R 모델은 산소 장력 조절, 재현성, 변동성 감소 등 동물 모델에 비해 여러 장점을 제공합니다. 더불어, 렌티바이러스 매개 Klotho 과발현은 유전자 발현의 안정적이고 효율적인 조절을 가능하게 하여 그 기능적 영향을 직접 조사할 수 있게 합니다. 이러한 접근법은 프로토콜을 실용적이고 비용 효율적이며 기전적 연구에 접근성 있게 만들면서도, 생체 내 실험의 윤리적·물류적 도전을 피할 수 있게 합니다.

실용적인 고려 측면에서 H9C2 세포는 심근세포와 유사한 특성을 많이 유지하고 있으나 성숙한 심근세포의 표현형을 완전히 모방하지는 않아 심혈관 연구에 널리 사용됩니다. 선택된 H/R 상태(5시간 저산소 후 1시간 재산소 공급)는 시험관 내 허혈-재관류 손상을 모델링하는 데 일반적으로 사용되는 범위 내에 속합니다. 마찬가지로, 감염 다수성(MOI)이 약 100인 렌티바이러스 전달은 관리 가능한 세포독성을 가진 효율적인 과발현을 달성하는 표준 접근법입니다. 이러한 특징들은 프로토콜의 적용 가능성을 높이지만, 생체 내 환경의 불완전한 재현과 같은 한계도 인정해야 합니다. 따라서 본 연구는 Klotho가 H/R 손상으로부터 심근 세포를 어떻게 보호하는지 탐구하고, NF-κB 신호와의 상호작용을 재현 가능한 프로토콜로 확립하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

H9C2 쥐 심근모세포주 (ATCC, CRL-1446)에 관한 모든 절차는 기관 생물안전 규정을 준수하였습니다. 이 연구에 직접 참여한 동물이나 인간 대상자는 없었습니다. 그림 1 은 실험 설계 및 분석 파이프라인의 그래픽 워크플로우를 보여줍니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 배양

H9C2 쥐 심근모세포주 (ATCC, CRL-1446)은 둘벡코 변형 이글 배지(DMEM, 고포도당, 4.5 g/L)에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 보충한 냉동 매체를 사용해 액체 질소에서 냉동 보존되었습니다. 회수를 위해 냉동 바이알은 37°C 수조에서 2-3분간 빠르게 해동한 후 즉시 예열된 DMEM으로 옮겼습니다. 배양지는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 3.7g/L 중탄산나트륨, 1 mM 피루브산나트륨으로 제조되었습니다. 세포는 5% CO₂를 포함한 가습 인큐베이터에서 37°C에서 유지되었습니다. 6번과 20번 통로 사이의 H9C2 세포가 모든 실험에 사용되었습니다. 초기 통로(P20)는 통과 관련 표현형 표류를 방지하기 위해 사용되지 않았습니다.

2. H9C2 세포에서 클로토의 렌티바이럴 과발현

EF1α 프로모터의 조절 하에 전장 쥐 Klotho(Kl) 유전자를 암호화하는 3세대 자가 비활성화 렌티바이러스 벡터를 적용하여 H9C2 세포에서 안정적인 과발현을 확립하였습니다. 이 구조물은 시각화용 P2A-EGFP 리포터, 전사 안정성을 위한 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE) 및 중심 폴리퓨린 경로(cPPT) 요소, 그리고 선택을 위한 PGK 프로모터에 의해 구동되는 푸로마이신 내성 카세트를 포함하고 있었습니다. 렌티바이러스 입자는 HEK293T 세포에서 psPAX2(gag/pol/rev) 및 pMD2.G(VSV-G) 플라스미드와 4:3:1 비율로 폴리에틸레네이민(PEI)을 사용하여 공동 트랜스펙션하여 생성되었습니다; DNA: PEI = 1:3, w/w). 상청액은 48시간과 72시간에 채취되었고, 3,000 × g 에서 원심분리하여 10분간 정제하고, 0.45 μm PES 막을 통해 여과한 후, 4 °C에서 2시간 동안 25,000 × g 에서 초원심분리로 농축되었습니다. 바이러스 펠릿은 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한 PBS에 재현탁되었고, 72시간에 HEK293T 세포의 제한-희석 감염으로 EGFP 수치를 측정하여 기능적 역가(TU/mL)를 측정하였다. H9C2 셀은 6웰 플레이트에 2×10 5 셀씩 시딩하여 전달 시점에 약 60%의 합류를 이루었습니다. 렌티바이러스 입자는 감염 효율을 높이기 위해 신선 배양지 1mL에 100 감염 중수(MOI)로 첨가되었으며, 여기에는 폴리브렌(8 μg/mL)이 보충되었습니다. 접종액은 12시간 후에 제거되고 2mL의 완전 배지로 교체되었습니다. 감염 후 72시간 후, 형광현미경 하에서 EGFP 형광으로 전이 효율이 확인되었습니다. 안정적인 세포주 확립을 위해 감염 후 48시간부터 3-5일간 투여하고, 매개체를 48시간마다 교환하였다. Klotho의 과발현은 RT-qPCR과 면역블롯으로 확인되었습니다. 모든 렌티바이러스 시술은 생물안전성 2단계(BSL-2) 격리 하에 시행되었으며, 모든 바이러스 폐기물은 폐기 전 최소 30분 동안 10% 표백제로 비활성화되었습니다.

3. 실험 그룹

H9C2 셀은 6웰 플레이트(성장 면적 9.6 cm²)에 3× 10⁵ 셀에 시딩되었으며, 24시간 후 약 70%-80%의 합류율을 기록했으며, 이는 저산소/재산소화(H/R) 처리와 후속 분석에 필요한 밀도에 해당합니다. 하룻밤 부착 후 세포는 여섯 개의 실험군으로 배정되었습니다: (1) 추가 처리가 없는 대조군; (2) H/R 그룹으로, 밀폐된 모듈형 저산소 챔버에서 저산소/재산소화(H/R)를 받은 후 5시간 동안 저산소(1% O₂, 94% N₂, 5% CO₂) 및 1시간 재관류(5% CO₂)에 노출된18; (3) 음성 대조군(NC) 그룹, H/R 처리 24시간 전에 빈 벡터로 세포를 형질전환한 그룹; (4) H/R 치료 24시간 전에 클로토를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 세포를 형질전환한 클로토 그룹; (5) 피롤리딘 디티오카바메이트 치료군(PDTC), H/R 치료19 전 24시간 동안 200 mg/L NF-κB 경로 억제제 PDTC로 처리; (6) Klotho + LPS 그룹으로, 이 그룹은 세포를 클로토를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질전환한 후 24시간 동안 지다당류로 처리한 후 H/R 처리20을 시행했습니다.

4. qRT-PCR

H9C2 셀은 6웰 플레이트에 1× 10⁶ 셀 밀도로 시딩되었습니다. 치료 후에는 페놀-클로로포름 추출 프로토콜을 사용하여 총 RNA를 분리하였습니다. 간단히 각 웰당 1mL의 시약을 첨가한 후 클로로포름 추출, 이소프로판올 침전, 75% 에탄올로 세척했습니다. RNA 펠릿은 공기 건조되어 RNase 없는 물에 녹였습니다. RNA 농도와 순도는 분광광도측정법으로 측정되었습니다. cDNA 합성을 위해 제조사 프로토콜에 따라 상업용 역전사 키트를 사용해 총 RNA 1 μg를 역전사했으며, 여기에는 게놈 DNA 제거와 무작위 헥사머 프라이밍이 포함되었습니다. 정량적 실시간 PCR은 SYBR Green 화학을 사용한 실시간 PCR 시스템에서 다음과 같은 조건 하에 수행되었습니다: 95°C에서 초기 변성은 30초, 95°C에서 5초, 60°C에서 30초간 40주기. 프라이머 서열은 Primer-BLAST(NCBI)를 사용해 설계되었으며 상업 공급업체가 합성했습니다: (1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACACTTATTTAT-3′; (2) β-액틴(내부 통제): F 5′-TGTCACCAACTGAGGACGATA-3′, R 5′-GGGGTGTGTGAGTCTCAAA-3′. 상대 발현 수준은 2^-ΔΔCT 방법으로 계산되었으며, 증폭 특이성은 단일 융해 곡선 피크로 확인되었습니다.

5. 서부 얼룩

H9C2 세포에서 단백질은 방사면역침전법(RIPA) 버퍼(6웰 플레이트 웰당 200 μL)와 얼음 위에 프로테아제 억제제 혼합물을 보충하여 추출하였습니다. 단백질 농도는 비신코닉산(BCA) 분석법으로 측정하였으며, 각 레인당 동일한 양(20-30 μg)의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에 적재하여 전기영동 분리를 수행했습니다. 단백질은 4°C에서 100V 습식 전달 시스템을 사용해 90분간 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막에 전달되었습니다. 막은 TBST에서 1시간 동안 상온에서 1시간 동안 준비한 5% 무지방 우유로 차단한 후, 4°C에서 Klotho(1:500), 인산-p65(1:500), p65(1:500), 인산-IκBα(1:500), IκBα(1:500), β-액틴(1:1000)에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 배양했습니다. TBST로 세 차례 세척한 후, 막을 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합 2차 항체(1:1000)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 단백질 밴드는 향상된 화학발광 검출 시스템을 사용해 시각화되었고, 동일한 임계값 설정을 사용한 ImageJ 소프트웨어로 신호 강도를 정량화하였습니다.

6. MTT 분석법

H9C2 세포는 100 μL 완전 배지에 웰당 2× 10³ 밀도의 96웰 플레이트에 시딩되어 하룻밤 배양하여 부착을 허용했습니다. 각 웰에 10 μL 용량의 MTT 용액(5 mg/mL in PBS)을 첨가하고 37°C에서 5% CO₂ 가습 조건에서 4시간 배큐했습니다. 배큐 후 상원액을 조심스럽게 제거하고, 100 μL 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 포마잔 결정체를 용해한 뒤, 상온에서 10분간 부드럽게 흔들며 배양했습니다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 사용해 490nm 거리에서 흡광도를 측정했습니다. 예상된 시각적 결과는 DMSO 첨가 전 생존 세포에 보라색 포르마잔 결정이 나타나고, 용해 후에는 균일한 보라색 용액이 나타나는 것이었습니다.

7. 유세포분석(플로우 사이토메트리)

세포는 처리 후 24시간 후 트립신화로 채취되었고, 1,500 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리하여 채취했습니다. 세포 펠릿은 100 μL 1× 결합 버퍼(10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂, pH 7.4)에 재현탁되었습니다. Annexin V-APC와 프로피듐 요오다이드(PI)를 1:2 비율로 혼합하여 15 μL 염색액을 준비하고, 이를 세포 현탁액에 첨가하였습니다. 혼합물은 어두운 실온에서 10분간 배양되었습니다. 배양 후에는 동일한 결합 버퍼 400 μL을 추가하고, 즉시 유세포계를 이용해 샘플을 분석했습니다. 샘플당 총 10,000건의 사건이 수집되었습니다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 사용해 분석되었습니다. 세포는 먼저 전방산란(FSC)과 측면산란(SSC)을 기준으로 폐기물을 배제했으며, 이어서 생존 가능한 세포(Annexin V-/PI-), 초기 세포자멸사 세포(Annexin V+/PI-), 후기 세포자사멸/괴사 세포(Annexin V+/PI+)를 구분하기 위해 Annexin V와 PI의 사분면 게이팅을 시행했습니다. Annexin V-양성/PI-음성 염색은 조기 세포자멸사를 의미했고, Annexin V/PI 이중 양성 염색은 후기 세포자멸사 또는 괴사를 나타냈습니다.

8. 면역형광

H9C2 세포는 6웰 플레이트의 멸균 유리 커버슬립에 1× 10⁵ 셀 밀도로 시딩한 후 처리를 받았습니다. 세포는 상온에서 4% 파라포름알데히드로 15분간 고정되고, PBS에서 0.1% Triton X-100으로 10분간 투과되었으며, 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 PBS에서 30분간 상온에서 차단하였다. 코버슬립은 TNF-α(1:200), IL-1β(1:200), IL-6(1:100)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하였다. PBS에서 세 차례 세척한 후, 세포는 피코에리트린(PE) 표지된 2차 항체(1:500)와 함께 실온에서 어두운 환경에서 1시간 동안 배양하였습니다. 핵은 5분간 DAPI로 카운터 염색을 했습니다. 커버슬립은 안티페이드 마운팅 매체가 장착된 유리 슬라이드에 장착되었고, 형광 신호는 형광 현미경으로 시각화되었습니다. 이미지는 ImageJ(버전 1.54)로 분석되었습니다. 빨간색 형광은 사이토카인 발현을, 파란색 형광은 핵을 나타냅니다.

9. 통계 분석

모든 데이터는 SPSS 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 결과는 최소 세 개의 독립 실험에서 표준편차(SD)± 평균 산출로 표현됩니다. 다중 그룹 비교의 경우, 분산 일방향 분석(ANOVA)과 Tukey의 사후 검정을 적용하였습니다. P 값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

클로토 과발현은 세포 생존율을 높이고 NF-κB 매개 염증 손상을 완화합니다

유전자 전달의 효율성을 확인하기 위해 클로토 발현을 mRNA와 단백질 수준 모두에서 정량화하였다. 클로토 과발현 세포는 저산소/재산소화(H/R) 및 음성 대조군(p < 0.05; 그림 2A, B). 기능적으로 Klotho 과발현은 H/R 손상 후 세포 생존력을 유의하게 높였습니다 (p < 0.05; 그림 2C) 그리고 유세포검사(p < 0.01; 그림 2D). 또한 면역형광 염색 결과, H/R은 TNF-α, IL-1β, IL-6를 강하게...

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토론

본 연구에서는 저산소증/재산소화(H/R) 손상에 노출된 심근세포에서 클로토의 보호 역할을 조사했으며, 클로토 과발현이 세포 생존력을 유의미하게 향상시키고 세포자살 세포 사멸을 감소시키며 염증성 사이토카인 발현을 억제하는 것으로 나타났습니다. 이러한 효과는 p65의 인산화 감소와 IκBα의 인산화 증가를 동반하여 NF-κB 신호 억제가 보호 표현형에 기여함을 시사합니다. PDTC에 의한 NF-κB의 약리학적 억제는 Klotho 과발현과 유사한 효과를 냈으며, LPS를 자극하면 Klotho의 이점을 부분적으로 역전시켜 Klotho와 NF-κB 조절 간의 기전적 연관성을 더욱 뒷받침하였다. 이 결과는 이전 다른 조직보고서 21, 22, 23, 24...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% 파라포름알데히드바이오샤프XG1050
Annexin V APC/PI 염색 솔루션일러브사이언스E-CK-A217
cDNA 합성 키트치아겐205410
DAPI 솔루션바이오프록스1155MG010
둘벡코 s 개조 이글 미디엄 (DMEM)하이클론SH30243.01B
ECL 탐지 시약 키트메이룬비오MA0186-1
전기영동 전원 공급 장치(POWER PAC 200)바이오-래드파워팩 200
태아 소 혈청 (FBS)비바셀C04001-500, C04002-500
유량 세포계 (갈리오스)벡먼 쿨터갈리오스
형광 현미경 (BK6000)충칭 옵텍BK6000
포마잔 용제솔라비오M1020
HRP 접합 염소 항토끼 IgG 항체베틸A120-101P
LPS (NF-&카파; B 경로 원제사)시그마-올드리치L2630
마이크로플레이트 리더기 (모델 K3)열학K3
모듈식 인큐베이터 챔버(저산소 챔버)빌럽스-로텐베리MIC-101
MTT 솔루션케이맨21795
PDTC (NF-κ B 경로 억제제)시그마-올드리치P8765
PE-결합 염소 항토끼 IgG 항체바이오스bs-0295G-PE
폴리브렌 (헥사디메트린 브로마이드)인비트로젠X2351
PVDF 멤브레인머크ISEQ00010
토끼 안티-쥐 IL-1&베타; 항체바이오비트오르브378927
토끼 항쥐 IL-6 항체젠 바이오384702
래빗 안티랫 Iκ Bα 항체바이오비트오르브223182
토끼 항쥐 클로토 항체바이오비트오르브333711
토끼 항쥐 p65 항체바이오비트오르브229138
래빗 안티-랫 인산-Iκ Bα 항체바이오비트오르브223035
래빗 안티-랫 인산-NF-&카파; B p65 항체바이오비트오르브304662
래빗 안티-래트 TNF-&알파; 항체바이오비트오르브106548
토끼 항쥐 및 베타-액틴 항체화비오ET1702
실시간 정량 PCR 시스템 (LightCycler 96)로슈라이트 사이클러96
RIPA 용해 버퍼므레다MO52447
SDS-PAGE 젤 준비 키트일러브사이언스E-IR-R305
트리졸 시약 키트라이프 테크놀로지15596-018

참고문헌

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