방법 논문

고밀도 지단백질 특이적 인지질 유출 분석

DOI:

10.3791/68947

⸱

2025년 9월 30일

 ,  , 
1Lipoprotein Metabolism Laboratory, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본원에서, 우리는 전체 인간 혈장 또는 혈청에 존재하는 고밀도 지단백질(HDL)에 의해 지질 공여자 입자로부터 특이적으로 제거된 형광 인지질의 양을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 HDL 기능의 이 지표가 발생 심혈관 질환을 예측한다는 것을 보여주었습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고밀도 지단백(HDL)-콜레스테롤(HDL-C)의 혈장 수치는 현재 심혈관 질환(CVD) 위험의 임상 평가를 위한 핵심 지표입니다. 동맥벽의 세포 및 세포외 침착물에서 플라크 지질의 HDL 매개 제거는 CVD 위험과의 역관계를 설명할 수 있는 HDL의 여러 항죽상경화 기능 중 하나입니다. 시험관 내 세포 콜레스테롤의 HDL 매개 제거는 최근 HDL-C보다 CVD 위험을 훨씬 더 잘 예측하는 것으로 입증되었습니다.

HDL은 서로 다른 기능을 수행하는 이질적인 입자 집단으로 구성됩니다. 죽상동맥경화성 플라크 지질의 제거에 관여하는 HDL 입자는 입자에서 해리된 다음 플라크 지질을 제거하는 교환 가능한 아포지단백, 주로 아포지단백 A-I를 포함합니다. 초기 HDL은 HDL 유래 교환 가능한 아포지단백에 의해 ABCA1 생성 세포 원형질막 도메인에서 인지질과 콜레스테롤을 모두 가용화 및 제거하여 형성됩니다. 이 과정은 죽상동맥경화반의 예방과 퇴행 모두에 중요한 역할을 합니다.

여기서, 우리는 이전에 사건 CVD 위험을 예측할 수 있음을 보여준 무세포 HDL 특이적 인지질 유출(HDL-SPE) 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 분석은 지질 공여자 입자에서 교환되지 않는 형광 인지질의 HDL 아포지단백 매개 제거를 구체적으로 측정합니다. 우리의 환자-대조군 임상 연구는 HDL-SPE 분석이 종종 방사성 콜레스테롤을 사용하는 힘들고 기술적으로 복잡한 분석인 "골드 스탠다드" 세포 기반 콜레스테롤 유출 용량 분석과 동일하거나 잠재적으로 더 나은 성능을 발휘한다는 것을 확인했습니다.

이 프로토콜의 목표는 기초 및 임상 연구자 모두가 간단하고 표준화된 무세포 고처리량 분석을 사용하여 지질 동원에서 HDL의 기능을 평가할 수 있도록 하는 것입니다. 이 분석은 기초 연구자가 HDL 매개 지질 유출의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 얻고 HDL 기능을 향상시키는 새로운 치료제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. HDL-SPE는 CVD 위험 평가를 위한 임상 실험실 진단 분석으로도 사용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고밀도 지단백질 특이적 인지질 유출(HDL-SPE) 분석은 HDL 기능을 측정하고 생물 의학 연구 및 임상 진단 실험실에서 (i) 죽상동맥경화성 병변에서 HDL 매개 지질 제거의 기본 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 얻고, (ii) 임상 CVD 위험 평가를 개선하기 위한 새로운 플랫폼 역할을 하며, (iii) 심혈관 질환을 치료하기 위한 새로운 치료법을 개발합니다.

HDL-콜레스테롤(HDL-C)은 CVD 위험1의 중요한 결정 요인이지만 HDL-C 수치 상승(>80mg/dL)이 CVD 위험 증가와 관련이 있는 한 그 유용성이 손상됩니다 2,3,4,5. HDL-C 수치 상승은 동맥 플라크 지질을 제거하는 능력이 감소한 기능 장애 HDL의 축적을 나타낼 수 있습니다6.

세포 콜레스테롤 유출 능력(CEC) 분석은 HDL 기능을 측정하기 위해 개발된 최초의 시험관 내 분석이었습니다. 이 분석에서, 일반적으로 3H- 또는 형광 바디피콜레스테롤로 표지된 배양된 대식세포(마우스 또는 인간)를 apoB-고갈 혈장 또는 혈청과 함께 배양합니다. % 콜레스테롤 유출은 세포 및 배지 관련 형광/방사능의 양을 기준으로 계산됩니다 7,8,9. CEC 분석은 HDL-C7보다 CVD 발생을 더 잘 예측하는 것으로 나타났습니다. CEC 분석은 주로 세포 배양에 대한 요구 사항과 긴 기간(예: 일)으로 인해 일상적인 임상 진단 분석으로 전환할 수 없습니다. 또한, CEC 분석은 고유한 가변성(예: 다양한 유형의 세포, 라벨링 기술 및 HDL 조성을 변경하는 β-지단백질의 PEG 고갈)에 의해 제한됩니다10).

여러 연구 그룹은 HDL 기능에 대한 새로운 통찰력을 얻고 CVD 위험을 더 잘 평가하기 위한 임상 진단 분석으로 잠재적으로 변환하기 위한 도구로 사용하기 위해 무세포 HDL 콜레스테롤 유출 분석을 개발했습니다11,12. 이러한 유출 분석은 일반적으로 여러 단계를 포함하며 형광 콜레스테롤로 표지된 지질 공여자 입자를 사용하며, CEC 분석과 마찬가지로 혈장 HDL 콜레스테롤 유출을 측정하기 위해 β-지단백질을 고갈시키거나 또는 항-apoA-I 항체를 사용하여 apoA-I 함유 입자를 포획해야 합니다. 이러한 대체 분석이 CVD 위험과 다양한 정도로 관련이 있는 것으로 검증되었지만 현재까지 apoA-I 환율을 평가하는13개만이 CVD 위험 발생을 예측하는 것으로 나타났습니다14. 흥미롭게도, 혈장 HDL 온팎에서 apoA-I의 교환 동역학은 CEC15와 독립적으로 연관되어 있으며 급성 관상동맥 증후군 환자에서 현저하게 감소하는 것으로 나타났습니다16. 또한, 여러 HDL 교환성 아포지단백이 시험관 내에서 ABCA1-발현 세포로부터 콜레스테롤과 인지질을 모두 매개하는 것으로 나타났습니다 17.

우리는 HDL 기능을 평가하기 위한 대체 접근 방식을 개발했습니다18. 여기에 설명된 간단하고 신속하며 신뢰할 수 있는 분석에는 전체 인간(또는 동물) 혈장 또는 혈청 샘플(신선 또는 동결 해동)과 형광 지질 코팅 기증자 입자의 두 가지 구성 요소만 필요합니다. 이 분석은 전체 혈장/혈청에서 apoA-I 및 기타 HDL 관련 교환 가능한 아포지단백이 지질 코팅 공여자입자 18 에서 교환되지 않는 헤드 그룹 태그가 지정된 형광 포스파티딜에탄올아민(PE)을 제거하는 능력을 측정합니다(그림 1).

이 분석의 기증자 입자는 콜레스테롤, 인지질 포스파티딜콜린(PC) 및 형광 PE로 코팅된 규산칼슘 수화물 결정(CSH)으로 구성됩니다. HDL 입자에서 방출된 교환 가능한 HDL 관련 아포지단백질(대부분 apoA-I)은 기증자 입자에 결합한 다음 형광 PE를 포함한 기증자 입자 지질과 함께 해리됩니다. 이러한 방식으로, 전체 혈장/혈청에 존재하는 다른 지단백질이 아닌 HDL은 기증자 입자로부터 형광 PE를 특이적으로 획득합니다18,19. 전체 혈장/혈청을 형광 지질 코팅 규산칼슘 수화물(LC-CSH) 공여자 입자 및 식염수와 함께 37°C에서 1시간 동안 흔들어 배양합니다. LC-CSH는 물 밀도의 약 2배이기 때문에 기증자 입자는 저속 원심분리를 통해 혈장에서 쉽게 분리됩니다.

임상 연구에서 측정된 % PE 유출은 일반적으로 임상 샘플의 반응 혼합물의 상청액에서 HDL에 의해 획득된 PE 형광 값으로 참조 대조군 인간 혈장에서 HDL에 의해 얻은 값으로 나누어 정규화됩니다. 시약 준비의 변화를 보정하기 위해 기준 혈장에 대한 정규화가 수행됩니다. 연구 응용 분야의 경우 % PE 유출은 상청액 PE 형광을 총 형광(상청액 PE 형광 + LC-CSH 형광)으로 나눈 값을 계산하여 결정할 수 있습니다. 상청액 형광 측정 값을 스프레드시트 파일의 템플릿에 붙여넣어 %PE 유출량을 계산합니다(삼중 측정의 경우 보충 표 1, 중복 측정의 경우 보충 표 2). 스프레드시트에서 이러한 계산을 수행하기 위한 지침은 보충 파일(보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3, 보충 파일 4, 보충 파일 5, 보충 파일 6, 보충 파일 7 및 보충 파일 8)으로 제공되며 계산 예는 보충 표 3으로 제공됩니다.

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그림 1: HDL-SPE 분석. HDL 특이적 인지질 유출은 96웰 플레이트에서 분석됩니다. 비교환성 리사미네로다민 표지 포스파티딜에탄올아민(LRh-PE; 적색 막층)을 포함하여 지질(LC-CSH)으로 코팅된 식염수, 규산칼슘 수화물 결정(회색) 및 최대 30개의 전체 혈장/혈청 샘플(노란색, 3회)을 96웰 플레이트에 로드합니다. 열혼합기에서 37°C에서 1시간 동안 혼합한 후, 플레이트를 잠시 원심분리하여 LC-CSH 공여체 입자를 펠릿화합니다. LRh-PE로 특이적으로 표지된 HDL을 포함하는 상청액의 분취량을 세제(Lh-Rh-PE를 가용화하기 위해)와 식염수가 들어 있는 검은색 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 형광계로 PE 형광을 측정합니다. 식염수(음성 대조군; NC), 배경 보정을 위해 및 풀링된 건강한 인간 혈장(양성 대조군; PC)는 플레이트 정규화를 위해 마지막 웰 세트에서 샘플 혈장/혈청 대신 로드됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

채혈은 2013년에 개정된 1975년 헬싱키 선언(https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/)의 규칙에 따라 수행되며 정보에 입각한 동의에 관한 제도적 지침을 준수해야 합니다.

1. 형광 인지질 표지 공여자 지질 입자의 제조

  1. 지질막의 형성
    주의 : 화학 후드에 원액을 준비하고 분배하십시오. 실험실 가운, 장갑, 보호 안경을 착용하십시오. 클로로포름 용액은 유기 화학 폐기물에, Triton X-100 용액(플라즈마 제외)은 화학 폐기물에, 플라즈마 함유 용액은 생물학적 위험/의료 폐기물에 폐기하십시오.
    1. 공급업체로부터 클로로포름 형태의 지질 원액을 구입하거나 실험실에서 만듭니다.
      25mg/mL: 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC):
      10 mg/mL: 콜레스테롤
      1mg/mL: 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리사미네로다민 B 설포닐) [LRh-PE]
      알림: 나사 상단 밀폐 유리관을 사용하십시오. 테프론 테이프로 캡을 밀봉합니다.
      -20 °C에서보관하십시오.
    2. 필요한 LC-CSH의 양을 결정하고 적절한 수의 유리관을 준비합니다.
      화학 흄 후드에서 각 10mm 150mm 붕규산 유리관에 다음을 추가합니다: DMPC 원액 472μL(17.7μmol, 11.8mg), 콜레스테롤 원액 339μL(8.8μmol, 3.39mg) 및 LRh-PE 305μL(200nmol, 0.305mg). 소용돌이가 잠시 섞입니다.
    3. 화학 흄 후드에서 유리관의 지질 혼합물을 N2 의 부드러운 흐름 하에서 1시간 동안 건조시켜 튜브 바닥에 건조 지질 막을 형성합니다.
      알림: N2 의 흐름은 유체 표면에 약간의 잔물결을 일으켜야 합니다.
    4. 며칠 또는 몇 주에 걸쳐 여러 개의 96웰 플레이트가 필요한 분석의 경우, 튜브에 분취할 수 있는 LC-CSH를 대량으로 만들거나 -20°C 또는 -80°C에 보관하는 즉시 사용 가능한 LC-CSH 플레이트를 만드는 데 사용합니다. 아래 2.2.1-2.2.2단계를 참조하십시오.
  2. 형광 지질 필름으로 규산칼슘 수화물 코팅
    주의 : 규산칼슘 수화물을 취급하는 동안 실험실 가운, 장갑, 안면 마스크 및 보호 안경을 착용하십시오.
    1. 건조된 지질이 들어 있는 유리관에 계량 용지 콘을 삽입합니다. 계량 용지 콘을 사용하여 80mg의 규산칼슘 수화물(CSH) 분말(지질 제거 시약)을 유리관에 첨가하여 분말을 튜브 바닥으로 향하게 합니다. 건조된 지질과 CSH가 들어 있는 유리관에 생리 식염수 2mL를 즉시 첨가합니다. 튜브 상단을 파라필름으로 덮습니다.
    2. 유리관 바닥에서 지질의 대부분을 제거하기 위해 손으로 소용돌이합니다. 소용돌이 상단에 부착된 스티로폼 플랫폼에 만든 구멍에 유리관을 삽입합니다. 강화 테이프를 사용하여 튜브를 와류 플랫폼에 고정합니다.
      알림: 혼합물이 유리관의 절반 정도까지 올라갈 수 있도록 와류 속도를 미리 조정하십시오.
    3. 10분 동안 소용돌이. 소용돌이 후 튜브 벽에 지질이 남아 있지 않은지 확인합니다. 필요한 경우 지질이 남지 않을 때까지 필요에 따라 수동으로 소용돌이치십시오. 1mL 피펫을 사용하여 유리관의 총 부피를 15mL 원추형 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 3mL의 추가 식염수로 유리관의 벽을 세척하고 동일한 15mL 원뿔형 플라스틱 튜브로 옮깁니다.
  3. 세척 LC-CSH
    1. 지질 코팅 CSH(LC-CSH)가 들어 있는 15mL 플라스틱 튜브를 4°C에서 935×g에서 2분 동안 원심분리하여 기증자 입자를 펠릿화합니다. 길고 매우 미세한 피펫 팁을 사용하여 진공 흡인으로 상청액을 조심스럽게 제거합니다.
    2. 상청액의 상단에서 시작하여 튜브 측면을 따라 피펫 팁을 천천히 미끄러지듯 움직이면서 상청액이 제거될 때 튜브를 기울입니다. 펠릿에서 LC-CSH가 우발적으로 흡인되는 것을 방지하기 위해 소량(≈ 200μL)의 식염수를 남겨 둡니다. 총 부피가 5mL가 될 때까지 충분한 식염수를 추가합니다.
    3. 1.3.1-1.3.2단계를 네 번 반복합니다. 최종 세척 후 최종 부피가 2.5mL가 될 때까지 충분한 식염수를 추가합니다.
      참고: LC-CSH 제제에서 4°C에서 2주 동안 또는 -20°C 또는 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
  4. 즉시 사용 가능한 LC-CSH 플레이트를 위한 대규모 배치 준비
    참고: 이 접근 방식을 사용하면 동일한 LC-CSH 배치에서 균일한 시약 구성으로 측정 플레이트를 준비할 수 있으므로 플레이트 간 측정 변동성을 최소화할 수 있습니다.
    1. 위의 1.1.1-1.3.2단계에 설명된 대로 12개의 LC-CSH 튜브(2.5mL x 12튜브)를 준비합니다. 12개의 튜브 전체를 50mL 원추형 플라스틱 튜브(총 부피 30mL)에 결합합니다. LC-CSH 입자의 균일한 분포를 얻기 위해 조심스럽게 소용돌이를 일으키고 6mL를 15mL 플라스틱 원추형 튜브에 분배합니다. 4회 반복하여 각각 6mL의 LC-CSH가 들어 있는 총 5개의 플라스틱 원뿔형 튜브를 생성합니다.
    2. 각 튜브는 5개의 즉시 사용 가능한 LC-CSH 플레이트(단일 플레이트의 96개 웰 모두에 대해 웰당 50μL 포함)를 만들기에 충분한 LC-CSH를 제공합니다. 아래 2.2.1-2.2.2단계를 참조하십시오.

2. 형광 인지질 표지 기증자 지질 입자(LC-CSH)와 혈장/혈청 샘플의 배양

  1. 즉시 사용할 수 있는 개별 플레이트.
    1. 샘플 세트를 분석하는 데 필요한 만큼의 웰을 사용하여 0.3mL 96웰 플레이트의 각 웰에 75μL의 식염수를 피펫팅합니다. 식염수 100μL를 음성 대조군(NC) 웰에 3회 피펫팅하고 식염수 75μL를 중복 양성 대조군(PC) 웰에 피펫팅합니다(그림 2). 멀티웰 피펫을 사용하여 분배합니다.
    2. LC-CSH를 분배하기 전에 15mL 플라스틱 스톡 튜브를 각각 10초씩 3회 소용돌이치게 합니다. 단일 웰 피펫을 사용하여 식염수 함유 웰의 오른쪽을 따라 50μL의 LC-CSH를 분배합니다. 각각 50μL를 3개의 웰에만 빠르게 분배합니다. LC-CSH를 다음 3개의 웰에 분배하기 전에 와류 프로토콜을 반복합니다.
      참고: 이 절차는 자발적으로 침전되는 무거운 LC-CSH가 균일하게 현탁되어 각 웰에 동일한 양을 분배할 수 있도록 하는 데 중요합니다.
    3. 96웰 플레이트를 180° 회전하여 웰의 왼쪽이 오른쪽이 되도록 합니다. 웰의 오른쪽을 따라 25μL의 혈장/혈청 샘플을 피펫팅합니다(그림 2). PC 웰의 경우 25μL의 참조 표준 인간 정상지혈증 혈장/혈청을 추가합니다. 분석을 위한 웰당 총 부피는 150μL입니다.
      참고: 이 절차는 혈장/혈청이 웰의 반대쪽을 따라 분배되기 때문에 LC-CSH와 혈장의 교차 오염을 방지합니다.
    4. 접착 필름으로 플레이트를 단단히 밀봉하십시오. 밀봉된 96웰 플레이트를 열혼합기에서 1200rpm에서 37°C에서 1시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 배양이 완료되면 열믹서에서 플레이트를 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다. 플레이트를 4°C에서 2분 동안 원심분리하여 935g 에서 기증자 입자를 펠릿화합니다.
  2. 즉시 사용 가능한 LC-CSH 플레이트
    1. 사용하려면 냉동된 Ready-To-Use 플레이트(플레이트 준비를 위해 단계 1.4.1-1.4.2 참조)를 차가운 곳(4°C에서 10°C)에서 2시간(또는 필요한 경우 하룻밤) 동안 해동합니다. 4°C에서 935×g에서 2분 동안 원심분리하여 모든 물질(125μL)을 함께 수집합니다. 우물의 내용물이 튀지 않도록 접착 필름을 조심스럽게 제거하십시오.
    2. 25μL의 혈장/혈청 샘플, 식염수 및 참조 인간 혈장을 얼음 위에 Ready-To-Use 플레이트의 적절한 웰(그림 1)에 세 번씩 분배하고 접착 필름으로 밀봉합니다. 밀봉된 96-웰을 열혼합기에서 1200rpm의 37°C에서 1시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 열믹서에서 접시를 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다. 플레이트를 4°C에서 2분 동안 원심분리합니다(전달 반응을 중지하기 위해) 935 × g(기증자 입자를 펠릿화하기 위해).

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그림 2: 교차 오염 없이 웰에 시약을 분배합니다. 혈장/혈청 및 LC-CSH를 웰의 반대쪽 벽에 분배합니다. LC-CSH를 처음 디스펜싱한 후 플레이트를 180° 회전하면 교차 오염이 최소화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 혈장/혈청 HDL에 대한 형광 인지질 유출 측정

  1. 블랙 플레이트로 옮기고 형광 측정
    1. LC-CSH 펠릿을 방해하지 않도록 접착 필름을 조심스럽게 제거합니다.
      알림: 펠릿 파손이 발생하면 다시 원심분리하십시오.
    2. 형광 측정을 위해 96웰 반응 플레이트에서 96웰 검정색 폴리스티렌 평평한 바닥 플레이트의 웰로 50μL의 상청액을 옮깁니다. 멀티웰 피펫을 사용하십시오.
      참고: LC-CSH를 흡인하지 마십시오. 이런 일이 발생하면 웰에 다시 주입하고 다시 원심분리합니다.
    3. 물통에 생리 식염수를 채우십시오. 멀티웰 피펫을 사용하여 각 웰에 식염수 50μL를 추가합니다.
    4. 125mL 플라스틱 삼각 플라스크에 10mL의 10% Triton X-100 원액 10mL에 증류수를 90mL 첨가하여 1% TX-100을 준비합니다. 저장소에 1% Triton-X 100을 채웁니다.
    5. 실온에서 100μL의 1% Triton X-100을 각 웰에 첨가하고 멀티웰 피펫을 사용하여 위아래로 2-3회 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 기포가 생기지 않도록 하십시오. 3mL 이송 피펫의 공기로 기포를 터뜨립니다.
    6. 형광계(540nm 여기/600nm 방출)로 Lissaminerhodamine 형광을 측정합니다.
  2. %PE 유출량 계산
    1. PE 유출 계산
      1. %PE 유출 = ([총 상청액 혈장 또는 혈청 FLU - 상청액 NC FLU]/총 FLU)) × 100
        FLU = 형광 단위; NC = 음성 대조군. 웰당 형광을 측정하는 데 150μL의 상청액 반응 혼합물 중 50μL만 사용되므로 다음과 같이 수정해야 합니다.
      2. 총 상청액 FLU/웰 = 측정된 50 μL의 FLU(검은색 플레이트) × 3
      3. 150 μL 반응 혼합물/웰당 총 FLU = 50 μL의 LC-CSH에서 방출되는 총 FLU.
        참고: LC-CSH 형광은 아래 설명된 대로 계산됩니다(단계 4.2.5).
    2. 정규화된 %PE 유출 계산
      1. 정규화된 %PE 유출을 사용하여 서로 다른 조건(즉, 서로 다른 날짜에 수행된 실험, 배치 차이)에서 수행된 분석 간의 변동을 보정합니다.
      2. 이 공식을 사용하여 정규화된 %PE 유출을 계산합니다.
        정규화된 %PE 유출 = 샘플 상청액 %PE 유출 값(FLU)/양성 참조 대조군 상청액 %PE 유출 FLU 값.
      3. 정상적인 지질 프로필을 가진 건강한 기증자로부터 동일한 풀링된 인간 혈장을 참조 대조군으로 사용합니다. 총 상청액 FLU/well은 샘플과 참조 항목 모두에 대해 동일하므로 계산할 필요가 없습니다.
      4. 삼중 샘플의 경우 3.1.6단계에서 얻은 원시 데이터를 스프레드시트에 붙여넣습니다(보충 표 1). 중복 샘플의 경우 3.1.6단계에서 얻은 원시 데이터를 스프레드시트에 붙여넣습니다(보충 표 2).

4. LC-CSH 표준 곡선

참고: LC-CSH 표준 곡선은 웰당 LC-CSH의 분취량에 존재하는 PE 형광 신호의 양을 계산하는 데 사용됩니다. 일반적으로 50μL의 LC-CSH/웰이 사용됩니다. 이 값은 반응 혼합물에 존재하는 총 FLU(단계 3.2.1 참조)로 정규화된 샘플에서 HDL로의 %PE 유출을 계산하는 데 사용할 수 있습니다.

%PE 유출량 = ((상청액 샘플 형광 단위[FLU] - 상청액 식염수 FLU)/(총 LC-CSH FLU)) x 100.

  1. LC-CSH의 연속 희석
    1. 스톡 LC-CSH의 10배 및 100배 희석액을 준비합니다(1.1.1-1.3.3단계에서 준비됨).
      10배 희석: LC-CSH 100 μL + 1% Triton X-100 900 μL
      100배 희석: 10배 희석 LC-CSH 100 μL + 1% Triton X-100 900 μL
    2. 10배 및 100배 희석된 LC-CSH의 3회 샘플을 표준 곡선을 위해 96웰 배양 플레이트에 분배합니다( 그림 3 참조).
    3. LC-CSH가 포함된 웰에 충분한 부피의 1% Triton X-100을 추가하여 최종 부피가 200μL가 됩니다( 표 1 참조).
  2. 형광 측정을 위한 LC-CSH의 가용화
    1. 플레이트를 접착 필름으로 밀봉하고 1200rpm에서 흔들면서 24°C에서 1시간 동안 배양합니다. 935 × g에서 4°C에서 2분 동안 원심분리 플레이트. 접착 필름을 조심스럽게 제거합니다.
    2. 멀티웰 피펫을 사용하여 위아래로 2-3회 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다. 멀티웰 피펫을 사용하여 형광 측정을 위해 웰당 100μL의 LC-CSH를 96웰 검정색 폴리스티렌 평평한 바닥 플레이트로 옮깁니다.
    3. 멀티웰 피펫을 사용하여 실온에서 1% Triton-X의 웰당 100μL를 각 웰에 추가합니다. 위아래로 2-3회 피펫팅하여 혼합합니다.
    4. 형광계로 형광을 측정합니다(540nm 여기/600nm 방출).
    5. 형광계를 사용하여 측정한 형광 값을 보충 파일 3에 설명된 대로 보충 표 1의 선형 회귀 분석 템플릿에 붙여넣습니다. 표준 곡선 측정 플레이트에서 LC-CSH의 최종 농도는 표 2에 나와 있습니다.

figure-protocol-2
그림 3: LC-CSH 표준 곡선용 플레이트. 연속적으로 희석된 LRh-PE 표지-LC-CSH는 그림과 같이 96웰 플레이트에 분배됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

최종 농축10배 희석100배 희석1% 트리톤 X-100합계
LC-CSHLC-CSHLC-CSH세정제음량
(μL/웰)(μL)(μL)(μL)(μL)
101000100200
5500150200
2.5250175200
10100100200
0.5050150200
0.25025175200

표 1: LC-CSH 표준 곡선에 대한 배양 플레이트의 웰에 추가된 시약의 부피.

가용화생리합계추가측정
LC-CSH음량음량LC-CSHLC-CSH
(μL)(μL)(μL)(μL/웰)(μL/웰)
100100200105
10010020052.5
1001002002.51
10010020010.5
1001002000.50.25
1001002000.250.125

표 2: LC-CSH 표준 곡선에 대한 측정 플레이트의 웰에 추가된 시약의 부피.

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결과

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분석 방법

위에서 언급한 바와 같이 HDL-SPE 샘플 분석은 아래에 설명된 대로 다양한 응용 분야에 맞게 수정할 수 있습니다. 연구 샘플로 연구를 수행하기 전에 필요한 기술을 익히기 위해 먼저 LC-CSH 표준 곡선 검증, 재현성 및 혈장 농도 분석을 수행합니다. 먼저 LC-CSH 표준 곡선 분석을 수행하여 LC-CSH 제제의 품질을 평가합니다. 다음으로 재현성 분석을 수행합니다. 마지막으로 선형성을 확인하기 위해 혈장 용량 분석을 수행해야 합니다. 재현성 분석에서 CV% ≤ 5가 확립되면 임상 또는 연구를 수행할 수 있습니다. LC-CSH 표준 곡선 분석을 마스터하는 것은 % 형광 PE 유출 분석(LC-CSH PE 형광으로 정규화된 샘플 PE 형광)을 수행하는 데 유용한 준비이기도 합니다. 임상 분석, 특히 시간이 지남에 따라 여러 분석이 필요한 많은 샘플 수를 포함하는 경우, 샘플 P...

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토론

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HDL-C는 심혈관 질환(CVD) 위험을 임상적으로 평가하는 데 사용되는 핵심 결정 요인이므로 지질 저하 또는 기타 잠재적인 예방 유형 치료의 필요성을 평가합니다1. 시험관 내 세포 콜레스테롤 유출에서 HDL의 기능은 HDL-C보다 심혈관 질환 발생을 훨씬 더 잘 예측하는 것으로 나타났습니다7. 불행하게도 이 세포 분석은 분석을 수행하는 데 많은 시간이 소요되고 세포 배양이 필요하기 때문에 일상적인 진단 테스트를 위한 고처리량 임상 실험실 분석으로 전환할 수 없습니다. 그러나 세포 기반 CEC 분석은 연구 실험실에서 수행되는 연구에 여전히 유용합니다. 이 분석은 J774 세포(%CV < 4)를 사용하면 더 신뢰할 수 있으며 방사성 콜레스테롤9 대신 형광 콜레스테롤을 사용할 때 더 사용자 친화적입니다. 그러나, 세포 배양 유지 ...

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공개 사항

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특허: US20220178953A1; WO2020185598A1 (E.B.N., M.S., A.T.R.)

Masaki Sato는 Eiken Chemical Co., Ltd.에 근무하고 있습니다.

감사의 글

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이 연구는 NIH(National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램의 [부분적으로] 지원을 받았습니다. NIH 저자의 기여는 미국 정부의 저작물로 간주됩니다. 이 논문에 제시된 연구 결과와 결론은 저자의 것이며 반드시 NIH 또는 미국 보건복지부의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린아반티 리서치85034514:0 PC(DMPC) 클로로포름 솔루이톤
1,2-디올레올-sn-글리세로-3-인포에탄올라민-N-(리사민 로다민 B 설포닐) (암모늄 염)아반티 리서치810150-C클로로포름 용액 LRh-PE
접착 필름응용 생명시스템 4306311마이크로앰프 클리어 접착 필름  
베이 코퍼레이션 고밀도 테플론 테이프 1/2인치 x 520의료 검사 솔루션86732
붕규산 유리관 20mm 및 급성; 150 mm피셔 사이언티브14-961-33
원심분리기써모 사이언티픽소르발 X 프로 시리즈
클로로포름시그마-올드리치366927HPLC에 적합하며; 99.8%
콜레스테롤 가루시그마-올드리치C86673&베타;-하이드록시-5-콜레스틴, 5-콜레스텐-3&베타;-올
글라신 저울지콜-팔머그리고 nbsp; UX-01338-02LC-CSH 취급을 위해
인큐베이션 플레이트USA 사이언티픽 1402-9700TempPlate 96 웰 세미 스커트 0.2mL PCR 플레이트  
지질 제거제(LRA)수펠코13358-ULC-CSH
측정판그레이너 생물학 1 655076마이크로플레이트, PS, 96웰, F-바닥(굴뚝 웰), 검은색; 플루오트랙, 메드 바인딩
마이크로소프트 엑셀Microsoft 365 MSO 버전 2507
멀티플렉스 피펫 팁피셔 사이언티브50-550-206LC-CSH 세척 중 흡혈 상청액 검사를 위해
멀티라벨 플레이트 리더기퍼킨 엘머  1420-050빅터3 Wallac1420 멀티라벨 카운터
생리식염수품질 좋은 생물학 및 nbsp;114-055-101여러 용도로, nbsp;
파라필름콜-팔머HS23452소용돌이 현상 중 유리관 상판을 덮기 위해
폴리카보네이트 에를렌마이어 플라스크피셔 사이언티브10-041-810% 트라이톤-X 용액에 대해
모은 인혈장(혈액 유래) 리헤파린)이노베이티브 리서치 주식회사이프라우블리흐참조 혈장, 양성 대조군(PC)  
서팩트-앰프 X 100 써모 사이언티픽2831410% 트라이튼 X-100, 증류수로 10배 희석
열믹서에펜도르프538200002396웰 열차단 장착 열믹서 C
써모믹서 스마트블록에펜도르프530600000696웰 스마트블록
이송 피펫 (3 mL, Falcon)피셔 사이언티브13-711-9CM우물 위에서 거품을 제거할 때
보텍스 믹서다이거3030A상단에 유리관을 장착할 수 있는 고정 홀더

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Zhong, S., et al. Increased coronary heart disease in Japanese-American men with mutation in the cholesteryl ester transfer protein gene despite increased HDL levels. J Clin Invest. 97 (12), 2917-2923 (1996).
  3. Madsen, C. M., Varbo, A., Nordestgaard, B. G. Extreme high high-density lipoprotein cholesterol is paradoxically associated with high mortality in men and women: Two prospective cohort studies. Eur Heart J. 38 (32), 2478-2486 (2017).
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