Cell-ACDC를 사용한 다차원 현미경 데이터 분석

Summary

다차원 현미경 데이터를 정확하게 분석하려면 복잡한 워크플로가 필요합니다. 이 문서에서는 소프트웨어 Cell-ACDC를 사용하는 방법을 보여줍니다. 현미경 데이터의 세분화, 추적, 세포 혈통 분석 및 정량화를 위해 최첨단 AI 기반 모델을 활용합니다. 결정적으로, 모델 출력의 반자동 수정을 위한 혁신적인 프레임워크로 이러한 모델을 보완합니다.

Abstract

생명 과학을 위한 정량적 현미경의 최근 발전으로 실험 생물학자들은 전례 없는 해상도와 속도로 세포를 조사할 수 있게 되었습니다. 동시에 AI 혁명으로 인해 다차원 현미경 데이터에서 추출할 수 있는 정보의 양이 극적으로 증가했습니다. 그러나 생성되는 대량의 데이터와 최첨단 AI 모델의 복잡성으로 인해 이미지 분석 단계에서 심각한 병목 현상이 발생합니다. Cell-ACDC는 다차원 현미경 데이터에서 단일 세포의 분할, 추적 및 정량적 분석을 위한 강력한 엔드 투 엔드 솔루션을 제공하는 오픈 소스, 사용자 친화적 소프트웨어입니다. 이러한 모델을 구현하는 데 필요한 고급 기술 전문 지식이 부족할 수 있는 실험 생물학자를 위해 맞춤화되었습니다. 이 기사에서는 프레임워크를 활용하여 스마트 및 반자동 데이터 수정을 위한 다양한 도구와 함께 최신 모델을 쉽게 활용하여 얻을 수 있는 생물학적 정보의 양을 최대화하는 방법을 보여줍니다. Cell-ACDC는 다중 채널, 타임랩스 및 z-스택 현미경 데이터를 지원하며 각 유형의 데이터 차원에 맞는 전용 도구 세트를 제공합니다. 생물학자가 새로운 모델을 원활하게 통합하고 직접 액세스할 수 있는 모듈식 설계로 인해 Cell-ACDC는 현미경 데이터 분석을 위한 참조 도구 역할을 할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

Introduction

현미경 검사는 기초 과학 ^1,2,3에서 약물 발견 및 테스트 ^4,5에 이르기까지 연구 개발의 모든 단계에서 생물학적 발견을 가속화하는 데 기본이 되었으며, 세포 배양에서 조직 ^6,7, 오가노이드 ^8,9 및 전체 유기체에 이르기까지 놀라운 크기 범위에 걸쳐 생물학적 발견을 가속화하는 데 필수적입니다¹⁰. 그러나 이러한 고급 현미경 기술에는 두 가지 주요 단점이 있습니다. 첫째, 현미경 데이터는 본질적으로 크며¹¹, 특히 여러 차원(예: 시간 및 부피)을 획득할 때 더욱 그렇습니다. 둘째, 데이터에서 풍부한 생물학적 정보를 정확하게 추출하려면 종종 AI 모델을 기반으로 구축되는 고급 이미지 분석 프레임워크를 배포해야 합니다. 이 작업은 실험 생물학자에게는 어려울 수 있습니다. 따라서 데이터 처리, 처리 및 분석 단계는 과학 연구 속도를 크게 늦추고 새로운 발견의 가능성을 줄일 수 있습니다. 이상적으로는 생체 영상 분석을 위한 소프트웨어 프레임워크가 원시 현미경 파일 처리부터 분할 및 추적, 생물학적 통찰력을 추출하기 위한 다운스트림 분석에 이르기까지 분석의 모든 단계에서 사용자를 지원해야 합니다. 실제로 생체 이미지 분석을 위한 새로운 소프트웨어의 급속한 개발은 긍정적인 결과이지만 특정 분석 단계와 관련된 도구의 분산된 환경을 생성하거나 고급 프로그래밍 전문 지식이 필요한 부작용을 가져왔습니다. 이로 인해 사용자는 분석 워크플로를 조립하는 어려운 작업을 하게 되며, 종종 다음 도구와 호환되도록 데이터를 저장, 조작 및 변환하는 최적이 아닌 파이프라인이 발생합니다. 또한 생체 영상 분석의 개발은 단일 프로그래밍 언어로 표준화되지 않아 ImageJ¹² 또는 QuPath¹³ 플러그인(Java), Napari 플러그인(Python)¹⁴ 또는 Python 스크립트로 많은 도구가 개발되고 있습니다. 어떤 경우에는 이러한 까다로운 환경으로 인해 과학자들은 수동 분석을 선택하게 되는데, 이 프로세스는 느릴 뿐만 아니라 인간의 편견을 도입하고 재현성을 방해합니다.

이를 해결하기 위해 다차원 현미경 데이터를 분석하기 위해 Python으로 작성된 오픈 소스 GUI 기반 소프트웨어 도구 세트인 Cell-ACDC(Cell-Analysis of the Cell Division Cycle)¹⁵가 개발되었습니다. 결정적으로 Cell-ACDC는 두 세분화 모두에 대해 사전 구현되고 자동으로 설치된(필요한 경우) 다양한 최첨단 모델(Cellpose, StarDist, Segment Anything, YeaZ, YeastMate 등)을 제공합니다.16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,^27,28) 및 추적(Trackastra, Trackpy, Bayesian Tracker, Cell-ACDC 등19,29,30,31,32,33,34). 이러한 모델은 주석이 달린 데이터를 시각화하기 위한 프레임워크와 컴퓨터 지원 수동 수정으로 보완됩니다. 또한 동일한 프레임워크 내에서 Cell-ACDC는 이미지 분석 파이프라인의 각 단계에 대한 모듈을 제공하여 데이터 처리, 처리 및 저장을 자동으로 처리합니다(그림 1). 보다 구체적으로, 이를 통해 사용자는 인스턴스 분할(예를 들어, 단일 세포), 객체 추적, 세포 상태의 주석(예: 세포 주기 단계) 및 사용 가능한 형광 채널의 분석을 포함하여 다양한 형태의 정량화를 수행할 수 있습니다.

Cell-ACDC의 주요 강점 중 하나는 살아있는 세포 타임랩스 현미경 데이터 분석으로, 이는 시점 전반에 걸친 일관성이 필요하기 때문에 심각한 문제를 야기합니다. 단일 세포의 자동 분할 및 추적을 위한 수많은 모델이 존재하지만 복잡한 생물학적 문제를 해결하려면 수동 수정이 여전히 필수적입니다. Cell-ACDC는 수정 프로세스를 간소화하기 위해 특별히 설계된 도구 모음을 제공합니다. 지능형 알고리즘을 통합하여 수동 조정 횟수를 최소화합니다. 특히, 수정 사항은 모든 관련 미래 및 과거 프레임에 자동으로 전파되어 분석 전반에 걸쳐 데이터 무결성을 유지합니다. 모듈식 설계와 증가하는 사용자 기반을 고려할 때 이 소프트웨어의 지속적인 개발이 최우선 과제이며, 새로운 모델을 통합하고 커뮤니티의 진화하는 요구 사항을 해결하는 데 지속적인 노력을 기울이고 있습니다.

Protocol

참고: Cell-ACDC는 프로그래밍 배경 지식이 없는 사용자가 가능한 한 명확하고 직관적으로 사용할 수 있도록 설계되었습니다. 이는 주로 분석 워크플로를 더 작고 따라하기 쉬운 단계로 나누고 도구 설명과 정보 버튼을 통해 추가 정보를 제공함으로써 달성됩니다. Cell-ACDC는 실행 순서가 순차적이지 않은 경우가 많은 광범위한 단계를 다루기 때문에 의사 결정 차트가 그림 2에 나와 있습니다. 다음 가이드에서는 구체적인 예를 살펴보겠습니다. 10단계와 11단계는 3단계에서 다운로드한 제공된 데이터를 사용하는 대신 다른 데이터를 가져오는 데 사용할 수 있습니다.

1. Cell-ACDC 설치

참고: Cell-ACDC는 현재 PyPI(Python Package Index)를 통해 Python 패키지로 배포되며 pip install "cellacdc[torch]" 명령으로 설치할 수 있습니다.

1. Miniforge 설정
   1. Miniforge 웹사이트에서 설치 프로그램을 다운로드합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
   2. Miniforge 설치: Windows의 경우 다운로드한 설치 프로그램을 실행하고 지침을 따릅니다. Mac 또는 Linux의 경우 터미널을 열고 다음 명령을 실행합니다.
      컬 -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
   3. 설치가 완료되면 아래 지침에 따라 올바른 터미널을 엽니다.
      1. Windows의 경우 Win + S를 누르고 Miniforge Prompt를 입력한 다음 Enter 키를 누릅니다.
      2. Mac/Linux의 경우: 터미널 앱을 엽니다.
2. 가상 환경을 관리합니다.
   1. 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 가상 환경을 만듭니다. 그런 다음 Enter 키를 눌러 명령을 실행합니다.
      conda create -y -n acdc python=3.12
   2. 다음을 실행하여 환경을 활성화합니다.
      conda ACDC 활성화
3. 설치
   1. 환경이 활성 상태인 상태에서 다음 명령을 실행하여 Cell-ACDC를 설치합니다.
      pip install "cellacdc[토치]"
   2. 설치 후 Cell-ACDC -y 를 실행하여 소프트웨어가 설정을 완료하도록 합니다.

2. Cell-ACDC 실행

1. 올바른 터미널을 엽니다(1.1.3단계 참조).
2. 다음 명령을 실행하여 환경을 활성화합니다.
   conda ACDC 활성화
3. 다음 명령을 실행하여 Cell-ACDC를 시작합니다.
   셀-ACDC

3. 샘플 데이터 다운로드

참고: 예제 데이터는 Windows의 경우 "C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8"로, MacOS 및 Linux의 경우 "~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8"로 다운로드됩니다. 시작 안내서가 표시되지 않으면 기본 Cell-ACDC 시작 창(그림 1)의 메뉴 모음에서 도움말 > 시작 안내서(그림 3B)를 선택합니다.

1. 다운로드 및 타임랩스 예제로 테스트(그림 3B)를 선택합니다.
2. 다운로드가 완료될 때까지 기다리십시오.
3. 아니요를 클릭하여 GUI에 직접 데이터 로드를 중지합니다.

4. 데이터 준비 모듈

참고: 세분화 전에 데이터를 정렬할 수 있으며 관심 영역(ROI) 을 선택할 수 있습니다. 이러한 단계는 선택 사항이지만 시간이 지남에 따라 시야가 변위되거나 데이터의 일부만 관심 있는 경우 각각 유용합니다.

1. 기본 창에서 Launch data prep module...을 클릭하여 데이터 준비 모듈을 엽니다(그림 1A, 데이터 전처리 모듈).
2. 데이터가 포함된 폴더를 선택합니다.
   1. 새 창의 도구 모음에서 폴더 아이콘을 클릭하여 현미경 데이터를 로드합니다(그림 4A).
   2. 데이터가 포함된 폴더를 선택한 다음 폴더 선택을 눌러 선택을 확인합니다.
3. 드롭다운 메뉴를 사용하여 phase_contr 채널을 선택하여 정렬 프로세스에 대한 채널을 선택합니다. 그런 다음 Ok 를 눌러 선택을 확인합니다(그림 4B).
4. Ok를 눌러 이미지 속성을 확인합니다(그림 4C).
   참고: z-스택 데이터로 작업하지만 분할에 하나의 슬라이스만 사용해야 하는 경우 슬라이더를 사용하여 적절한 z-슬라이스를 선택합니다. 필요한 경우 도구 모음의 버튼을 사용하여 선택 영역을 다른 프레임에 적용합니다.
5. 정렬 프로세스를 실행합니다.
   1. 도구 모음에도 있는 시작 버튼을 클릭합니다(그림 5A).
   2. 예를 클릭하여 정렬 프로세스를 시작합니다.
      참고: 정렬을 건너뛰려면 아니요 를 클릭합니다.
   3. 확인을 눌러 패딩에 대한 정보가 승인되었는지 확인합니다.
      참고: 데이터 크기에 따라 정렬에 시간이 걸릴 수 있습니다.
   4. 프로세스가 완료되면 확인 을 눌러 정렬을 완료합니다.
6. ROI 및 백그라운드 ROI를 설정합니다.
   1. 데이터 준비 GUI의 하단에 있는 프레임 선택 슬라이더를 사용하여 분할 비디오의 마지막 프레임으로 이동합니다.
   2. 자동으로 추가된 배경 ROI를 이미지 전체로 드래그하거나 다이아몬드를 사용하여 크기를 조정하여 조정합니다. 백그라운드 ROI에 셀이 없는지 확인합니다. ROI를 그대로 둡니다(그림 5B).
      참고: 추가 ROI를 정의하려면 자르기 ROI 추가 버튼(도구 모음에 있음)을 클릭하고 뷰어에서 선택합니다. 일반적으로 ROI는 가능한 한 작아야 하지만 관련 프레임에서 관심 있는 모든 셀을 포함해야 합니다. 그러나 이 프로토콜 내에서 재현성을 보장하려면 수정하지 않는 것이 좋습니다.
7. 선택한 ROI를 새 이미지 파일로 자르려면 맨 왼쪽 자 르기 버튼을 클릭합니다.
   참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 자른 이미지가 필요하지 않은 경우 창을 닫을 수 있습니다. 모든 ROI 및 배경 ROI의 좌표는 자동으로 저장되며 나중에 분할에 사용할 수 있습니다. ROI가 변경되지 않은 경우 이 버튼은 아무 작업도 수행하지 않습니다. 자르기 옵션에는 XY 방향, Z-슬라이스 또는 특정 시간 범위가 포함됩니다. 각 버튼에는 잘릴 치수가 표시됩니다.
8. 정렬된 데이터 저장
   1. 창 닫기 버튼(예: Windows의 경우 오른쪽 상단 모서리에 있는 X , macOS 또는 Linux의 경우 왼쪽 상단 모서리에 있는 빨간색 점)을 사용하여 창을 닫습니다.
   2. 예, 정렬된 데이터를 저장하여 정렬된 데이터를 저장합니다.
   3. 예, 정렬된 데이터를 다시 저장하여 확인합니다.
9. 4.7단계를 건너뛰지 않고 ROI가 수정되지 않은 경우 잘린 데이터를 저장합니다.
   1. 잘 린 데이터를 저장하려면 예, 잘린 데이터를 저장 합니다.
   2. 예, 자르기를 눌러 자르기 저장을 확인합니다.
   3. 확인을 클릭하여 기본 폴더 경로를 확인합니다.
      참고: 잘리지 않은 데이터를 유지하려면 다른 폴더를 선택합니다.
   4. 예, 덮어쓰기를 선택하여 기본 경로가 이전에 사용되었는지 확인합니다.
   5. 프로세스가 완료된 후 확인 을 눌러 확인합니다.

5. 세분화에 가장 적합한 모델 및 매개변수 찾기

참고: Cell-ACDC는 최상의 세분화 파라미터를 찾기 위한 실시간 피드백이 포함된 GUI를 제공합니다(그림 6). 일반적으로 이러한 모델은 각각 자체 문서가 있는 타사에서 제공합니다. 최상의 세분화 모델과 최적의 매개변수를 결정하는 것은 사용자의 책임이며, 사용자는 추가 정보를 위해 시도하는 각 모델의 문서를 확인해야 합니다.

1. 기본 창에서 Launch GUI...를 클릭합니다(그림 1A, 모듈 시각화 및 수정).
2. 샘플 데이터를 로드합니다.
   1. 새 창의 도구 모음에서 폴더 아이콘을 클릭하여 폴더 선택 메뉴를 엽니다.
   2. 데이터가 포함된 폴더를 선택한 다음 폴더 선택을 눌러 선택을 확인합니다.
3. 시각화할 채널을 선택합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 세분화할 채널 phase_contr 선택한 다음 확인 을 선택하여 확인합니다.
4. 데이터 로드를 완료합니다.
   1. 확인을 눌러 기본 세그멘테이션 마스크 이름을 확인합니다.
   2. 로드된 위치에 대해 확인을 클릭하여 이미지 속성을 확인합니다.
   3. 추가 형광 데이터가 로드되지 않도록 하려면 아니오 를 선택합니다.
5. 모드 선택기(그림 6, "모드 선택기")에서 분할 및 추적 모드를 선택합니다.
6. 최상의 전처리 설정을 찾습니다.
   1. 이미지 > 전처리로 이동합니다... 상단 메뉴 모음에서 사용자 지정 전처리 창을 엽니다(그림 7A).
   2. 드롭다운 메뉴에서 핫 픽셀 제거 또는 원하는 다른 전처리 단계를 선택합니다.
   3. 톱니바퀴 아이콘을 사용하여 단계에 대한 설정을 초기화하고 변경합니다. 정보 버튼을 사용하여 단계 및 사용 가능한 매개변수에 대한 정보를 표시합니다. 설정을 변경하지 않고 그대로 둡니다.
   4. 더하기 아이콘을 사용하여 한 단계를 더 추가합니다.
   5. Rescale Intensities 를 선택하고 5.6.1 및 5.6.2단계를 반복하여 설정을 확인합니다.
   6. 미리보기 확인란을 선택하여 단계의 효과를 실시간으로 확인합니다.
   7. 모든 프레임에 적용을 클릭합니다(그림 7B).
   8. 저장 전처리된 데이터를 눌러 저장 프로세스를 시작합니다.
   9. 확인을 눌러 기본 이름을 확인합니다.
   10. 전처리 레시피 창을 닫습니다.
7. 최상의 세분화 설정을 찾습니다.
   1. 세그먼트 > 상단 리본의 세그먼트 표시 프레임 을 선택한 다음 YeaZ_v2 를 선택합니다(그림 8A).
   2. 메시지가 표시되면 확인을 눌러 YeaZ_v2 다운로드합니다.
      참고: 다운로드하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 진행률이 콘솔 창에 표시됩니다. 응답하지 않더라도 다운로드 중에 GUI를 닫지 마십시오.
   3. 기본 매개변수는 변경하지 않고 그대로 둡니다.
      참고: 대부분의 매개변수에는 자세한 지침을 제공하는 정보 버튼이 있습니다.
   4. 후처리 세분화 매개변수를 확인하여 후처리를 활성화합니다(그림 8B).
   5. 확인을 클릭하여 매개변수를 수락합니다.
      참고: 세분화는 모델 복잡성, 이미지 크기 및 컴퓨터 사양에 따라 잠시 걸릴 수 있습니다. 특히 Cellpose 버전 4는 매우 느릴 수 있습니다.
   6. 자동 세분화 활성화에 대한 메시지가 표시되면 아니요를 선택합니다.
   7. 세분화가 제대로 작동하는지 확인합니다.
   8. 5.7.1단계를 반복하여 분할 매개변수를 다시 엽니다.
   9. 세분화 결과가 예상대로인 경우 모든 매개 변수를 레시피 파일에 저장을 누릅니다. 그렇지 않으면 분할 매개변수를 변경하고 5.7.4 단계부터 5.7.8 단계까지 반복합니다.
   10. 텍스트 입력을 사용하여 세그멘테이션 레시피에 이름을 테스트합니다.
   11. 확인을 클릭하여 이름을 적용합니다.
   12. 확인을 눌러 워크플로 저장을 완료합니다.
   13. 매개변수 선택 화면을 닫습니다.
8. GUI 창 닫기
   1. GUI 창을 닫습니다.
   2. 닫기 전에 저장하지 않으려면 아니요 를 누릅니다.

6. 분할 및 추적(일괄 처리)

1. 기본 창에서 Launch segmentation module... 을 클릭합니다(그림 1A, "세그먼트 및 추적" 모듈).
   1. 샘플 데이터를 선택합니다. Cell-ACDC의 폴더 선택기를 사용하여 데이터가 포함된 폴더를 선택한 다음 폴더 선택을 눌러 선택을 확인합니다.
2. 일괄 처리를 위한 매개변수를 선택합니다.
   1. 세분화를 위한 채널로 채널 phase_contr_preprocessed 을 선택합니다. 확인 을 눌러 선택을 확인합니다.
      알림: 일부 모델은 추가 채널을 입력으로 사용합니다. 이 채널은 나중에 다른 세분화 매개변수를 설정할 때 선택할 수 있습니다.
   2. 확인을 클릭하여 이미지 속성을 확인합니다.
3. 세분화 모델 설정을 지정합니다.
   1. 세그멘테이션에 사용해야 하는 모델로 YeaZ_v2 를 선택한 다음 확인을 클릭하여 선택을 확인합니다.
   2. Load saved recipe...(저장된 레시피 로드... 버튼을 클릭하여 이전에 저장한 레시피를 로드합니다.
   3. 목록에서 segmentation_recipe_test.ini 를 선택한 다음 확인을 클릭하여 선택을 확인합니다.
   4. 확인을 눌러 성공적인 로드 메시지를 해제합니다.
   5. 확인을 선택하여 매개변수를 확인합니다.
4. 다른 세분화 설정을 확인합니다.
   1. 확인을 눌러 세그멘테이션 파일의 기본 이름을 적용합니다.
   2. 아니요를 선택하여 전체 이미지를 분할해야 하는지 확인합니다.
   3. 확인을 선택하여 중지 프레임을 타임랩스의 마지막 프레임으로 설정합니다.
5. 추적 설정을 지정합니다. 사용할 추적 방법으로 YeaZ 를 선택한 다음 확인을 눌러 선택을 확인합니다.
6. 세그멘테이션 및 추적 루틴을 실행합니다.
   1. 지금 실행 을 클릭하여 세그멘테이션 및 추적 파이프라인을 실행합니다.
      참고: 이미지 크기, 모델 복잡성 및 컴퓨터 사양에 따라 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 테스트 실행에서 GPU가 없는 장치에서 YeaZ_v2 테스트 데이터를 분할하는 데 약 2분이 걸렸습니다.
   2. 클릭 Ok 세 그멘테이션을 완료합니다.

7. 세분화 및 추적 오류 수정

참고: 일반적으로 이전 프레임과 비교하여 현재 프레임에서 누락된 셀은 노란색 윤곽선과 ID로 표시됩니다. 새로 감지된 셀은 빨간색 ID와 두꺼운 윤곽선으로 나타납니다. 손실된 것으로 승인된 셀은 녹색 윤곽선과 ID로 표시됩니다.

1. 기본 창에서 Launch GUI...를 클릭합니다(그림 1A, "시각화 및 수정" 모듈).
2. 샘플 데이터를 로드합니다.
   1. 새 창의 도구 모음에서 폴더 아이콘을 클릭합니다.
   2. 데이터가 포함된 폴더를 선택한 다음 폴더 선택을 눌러 선택을 확인합니다.
3. 시각화할 채널을 선택합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 채널 phase_contr_preprocessed를 선택한 다음 확인 을 선택하여 확인합니다.
4. 세그먼트 마스크 이름을 선택합니다. 선택 선택한 항목 로드 이전 단계에서 만든 세그멘테이션 파일을 로드합니다.
5. 데이터 로드 프로세스를 완료합니다.
   1. 로드된 위치에 대해 확인을 클릭하여 이미지 속성을 확인합니다.
   2. 추가 형광 데이터가 로드되지 않도록 하려면 아니오 를 선택합니다.
6. 모드 선택기(그림 6, "모드 선택기")를 사용하여 분할 및 추적 모드를 선택합니다.
   참고: GUI 하단의 확인란을 사용하여 표시된 주석을 변경합니다. 왼쪽 및 오른쪽 이미지는 서로 다른 주석을 표시할 수 있습니다.
7. 실시간 추적기를 선택합니다. 메뉴 표시줄(그림 6, "메뉴 모음")에서 추적 > 실시간 추적 알고리즘 선택 으로 이동하여 원하는 실시간 추적기를 선택합니다. 발아 효모의 경우 Cell-ACDC 또는 Cell-ACDC 2단계를 사용하거나 다른 유기체의 경우 Cell-ACDC 대칭 분열 을 사용합니다.
8. 세분화 및 추적을 수정합니다.
   1. 왼쪽 및 오른쪽 화살표 키를 사용하여 프레임 사이를 탐색합니다.
   2. 프레임 10으로 이동합니다.
   3. S 키를 눌러 수동 새싹 분리 도구를 활성화합니다.
   4. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하면 셀 1의 분할 마스크가 자동으로 분할됩니다.
   5. 프레임 14로 이동합니다.
   6. B 키를 눌러 브러시를 활성화합니다.
   7. 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 새싹에 대한 누락된 분할 마스크를 그립니다.
   8. 세그멘테이션 및 추적 오류를 수정하는 동안 후속 프레임을 검토합니다. 사용 가능한 도구를 사용합니다(그림 6, "도구 모음 편집"). 적어도 프레임 42까지 수정합니다.
      참고: 대부분의 도구에는 해당 기능을 설명하는 도구 설명이 있습니다. 도구 설명을 표시하려면 도구 위로 마우스를 가져갑니다.

8. 세포 주기 주석

참고: 관심 있는 모든 프레임에 대한 분할 및 추적 수정을 완료한 후에만 이 단계로 이동합니다. 세포 분열 유형(대칭, 예: 포유류 세포 또는 비대칭, 예: 발아 효모)에 따라 올바른 주석 모드를 사용하십시오. 샘플 데이터는 "비대칭 분할 셀", 8.1단계를 참조하십시오. 8.2단계에서는 대칭 분열 세포에 대한 일반적인 워크플로를 설명합니다.

1. 비대칭 분할 세포
   참고: 발아 효모와 같은 유기체의 경우 새싹을 어미에게 할당할 수 있습니다. 두 개체가 동일한 프레임에 있어야 합니다. 기본적으로 발아 효모에 대한 주석을 기반으로 예상되는 세포 주기 단계가 표시됩니다. 새싹의 세포 주기 단계는 빨간색으로 표시되고 다른 모든 물체의 세포 주기 단계는 흰색으로 표시됩니다. 어미는 노란색 점선으로 새싹에 연결되어 있습니다.
   1. 모드 선택기를 사용하여 세포 주기 분석을 활성화합니다(그림 6, "모드 선택기").
   2. 메시지가 표시되면 예, 프레임 1로 이동을 선택합니다.
   3. 왼쪽 및 오른쪽 화살표 키를 사용하여 프레임 사이를 탐색합니다.
   4. 프레임 41로 이동합니다. 확인 을 클릭하여 메시지가 표시되면 Cell Cycle Annotation 테이블의 초기화를 수락합니다.
   5. 셀 1 또는 그 새싹을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 연결을 분리하고 세포 분열 이벤트에 주석을 달습니다.
   6. 모든 관련 프레임이 보일 때까지 계속합니다. 사용 가능한 도구를 사용하여 자동 어미 새싹 할당의 실수를 수정합니다(그림 6, "도구 모음 편집").
   7. 사용 가능한 도구
      참고: Break/Rebind Mother-Bud Association 도구를 제외한 이러한 도구는 사용자 지정 가능한 바로 가기를 사용하거나 도구 모음에서 관련 버튼을 눌러 활성화할 수 있습니다.
      1. 새싹을 어머니에 할당(A): 새 싹을 어머니에 할당 도구를 활성화합니다. 새싹에서 마우스 오른쪽 버튼을 길게 누릅니다. 해당 모 셀로 드래그하고 마우스 버튼에서 손을 뗍니다.
         알림: 어머니에게 새싹을 자동으로 할당하는 것이 올바르지 않은 경우 이 도구를 사용하십시오.
      2. 알 수 없는 기록에 주석 달기(U): 알 수 없는 기록에 주석 달기 도구를 활성화합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 사용하여 알 수 없는 기록이 있는 것으로 주석을 달아야 하는 셀을 클릭합니다.
         참고: 이 도구를 사용하여 알 수 없는 기록이 있는 셀에 수동으로 주석을 달아 자동 추론이 불충분한 계보 모호성을 수정하는 데 도움이 됩니다.
      3. 세포 주기 주석 재초기화
         참고: 이 옵션을 사용하여 현재 프레임부터 세포 주기 주석 알고리즘을 다시 실행합니다. 이를 통해 세분화/추적 데이터에 대한 최근 수정 또는 업데이트와의 일관성을 보장합니다.
      4. 어미-새싹 연결 끊기/재바인딩: 다른 도구가 선택되어 있지 않은지 확인합니다. 기존 어미-새싹 쌍을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 연결을 끊거나 다시 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 연결을 다시 설정합니다.
2. 대칭 분열 셀
   참고: 이 기능은 베타 테스트 중이며 곧 공식적으로 출시될 예정입니다. 단일 모세포에 두 개 이상의 딸 세포를 할당할 수 있습니다. 잠재적 모세포는 이전 프레임에 존재하지만 현재 프레임에는 없는 세포이며, 잠재적 딸 세포는 현재 프레임에 새로 나타나는 세포입니다.
   1. 모드 선택기를 사용하여 일반 분할: 계보 트리 를 활성화합니다(그림 6, "모드 선택기").
   2. 메시지가 표시되면 예, 프레임 1로 이동을 선택합니다.
   3. 왼쪽 및 오른쪽 화살표 키를 사용하여 프레임 사이를 탐색합니다.
   4. 사용 가능한 도구를 사용하여 자동 모자 할당의 실수를 수정합니다(그림 6, "도구 모음 편집").
   5. 전파를 클릭하여 메시지가 표시되면 변경 내용을 전파합니다.
   6. 사용 가능한 도구
      알림: 이러한 도구는 바로 가기 또는 도구 모음의 해당 버튼을 사용하여 활성화할 수 있습니다.
      1. 새 셀 ID의 어머니 찾기(F): 새 셀 ID의 어머니 찾 기 도구를 활성화합니다. 새 셀을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 후보 모세포를 순환합니다. Shift + 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 후보를 뒤로 순환합니다.
         참고: 이 도구를 사용하여 딸 셀의 어머니를 할당하거나 수정합니다.
      2. 알 수 없는 어머니 설정(U): 알 수 없는 어머니 설정 도구를 활성화합니다. 어머니를 알 수 없는 셀을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다 .
         참고: 이 도구를 사용하여 셀의 어머니를 알 수 없는 것으로 수동으로 지정합니다.

9. 데이터 저장

1. 상단 리본에서 파일 > 저장 으로 이동합니다.
2. 측정 설정...을 클릭하여 원하는 측정값을 선택합니다.
3. mCitrine 메트릭 또는 원하는 다른 측정 옆에 있는 확인란을 선택합니다.
4. 확인을 클릭하여 확인합니다.
5. 예를 클릭하여 측정값을 저장합니다.
6. 확인을 클릭하여 측정값을 저장해야 하는 프레임을 확인합니다.
7. 데이터 연결에 대한 메시지가 표시되면 아니요 를 클릭합니다.

10. 데이터 구조 생성

참고: 이 섹션에서는 분할 및 추적을 위한 현미경 데이터 준비에 대해 설명합니다. "샘플 데이터 다운로드"에서 다운로드되는 데모 데이터를 사용하는 경우 건너뛸 수 있습니다. 생성될 데이터 구조는 그림 9에 요약되어 있습니다.

1. 현미경 파일을 빈 폴더에 넣습니다.
   참고: .czi(Zeiss), .lif(Leica) 및 .nd2(Nikon)와 같은 현미경 형식과 단일 .tif 및 .png 파일이 지원됩니다.
2. 모듈 0을 클릭합니다 . 데이터 구조 만들기... 메인 창에서(그림 1A, "데이터 구조 만들기" 모듈).
3. BioIO 또는 Fiji Macro를 선택합니다.
   1. Windows를 사용하는 경우 BioIO 사용을 클릭하고 MacOS 및 Linux 사용자의 경우 피지 매크로 사용을 선택합니다.
      참고: 다음에서는 Windows를 사용하는 것으로 가정합니다.
   2. BioIO를 설치하라는 메시지가 표시되면 확인을 눌러 설치합니다.
   3. 현미경 파일 배열을 선택합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 현미경 파일 배열과 일치하는 옵션을 선택한 다음 확인을 눌러 확인합니다.
4. 원본 및 대상 폴더 및 데이터 로드 전략 선택
   1. 완료를 눌러 파일이 빈 폴더에 있는지 확인합니다.
   2. Cell-ACDC의 폴더 선택기를 사용하여 파일이 포함된 폴더를 선택합니다.
   3. 폴더 선택을 눌러 폴더를 선택합니다.
   4. 폴더 선택을 다시 눌러 대상 폴더와 동일한 폴더를 선택합니다.
      참고: 원시 현미경 파일은 삭제되지 않습니다.
   5. 예, 전체 위치를 한 번에 로드합니다.
5. BioIO 하위 패키지를 설치하라는 메시지가 표시되면 확인을 눌러 설치합니다.
6. 입력 파일의 메타데이터를 설정합니다.
   1. 메타데이터를 수정합니다.
      알림: 채널 이름 필드 옆에 있는 작은 눈 아이콘을 클릭하여 "차원 순서"를 다시 확인하십시오. 원시 파일에서 로드할 수 없는 다른 메타데이터가 강조 표시됩니다.
   2. 확인을 눌러 메타데이터를 확인합니다.
   3. 예를 눌러 치수 순서를 확인합니다.
7. 프로세스가 완료될 때까지 기다리십시오.
8. 프로세스가 완료되면 예를 눌러 창을 닫습니다.
   참고: 데이터 구조를 만드는 데는 데이터 크기에 따라 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.

11. 데이터 전처리 유틸리티

참고: 분석을 진행하기 전에 이미지를 처리하는 몇 가지 옵션을 기본 창에서 사용할 수 있습니다. 이러한 도구에 액세스하려면 기본 창의 메뉴 모음에 있는 유틸리티 드롭다운 메뉴(그림 1B, "유틸리티")로 이동하여 이미지 전처리 위로 마우스를 가져간 다음 사용해야 하는 옵션을 선택합니다. 두 가지 예는 다음과 같습니다.

1. 채널 결합: 두 개 이상의 이미지 채널을 병합하는 데 사용합니다.
   참고: 예를 들어, 두 개의 형광 채널을 평균화할 수 있습니다.
2. 이미지 크기 조정: 매우 큰 이미지 데이터 세트의 크기를 줄이려면 사용합니다.
   참고: 이렇게 하면 처리 시간이 크게 빨라질 수 있으며 대부분의 경우 세분화 품질에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않습니다.

12. 문제 해결

1. Cell-ACDC가 충돌하는 경우 Cell-ACDC GitHub 페이지에서 문제 탭으로 이동하고 녹색 새 문제 버튼을 클릭하여 버그 보고서를 만듭니다. 제공된 템플릿에 따라 문제를 진단하고 해결하는 데 필요한 모든 관련 세부 정보를 포함합니다. 또는 image.sc 포럼에서 #cell-acdc 태그를 사용하여 도움을 구하거나 교신 저자 중 한 명에게 문의하세요. 대부분의 경우, 특히 패키지를 설치한 후에는 소프트웨어를 다시 시작하기만 하면 문제가 해결될 수 있습니다.
2. Cell-ACDC가 정지되거나 응답하지 않으면 콘솔에서 진행률 업데이트를 확인합니다. 특히 Cellpose 버전 4와 같이 계산 집약적인 모델을 사용하거나 대규모 데이터 세트를 처리할 때 긴 분할 시간은 정상입니다. Cell-ACDC가 응답하지 않으면 12.1단계를 참조하여 추가 지침을 확인하십시오.
3. 자동 분할에 배경이 잘못 포함된 경우 전처리 단계에서 배경이 지나치게 매끄럽게 처리되었는지 확인합니다. 많은 세분화 모델은 원시(사전 처리되지 않은) 이미지로 훈련되며 배경에 충분한 질감이 부족할 때 성능이 저하될 수 있습니다.

Results

3D에서 종양 스페로이드의 핵 부피 정량화

자동화된 3D 현미경(z-스택)을 통해 과학자들은 오가노이드와 같은 복잡한 다세포 시스템을 시각화할 수 있습니다. 단일 세포 수준에서 형태학적 및 형광 신호 특성을 정량화하려면 3D의 세포 분할이 필요한 경우가 많습니다. 다음 예는 Cell-ACDC가 핵 염색 채널에서 수천 개의 세포를 포함하는 오가노이드의 핵을 분할하고 부피를 정량화하는 방법을 보여줍니다(^Ref.9의 데이터). 세분화는 ^Ref.9에서 훈련 및 게시된 맞춤형 Cellpose 모델을 사용하여 수행되었습니다. 훈련된 Cellpose 모델은 Cellpose v2에 대한 모델 매개변수를 선택할 때 GUI에서 가중치 파일 경로를 제공하여 Cell-ACDC에서 직접 사용할 수 있습니다. 분할은 모든 이미지를 일괄 처리하기 위해 Cell-ACDC의 두 번째 모듈을 사용하여 수행되었습니다(그림 1A, "세그먼트 및 추적" 모듈). 다음으로, 결과는 세 번째 모듈 GUI(그림 1A, "시각화 및 수정" 모듈)에서 시각화되었습니다. 이 모듈은 여러 주석 옵션(예: 윤곽선, 오버레이된 분할 마스크 또는 텍스트 ID)을 사용하여 수천 개의 단일 개체를 시각화하도록 최적화되었습니다. 3D 마스크의 측정값을 계산한 후 사용 가능한 모든 측정값을 GUI에 직접 문서화했습니다. 상단 메뉴 표시줄(그림 6, "메뉴 표시줄")으로 이동하여 측정 메뉴를 선택한 다음 측정 설정.... 팝업 대화 상자를 통해 사용자는 정보 버튼에서 측정별 정보를 얻고 저장할 측정을 선택할 수 있습니다. 그림 10의 대표적인 결과에는 객체의 총 복셀에 픽셀 크기의 제곱과 복셀 깊이를 곱하여 계산된 각 객체의 부피인 "cell_vol_fl_3D"가 사용되었습니다. 이러한 속성은 현미경 원시 파일에서 자동으로 추출되거나 사용자가 제공합니다. 이 GUI에서 측정값을 계산하려면 원시 이미지를 로드해야 합니다. 따라서 프로세스를 간소화하고 일괄 처리를 활성화하기 위해 유틸리티 메뉴(그림 1B, "유틸리티")에서 측정 하위 메뉴 측정 으로 이동한 다음 하나 이상의 실험에 대한 측정 계산으로 이동하여 측정값을 계산할 수도 있습니다. 마지막으로 핵 부피 분포를 대표적인 결과로 표시했습니다(그림 10). 이 분석은 분할 아티팩트로 인한 것으로 추정되는 작은 핵의 상당 부분을 보여줍니다. 분할 마스크에서 작은 물체를 필터링하여 쉽게 제거할 수 있습니다. 동시에, 매우 큰 핵은 분할 중에 병합된 핵으로 인한 것일 수 있습니다. 인공물을 식별하고 세포 크기에 대한 추가 생물학적 정보를 추출하기 위해 물체(예: 단일 세포)의 부피 분포를 항상 표시하는 것이 좋습니다.

타임랩스 현미경 데이터의 정량화

타임랩스 현미경을 사용하면 단일 세포 수준에서 세포 역학을 직접 관찰할 수 있습니다. 세포 분할 외에도 시간적 역학을 추출하려면 세포 추적 및 세포 계통 주석을 포함한 추가 분석이 필요합니다. 이러한 분석 단계의 상호 의존성으로 인해 파이프라인 초기에 도입된 오류가 이후 단계로 전파될 수 있습니다. 따라서 세분화, 추적 및 주석 오류의 지속적인 시각화 및 수정이 필요합니다. 다음은 Cell-ACDC가 이러한 작업을 처리하는 데 적합하다는 것을 보여줍니다. 두 가지 다른 모델 유기체의 두 데이터 세트가 선택되었습니다: 1) 발아 효모(^Ref.35의 균주 DCY001-1, 여기서 두 개의 히스톤 H2B 단백질인 Htb1 및 Htb2는 mCitrine으로 태그됨) 및 2) 마우스 배아 줄기 세포(mESC, ^Ref.22의 데이터).

이 두 데이터 세트는 Cell-ACDC에서 사용할 수 있는 두 가지 주석 모드, 즉 비대칭 및 대칭(즉, 대칭 세포질분열 또는 "정상") 세포 분열을 강조합니다. 분열 방식이 다르기 때문에 두 유기체는 서로 다른 추적 및 주석 프레임워크를 필요로 합니다.

비대칭 분열에서 모세포는 새싹을 형성하여 성장하고 결국 분리되어 딸 세포가 됩니다. 분열 후 모세포는 원래 세포 ID를 유지하고 세대 번호는 1씩 증가하는 반면 딸 세포에는 새 세포 ID가 할당되고 세대 번호는 1로 설정됩니다. 발아 단계는 세포 주기의 S/G2/M 단계에 해당하며 Cell-ACDC에 주석이 달립니다. 이러한 주석 선택은 발아 효모의 세포 주기와 관련된 일반적인 생물학적 질문을 해결하는 데 도움이 됩니다.

"대칭적인" 분열(예: 포유류 세포)의 경우 모세포는 두 개의 딸 세포로 분열합니다. 모세포, 즉 ID는 분열 시 사라지고 두 딸 세포는 새로운 ID를 받습니다. 또한, 딸 세포의 세대 수는 모세포에 비해 1씩 증가합니다. Cell-ACDC는 또한 상위 ID, 루트 ID(계통 시작 부분의 원래 조상 셀) 및 자매 ID를 추적합니다.

두 주석 모드 모두에 대해 주석 오류를 수정하기 위한 혁신적인 프레임워크가 개발되었으며, 수정은 과거 및 미래의 모든 관련 시점으로 자동으로 전파됩니다. 시각화, 주석 및 수정은 세 번째 모듈 GUI(그림 1A, "시각화 및 수정" 모듈 및 그림 6)에서 수행되었습니다. 데이터 세트 1의 세포를 분할하고 추적하기 위해 모델 YeaZ_v2²⁶ 을 위상차 채널에 적용하고 핵(히스톤) 채널의 경우 StarDist²⁵ 모델을 사용했습니다. 그런 다음 유틸리티 추적 및 계보 > 하위 세포 객체 추적 및/또는 계수 (그림 1B, 유틸리티 메뉴 모음)를 사용하여 Cell-ACDC는 각 핵에 해당 세포의 세포 ID를 할당하여 세포 및 핵 마스크에서 생성된 테이블 간의 일관성을 보장했습니다.

데이터 세트 2의 경우 DeepSea²² 분할 모델이 사용되었습니다. 세 가지 모델 모두 이미 Cell-ACDC에서 사용할 수 있으며, 여러 분할 모델을 소프트웨어에 통합하는 이점을 보여줍니다.

분할 및 추적 오류가 수정되면 세포 계통에 주석을 달고 수치 특징을 계산한 다음 다운스트림 분석을 수행했습니다. 데이터 세트 1의 경우 열 TaYFP_amount_autoBkgr와 분할된 핵 수(그림 11A)가 시간에 대해 표시되었습니다. "TaYFP"는 핵 채널의 이름입니다. "amount_autoBkgr"은 낙후형광 이미지⁽³⁶⁾로부터 추출된 총 세포 단백질 양에 대한 대리이다. 이는 각 셀 마스크의 평균 형광 강도와 배경 중앙값 간의 차이에 셀 면적(픽셀 단위)을 곱한 값으로 계산됩니다. 여기서 배경 중앙값은 셀로 분할되지 않은 모든 픽셀에서 계산됩니다. 예상대로 H2B 양은 새싹 출현 시 증가하기 시작하고(그림 11A-ii) 핵 분열 전에 일정한 값에 도달합니다(그림 11A-iii). 히스톤 단백질의 양은 세포 주기에 따라 달라질 것으로 예상되기 때문에 이는 히스톤 단백질 항상성에서 중요한 품질 관리입니다. 또한 시간 경과에 따른 핵 수를 플로팅하면 히스톤 단백질의 양이 대략 핵 분열 전후에 최대에 도달한다는 것을 확인할 수 있습니다.

데이터 세트 2의 경우, 세포 분열을 겪고 있는 선택된 세포의 시간 경과에 따른 세포 면적이 그려졌습니다. 예상대로 셀 면적은 최대값에 도달할 때까지 증가합니다(그림 11B-i). 그런 다음 세포가 수축함에 따라 세포 분열(그림 11B-ii)까지 감소합니다. 마지막으로 두 개의 딸 세포에 대해 주기가 다시 시작됩니다. 세포가 예상대로 성장하고 분열하고 있는지 확인하기 위해 세포 주기에 따른 세포 크기 변화를 확인하는 것이 필수적이기 때문에 이는 또 다른 권장 분석입니다.

그림 1: Cell-ACDC 모듈. (A) 메인 Cell-ACDC 발사기에서 발사할 수 있는 4가지 주요 모듈에 대한 개요. 현미경 데이터를 분할, 추적 및 주석 달은 후 세 번째 모듈("시각화 및 수정") 또는 (B) 상단 메뉴 모음의 유틸리티 메뉴에서 수치 특징을 계산할 수 있습니다. "유틸리티"는 사용자 입력 없이 여러 데이터 세트에서 자동으로 실행될 수 있는 루틴입니다. 측정값을 계산하는 것 외에도 다른 유틸리티에는 여러 출력 테이블을 단일 테이블로 연결, 하위 셀룰러 객체 추적 및 이미지 전처리가 포함됩니다. Cell-ACDC는 2D, 3D(z-스택 또는 타임랩스) 및 4D 데이터(시간 경과에 따른 z-스택)를 지원하며 추가 채널을 얼마든지 사용할 수 있습니다. 그런 다음 수치 특징이 있는 출력 테이블을 다운스트림 분석 및 생물학적 발견에 사용할 수 있습니다(그림 10 및 그림 11). 이를 위해 출력 테이블에서 얻을 수 있는 플롯의 예가 포함된 Cell-ACDC GitHub 페이지의 Jupyter 노트북을 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: Cell-ACDC 의사 결정 순서도. 데이터 세트 유형 및 분석 요구 사항에 따라 사용할 모듈을 간략하게 설명하는 순서도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 예제 데이터를 다운로드합니다. (A) 환영 가이드를 엽니다. (B) 프로토콜을 복제하는 데 필요한 예제 데이터를 다운로드합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 데이터 준비를 위한 데이터 로드. (A) 데이터 준비 GUI에 데이터를 로드합니다. (B) 로드할 채널을 선택합니다. (C) 이미지 메타데이터를 편집하고 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 데이터 준비 프로세스를 실행합니다. (A) 프로세스를 시작합니다. (B) ROI(자르기용) 및 배경 ROI를 배치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 결과를 시각화하고 수정하기 위한 세 번째 모듈 GUI. 강조 표시된 항목이 있는 세 번째 모듈 GUI( 그림 1A의 "시각화 및 수정")의 스크린샷입니다. 도구 모음에 있는 대부분의 버튼에는 특정 기능을 사용하는 방법을 설명하는 도구 설명(버튼 위에 마우스 커서를 가져가면 액세스할 수 있음)이 있습니다. 모드 선택기를 사용하여 "뷰어", "분할 및 추적", "세포 주기 분석"(비대칭 분열 세포용), "정상 분열: 계보 트리"(포유류 세포와 같은 대칭 분열 세포용) 및 "사용자 지정 주석"의 5가지 모드 사이를 전환할 수 있습니다. 도구 모음 또는 메뉴 모음은 종종 다른 GUI에 존재합니다(예: "데이터 전처리" 모듈, 그림 1). 편집 도구 모음 에는 세분화 및 추적 오류를 편집하고 수정하는 데 사용할 수 있는 모든 기능(예: 브러시, 지우개, 편집 ID 등)이 포함되어 있습니다. 로드된 이미지는 두 개의 패널 보기로 표시되며, 이는 다양한 주석 옵션이 필요할 때 유용합니다(예: 왼쪽 이미지의 세포 주기 정보 및 오른쪽 이미지의 ID). 오른쪽 이미지를 끌 수도 있습니다(이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 미러링된 이미지 표시를 선택 취소). 각 이미지 패널에는 강도 수준을 빠르게 조정할 수 있는 측면의 LUT 슬라이더가 포함되어 있습니다. LUT 컨트롤을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하면 강도 이미지에 대해 다른 색상 맵을 선택할 수 있습니다. 또한 오른쪽에는 강도 이미지에 오버레이할 분할 레이블의 색상에 대한 LUT 선택기가 있습니다 (Segm. masks라고 하는 주석 옵션). 왼쪽 이미지에 대한 주석 옵션의 왼쪽에는 자동 저장, 글꼴 크기 등과 같은 일부 설정을 제어하는 추가 토글이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 기본 GUI에서 전처리를 시각화합니다. (A) 전처리 대화 상자를 엽니다. (B) 초기화된 프로토콜에 사용된 매개변수와의 전처리 대화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 기본 GUI에서 분할 출력을 시각화합니다. (A) 분할 모델을 선택합니다. (B) 세분화 매개변수를 설정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: Cell-ACDC에 필요한 폴더 구조. Cell-ACDC로 작업하려면 데이터를 특정 폴더 구조로 정렬해야 합니다. Cell-ACDC는 이 구조를 자동으로 생성하는 모듈을 제공하지만 이 구조가 어떻게 생겼는지 이해하는 것이 중요합니다. 먼저 모든 파일은 Images라는 폴더 안에 있어야 합니다. 다음으로 모두 소위 "basename_"라는 동일한 이름으로 시작해야 합니다. 필요한 파일의 최소 집합은 단일 채널 TIFF 파일(2D, 3D z-stack 또는 3D+time)과 "_metadata.csv"로 끝나는 CSV 파일입니다. 이 파일은 두 개의 열이 있는 테이블이어야 하며, 첫 번째 열은 Description 이고 두 번째 열은 values여야 하며, 각각 프레임 수와 z-슬라이스 수에 대한 SizeT 및 SizeZ 에 대한 항목을 포함해야 합니다. 이미지 파일에 z-슬라이스가 없는 경우 SizeZ 를 1로 설정해야 합니다. SizeT 가 1이어야 하는 타임랩스 이미지가 없는 경우에도 마찬가지입니다. CSV 파일인 항목은 쉼표로 구분된 한 줄의 Description,value입니다(예: SizeZ,1). 여러 채널의 경우 채널당 하나의 TIFF 파일을 생성해야 합니다. 그런 다음 Images 폴더를 "Position_1"라는 폴더 안에 배치해야 합니다. 여러 직위가 허용되며 연속된 번호로 이름을 지정해야 합니다. Cell-ACDC 모듈에 데이터를 로드할 때 사용자는 특정 위치 폴더 또는 전체 실험 폴더를 선택할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 종양 오가노이드의 3D 정량화. Cell-ACDC의 세 번째 모듈 GUI에 로드된 대표적인 종양 오가노이드(⁹의 데이터)의 스크린샷(왼쪽), 분할 마스크를 강조하는 빨간색 윤곽선이 있는 z-슬라이스의 예(중앙) 및 3D 분할 마스크에서 계산된 세포 부피 분포의 히스토그램(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11: 타임랩스 현미경 데이터의 정량화. (A) Cell-ACDC의 세 번째 모듈 GUI에 로드된 발아 효모 세포의 타임랩스 현미경 데이터의 스크린샷(왼쪽) 및 대표적인 세포 주기에서 시간 경과에 따른 히스톤 H2B 단백질 양 정량화(오른쪽). 확대된 이미지는 세포 주기 시작(i), 새싹 출현 시(ii) 및 핵 분열(iii)에서 예제 세포와 새싹(흰색 화살표)을 보여줍니다. 데이터는 Chatzitheodoridou et ^al.35 (B) 세포-ACDC의 세 번째 모듈 GUI(왼쪽)에 로드된 마우스 배아 줄기 세포의 타임랩스 현미경 데이터의 스크린샷 및 세포 분열을 겪는 대표 세포의 시간의 함수로 표시된 세포 면적(^μm2). 확대된 이미지는 분열 전 최대 세포 면적(i), 2개의 딸 세포로 분열(ii) 및 분열 후 마지막으로 분석된 프레임(iii)에서 예제 세포와 그 딸을 보여줍니다. 데이터는 Zargari et ^al.22,33에서 가져왔습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

다차원 현미경 데이터를 분석하려면 최첨단 AI 기반 모델을 사용해야 하는 경우가 많습니다. 그러나 이러한 도구는 빠르게 개발되며 채택에 상당한 진입 장벽이 있습니다. 또한 생물학자는 효과적인 오류 수정을 위해 결과를 시각화해야 하는 경우가 많습니다. 여기에서는 과학자들이 Cell-ACDC를 사용하여 이러한 문제를 해결할 수 있는 방법을 보여줍니다.

제시된 프로토콜의 중요한 단계는 최적의 세분화 모델을 선택하는 것입니다. Cell-ACDC에는 시각적 선택을 가능하게 하는 GUI가 포함되어 있습니다(그림 1A, "시각화 및 수정" 모듈). 여러 데이터 세트의 데이터 준비 및 일괄 처리를 위한 도구도 제공됩니다(그림 1A, 데이터 구조 생성, 데이터 전처리, 세그먼트 및 추적 모듈, 유틸리티). 사용자는 image.sc 포럼(#cell-acdc 태그 사용)에서 문제를 보고하고 피드백을 제공하거나 Cell-ACDC GitHub 페이지에서 문제를 열어 문제를 제공하는 것이 좋습니다.

Cell-ACDC는 수천 개의 핵⁹가 있는 이미지의 스페로이드 또는 프레임당 수백 개의 세포가 있는 발아 효모의 타임랩스 데이터와 같이 상대적으로 큰 데이터에 이미 사용되었지만 프로그램이 올바르게 작동하려면 전체 단일 채널 데이터를 RAM에 로드해야 합니다. 안정적인 성능을 보장하려면 사용 가능한 메모리에 있는 이미지 파일 크기의 약 3배를 사용하는 것이 좋습니다. 현재 사용 가능한 시스템 메모리를 초과하는 데이터 세트는 처리할 수 없지만 OME-Zarr³⁷의 통합을 통해 코어 외(지연) 로딩에 대한 지원이 계획되어 있습니다.

현재 Cell-ACDC의 주요 제한 사항 중 하나는 대부분의 도구가 3D z-스택 또는 2D+시간 데이터용으로 개발되었기 때문에 3D+시간 데이터 세트에 대한 부분적인 지원입니다. 따라서 Cell-ACDC의 향후 버전은 3D+시간 데이터를 완벽하게 지원하여 기능을 확장할 것입니다. 또한, 우리는 모세포가 두 개의 딸 세포로 분열하는 세포인 "대칭적으로" 분열하는 세포(예: 포유류 세포)에 대한 세포 혈통 주석 프레임워크를 확장하기 위해 노력하고 있습니다(모세포가 세포 주기당 한 번씩 발아를 통해 단일 딸 세포를 생성하는 발아 효모와 반대). 마지막으로, 현재 Cell-ACDC는 단일 채널 데이터가 RAM에 완전히 맞는 데이터로 제한됩니다. 따라서 위에서 언급한 대로 지연 로딩을 구현할 계획입니다.

Cell-ACDC는 출시 이후 새로운 세분화 및 추적 모델, 새로운 주석 프레임워크(예: 현재 베타 테스트 중인 포유류 세포용) 및 다양한 성능 개선을 추가하는 등 지속적으로 개선되었습니다. 이러한 발전 덕분에 과학자들은 Cell-ACDC를 사용하여 연구를 가속화하고 과학적 발견을 가능하게 할 수 있습니다 6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48 ^,49. 기존 방법 14,27,50,51과 비교하여 이 소프트웨어 프레임워크를 독특하게 만드는 것은 기존 모델을 활용하고 보완하여 커뮤니티 개발의 이점을 누릴 수 있다는 것입니다. Cell-ACDC의 지속적인 개발은 다차원 현미경 데이터 분석을 위한 참조 프레임워크로 확립하기 위해 활발히 유지되고 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아기	줄리안 피에치	10.7554/eLife.79812	세분화 및 추적 소프트웨어는 선택 사항으로, Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
베이지안 추적기	크리스티나 울리크나	10.3389/fcomp.2021.734559	추적 소프트웨어는 선택 사항으로 셀-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
셀-ACDC	프란체스코 파도바니	10.1186/s12915-022-01372-6	소프트웨어
세포 생식선 핵	크리스티나 핀틸데; 에이로 L&아큐트; pez / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana avka	10.17912/마이크로퍼블릭. 생물학.001062	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
셀포즈 버전 2	카센 스트링거	10.1038/s41592-020-01018-x	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
셀포즈 버전 3	카센 스트링거	10.1038/s41592-025-02595-5	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
세포 포즈 버전 4 (셀포즈-SAM)	마리우스  파치타리우	10.1101/2025.04.28.651001	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
컴퓨터	-	-	아래의 권장 사양을 참고하세요
컴퓨터 - CPU	어떤	-	권장 최소 4코어, 2.5GHz
컴퓨터 - GPU	엔비디아(선호)	-	(선택 사항) 권장 최소 8GB VRAM
컴퓨터 - 하드 드라이브 공간	어떤	-	4GB + 3 x 마이크로스코프 파일 크기
컴퓨터 - 운영체제	마이크로소프트, 애플, 기타	-	Windows, MacOS, Linux 모두 지원됩니다
컴퓨터 - RAM	어떤	-	3 x 단일 위치 파일 크기, 최소 16GB
딥씨	아볼파즐  자르가리	10.1016/j.crmeth.2023.100500	세분화 및 추적 소프트웨어는 선택 사항으로, Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
DeLTA	장-밥티스트 루가뉴 / 오웬 M. 오' 코너	10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797	세분화 및 추적 소프트웨어는 선택 사항으로, Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
인스턴세그	티보 골즈버러	10.48550/arXiv.2408.15954	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
미니포지	콘다-포지	-	Miniforge 웹사이트에서 설치 파일을 다운로드할 수 있는 링크: https://conda-forge.org/download/
옴니포스	케빈 커틀러	10.1038/s41592-022-01639-4	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
pomBseen	오히라 마코토	10.1371/journal.pone.0291391	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
SAM (세그먼트 애니씽 모델)	알렉산더 키릴로프	10.48550/arXiv.2304.02643	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
스타디스트	우베 슈미트 / 마틴 바이거트	10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
맥	칼 도어쉬	10.48550/arXiv.2306.08637	추적 소프트웨어는 선택 사항으로 셀-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
트랙아스트라	벤자민 갤러서	https://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570	추적 소프트웨어는 선택 사항으로 셀-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
트랙피	다니엘 앨런	10.5281/zenodo.1213240	추적 소프트웨어는 선택 사항으로 셀-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
이스트메이트	데이비드 벙크	10.1093/bioinformatics/btac107	세분화 소프트웨어는 선택 사항으로 Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다
예이즈	니콜라 디틀러	10.1038/s41467-020-19557-4	세분화 및 추적 소프트웨어는 선택 사항으로, Cell-ACDC와 함께 자동으로 설치할 수 있습니다