방법 논문

Caenorhabditis elegans의 운동의 연령 의존적 역학: Lyapunov 지수 분석

915 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68955

⸱

2025년 9월 23일

 ,  ,  , 
1Physics and Astronomy Department, Vassar College

이 논문에서

요약

이 연구는 가장 큰 Lyapunov 지수(LLE)를 측정하여 C. elegans 의 운동에 대한 연령의 영향을 조사합니다. 나이가 들수록 C. elegans 는 운동 조절이 증가하고 그에 따른 감소를 보입니다. 결과는 5일 후에 LLE가 최고조에 달하고 벌레가 나이가 들면서 감소하는 것으로 나타났습니다.

초록

이 연구는 최대 Lyapunov 지수(LLE)를 추정하기 위해 동적 광학 회절(DOD)을 사용하여 Caenorhabditis elegans (C. elegans)의 이동성에 대한 연령의 영향을 조사합니다. 동적 시스템의 핵심 지표인 LLE는 위상 공간에서 궤적의 발산 또는 수렴 속도를 정량화하여 시스템 역학의 예측 가능성과 혼돈, 이 경우 웜의 기관차 동작을 나타냅니다. 632nm 레이저 광은 물기둥에서 수영 벌레에서 회절되어 회절 패턴을 형성합니다. 포토다이오드는 회절 패턴 내의 한 지점에서 빛을 감지하여 웜이 물결치면서 1차원 시계열을 캡처합니다. 이 시계열은 전체 웜의 움직임을 복합적으로 표현하는 역할을 하며, 회절 패턴의 한 지점이 웜의 모든 점의 중첩이기 때문에 이동 역학을 캡슐화합니다. 그런 다음 시계열을 고차원 위상 공간에 임베드하여 LLE를 계산합니다. C. elegans 는 일반적으로 약 14일 동안 살며, 나이가 들면서 운동 조절이 증가 및 감소하는 패턴을 따릅니다. 연령별 효과를 분리하기 위해 벌레를 이틀마다 대 장균 이 포함된 신선한 한천 플레이트로 옮겨 적절하게 숙성되도록 했습니다(3일에서 12일). 13마리의 C. elegans 코호트를 분석한 결과 LLE는 부화 후 5일에 1.34 ± 0.03 1/s의 비율로 정점을 찍은 것으로 나타났습니다. 이 피크는 벌레의 이동이 가장 복잡하고 혼란스러운 행동을 보이는 발달의 임계점을 의미합니다. 관찰된 LLE 값은 자발적 활동의 연령 관련 변화를 설명하는 잘 확립된 모델인 무어 방정식과 일치하며, 운동 제어 및 활동 수준 감소를 C . elegans의 연령 증가와 연결합니다.

서론

미세한 벌레인 Caenorhabditis elegans(C. elegans)의 이동은 이 선충이 신경학적으로 단순하고 뉴런이 302개에 불과하기 때문에 운동 뉴런의 배선에 대한 이해를 높이기 위해 연구되었습니다1. C. elegans는 수명이 14일에 불과한 모델 유기체입니다2. C. elegans의 302개 뉴런 중 약 72개만이 이동에 사용되며 선충의 성체 전체에 위치합니다1. C. elegans의 저차원 이동(즉, 좌우, 앞뒤로)3은 LLE에서 범위를 추적하기 쉬운 표본으로 만듭니다. 선충류의 신경계는 믿을 수 없을 정도로 이해됩니다4.

비디오 분석은 곡률 반경, 기복 주파수 및 파장5와 같은 양을 측정하여 C. elegans 이동을 정량화하는 데 도움이 되었습니다. 이러한 측정은 다양한 환경 및 다양한 조건에서 운동 특성을 비교할 수 있는 제어 변수를 확립했습니다 6,7. 이 정보는 C. elegans8의 이동을 구동하는 회로의 진화하는 모델을 형성하고 벌레9의 가상 및 물리적 동적 시뮬레이션을 생성할 수도 있습니다.

동적 광학 회절(DOD)10 은 C. elegans의 이동을 정량화하는 데에도 사용되었습니다. DOD 동안 저강도 레이저 광은 살아있는 웜 주위로 구부러져 프라운호퍼 회절 패턴으로 알려진 원거리 회절 패턴을 형성합니다. 라이브 패턴의 강도 분포는 선충이 움직일 때 변합니다. 회절의 한 점은 웜의 모든 점의 중첩이므로 회절 패턴의 시간 의존적 강도는 운동 역학에 대한 정보를 포함하는 1차원 시계열을 형성합니다11. 우리는 실험적인 1차원 시계열에서 계산한 운동의 연령 의존적 LLE(Largest Lyapunov Exponent)에 초점을 맞춥니다. 다양한 발달 단계의 LLE는 다른 연령 관련 연구와 유사하며, 신경 회로가 비디오 분석 또는 DOD5와 같은 다양한 도구를 사용하여 측정할 수 있는 운동 패턴으로 나타난다는 것을 보여줍니다.

DOD는 간섭 패턴이 이동을 사용된 파장의 일부로 해결할 수 있는 동시에 종의 가소성(모양)의 대규모 변화를 설명할 수 있기 때문에 여러 척도에서 민감한 시계열을 제공합니다. 이 기능은 작은 변화가 나비 효과라고도 하는 궤적의 기하급수적인 변화로 이어지는 혼돈 시스템과 같이 시스템이 초기 조건에 민감할 때 특히 유용합니다.12. 이러한 이유로 시스템이 발전함에 따라 이러한 변화로 인해 상당한 변화가 발생할 수 있으므로 작은 변화를 기록할 수 있는 속도로 시계열을 캡처하는 것이 중요합니다. 포토다이오드(PD)는 많은 고가의 고속 카메라보다 더 빠르게 시계열을 캡처할 수 있습니다. 회절 패턴의 공간 감도와 높은 데이터 축적 속도의 조합은 혼돈 시스템의 본질을 포착할 수 있습니다13,14.

LLE는 위상 공간 궤적의 지수 발산을 설명합니다. 위상 공간에는 상태 변수(또는 좌표) 및 관련 도함수(또는 모멘터)15에 의해 설명되는 시스템의 모든 가능한 상태가 포함됩니다. 다양한 궤적은 다양한 초기 조건에 대한 시스템의 진화를 설명합니다. 혼돈 시스템에서는 두 개의 인접한 궤적이 시간이 지남에 따라 기하급수적으로 발산되며 그 발산은 양의 LLE로 정량화됩니다. 물리적 시스템에서 이러한 발산은 시스템의 초기 조건에서 불확실성이 전파되는 것으로 나타나며, LLE14에서 제공하는 바와 같이 일정 시간이 지나면 시스템 상태를 안정적으로 예측할 수 없는 것으로 나타납니다.

실험 시스템에서 상태 변수는 종종 알려지지 않았습니다. 그러나 위상 공간의 토폴로지는 시간 지연 버전(시간 도함수와 동일)을 구성하여 Takens 임베딩 정리16 을 사용하여 하나의 측정된 변수에서만 재구성할 수 있습니다. 각 시간 지연 버전은 축에 표시됩니다. 함께 시간 지연은 시차 플롯을 형성하며, 이는 시계열이 무한히 긴 경우 위상 플롯과 위상적으로 동일합니다. 실험 시계열은 길이가 제한되어 있으므로 실험적 불확실성에 의해 제한되는 추정된 LLE만 렌더링할 수 있습니다.

C. elegans의 이동은 혼돈의 지표인 양의 LLE10을 전달합니다. 어린 유기체는17세가 되면 운동 변화를 겪습니다. LLE가 클수록 LLE가 작을수록 예측 가능성이 낮다는 것을 나타냅니다. LLE는 유기체의 운동 패턴을 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다 10,13,14. 선충 운동 특성은 선충 내의 뉴런과 관련이 있습니다18. Cohen et al.19에 따르면, 선충의 이동은 운동 뉴런에 의존하며, 이는 선충의 이동의 복잡성에 대한 연구가 신경 회로와도 관련이 있음을 시사합니다.

향후 연구의 불확실성을 최소화하기 위해 연령에 따라 LLE를 보정합니다. 과거 연구에서는 3일에서 6일 된 선충의 LLE를 평균화했습니다13. 이 연구는 노화와 관련된 쇠퇴에 대한 엄격한 분석을 용이하게 하기 위해 선충의 나이를 주의 깊게 모니터링했습니다. 또한 C. elegans의 다른 생물학적 변화를 확인하기 위해 이동의 변화가 조사되었습니다 18. 무어 방정식은 이동과 관련된 연령 매개변수를 추적합니다 20. 여기에서는 운동 메커니즘이 평가될 시기에 유연성을 허용하는 무어 방정식의 수정된 버전을 사용하며, 시간적 마커 T로 도입됩니다.

figure-introduction-1, (1)

여기서 P(t)는 성능을 나타내고, t 는 시간이며, a 와 c 는 스케일링 매개변수를 나타내며, b 와 d 는 각각 기하급수적인 성장과 감소의 특징적인 시간입니다. 무어 방정식은 유기체가 나이가 들면서 속도와 자발적 활동과 같이 겉보기에 관련이 없어 보이는 양의 궤적을 예측하는 것으로 나타났습니다. 종은 무어 방정식에 의해 지정된 곡선의 모양으로 특징지을 수 있습니다. 즉, 일부 종은 다른 종보다 더 빨리 정점에 달할 수 있습니다21.

프로토콜

1. 데이터 수집을 위한 C. elegans 준비

  1. 선충이 먹을 수 있도록 각 선충류 성장 배지(NGM) 한천 플레이트에 OD600이 함유된 대장균 0.5mL를 넣습니다. 한천의 각 접시에서 대장균 이 마를 때까지 기다리십시오.
  2. 연령 조절을 목적으로 C. elegans의 새로운 플레이트를 만들기 위해 생물학적 재료 공급업체로부터 C. elegans의 대조 플레이트를 구입하십시오.
  3. 분젠 버너 또는 이와 동등한 불꽃을 사용하여 백금 픽을 소독합니다. 해부 현미경을 사용하여 5-10마리의 성체 야생형 C. elegans 를 선택하여 각 플레이트에 넣습니다.
  4. 선충이 접시에서 성충을 골라내기 전에 4-5시간 동안 알을 낳도록 하십시오. 남은 선충류를 배양하고 원하는 날에 따도록 합니다.
  5. 데이터 수집 당일, 큐벳 상단을 추가할 때 유출을 방지하기 위해 큐벳 상단 바로 아래에 10mm x 10mm x 45mm 크기의 4.5mL 광학 등급 석영 큐벳을 실온 증류수를 채웁니다. 선충 2-3개를 골라 큐벳에 부드럽게 넣습니다. 선충류가 큐벳에 들어가면 옆으로 눕혀 레이저 빔의 웜을 쉽게 정렬합니다. C. elegans 는 바닥을 향해 떠 있을 수 있지만 물에 완전히 잠기는 한 수영 기복을 계속합니다5.

2. 데이터 수집

참고: 시계열을 기록하기 위한 아래 절차는 연령의 불확실성을 최소화하기 위해 매일 거의 같은 시간에 구현되어야 합니다.

  1. 이전 기사22에서 설명한 실험을 설정합니다. 두 개의 거울이 있는 잠망경을 만들고 큐벳을 두 개의 거울 사이에 옆으로 배치하여 나중에 레이저 빔의 중앙에 웜을 더 쉽게 배치하는 작은 수정을 구현합니다. 카메라 대신 회절 패턴에 PD를 배치합니다(그림 1).
    1. 거울을 수직으로 정렬하여 앞서 언급한 잠망경을 만듭니다.
      알림: 이것은 완료해야 하는 유일한 레이저 정렬 작업입니다.
  2. HeNe(헬륨 네온) 레이저를 켜고 열 평형에 도달할 때까지 예열합니다(~15분).
  3. 디지털 오실로스코프를 시작하여 데이터 수집을 시작합니다. 디지털 오실로스코프에서 시간 간격 및 메모리 버퍼 의 매개변수를 설정합니다. 시간 간격 을 100초로 설정하고 초당 최소 100킬로샘플(kS)의 메모리 버퍼 를 구현합니다.
  4. 데이터 수집 속도의 경우 분해능 을 1kHz로 설정하고 진폭을 분해하려면 12비트로 설정하면 작은 규모에서 복잡성을 구별하는 데 도움이 됩니다23.
  5. 자동 AC 오프셋을 사용하여 시계열을 0볼트의 중앙에 배치하여 강도 진동을 중앙에 두도록 오실로스코프를 설정합니다.
  6. 2-3개의 선충류를 골라 증류수를 채운 큐벳에 부드럽게 넣어 레이저 빔에서 최소 1마리의 벌레를 더 쉽게 찾아 중앙에 배치할 수 있습니다. 큐벳을 흔들지 마십시오.
  7. 잠망경에 2-3마리의 선충류가 들어 있는 큐벳을 놓고 레이저 빔의 중앙에 1마리의 선충류를 놓습니다.
    1. C. elegans가 레이저 빔의 중심에 있을 때 잠망경에서 약 50cm 떨어진 곳에 원거리 회절 패턴이 형성됩니다.
  8. C. elegans가 레이저 빔을 통과할 때 원거리 회절 패턴에 포토다이오드를 배치합니다. PD가 회절 패턴의 중심에서 벗어나 중앙 최대값(투과된 레이저 빔)이 아닌 회절광을 포착하도록 합니다.
  9. LLE를 안정적으로 계산하기 위해 최소 10초의 데이터를 수집합니다. 즉, 안정적인 LLE를 계산하려면 최소 10,000개의 데이터 포인트가 필요합니다.
    참고: 데이터 포인트가 적을수록 인위적으로 변동하는 LLE가 발생합니다.
  10. 위의 데이터 수집을 매일 9-15회 반복합니다. 하루 중 같은 시간에 3-12일 연령대의 데이터를 수집합니다.

3. 데이터 분석

참고: 데이터 분석을 위해 시계열은 지연 플롯16 을 사용하여 위상 공간에 포함된 다음 궤적의 발산을 계산하여 LLE를 추정합니다.

  1. 시계열을 주의 깊게 조사하여 선충이 레이저 빔 내부에서 자유롭게 헤엄치는 시계열의 섹션을 선택하십시오. 그림 2A 는 최소 20초의 연속 신호가 있는 실행 가능한 시계열을 보여줍니다.
  2. 낮은 신호 대 잡음비에 대한 시계열을 선별합니다(그림 2B). 큐벳에 웜이 없는 시계열을 기록하여 소음 수준을 설정합니다. 진폭뿐만 아니라 시계열의 특징은 노이즈 레벨의 두 배 이상이어야 합니다.
  3. 관련 시계열에서 포화된 데이터를 제외합니다(그림 2C). 유용한 정보를 추출하기에는 너무 많은 데이터가 포화 상태인 경우 위의 데이터 수집 섹션으로 돌아가서 2.7.1-2.9단계를 반복하고 포토다이오드를 중앙 최대값에서 멀리 이동하여 강도 수준을 조정합니다.
  4. 에 의해 주어진 평균 빈도를 결정합니다.
    figure-protocol-1(2)
    여기서 f 는 주파수이고 P 는 전력 스펙트럼입니다(그림 3). 이것은 FFT(Fast Fourier Transform)를 사용한 다음 주파수를 평균화하여 계산적으로 수행할 수 있습니다. 많은 계산 프로그램에는 데이터 세트의 평균 빈도를 계산하는 함수가 내장되어 있습니다.
  5. 시간 지연 방법을 사용하여 위상 공간의 토폴로지를 재구성합니다. 시계열 X를 선택하고 시계열을 시간 지연 τ 만큼 지연시켜 궤적을 해결합니다(그림 4). 최적의 시간 지연은 상호 정보(MI)24에서 첫 번째 로컬 최소값을 식별함으로써 결정됩니다.
    figure-protocol-2(3)
    여기서 N은 점의 수이고, Xi는 시계열 X의 점이며, Xi+τ는 동일한 시계열의 시간 지연 지점입니다. p(Xi)는 점 Xi가 발생할 확률이고 p(Xi+τ)는 Xi+τ가 발생할 확률입니다. p(Xi, Xi+τ)는 시계열 Xi와 지연된 시계열 Xi+τ가 일치하는 공동 확률25입니다.
  6. 그림 5와 같이 0.140초에서 0.240초(140에서 240개의 데이터 포인트) 사이의 MI 그래프에서 첫 번째 최소값을 식별합니다. 지연에 대한 정확한 숫자는 없습니다. 주요 목적은 발산을 결정할 수 있을 만큼 위상 궤적을 해결하는 것입니다.
  7. 시계열 Xi와 그 지연된 버전을 이전 단계에서 MI를 최소화하여 결정한 대로 τ로 사용합니다.
  8. 임베딩 차원을 결정합니다. 가장 적합한 임베딩 차원은 FNN(false Near Neighbors)이 최소한 안정화되는 가장 낮은 차원입니다(그림 6)26. Abarbanel et al.27,28이 개발한 방법을 사용하십시오.
  9. Rosenstein 알고리즘29 를 사용하여 위상 공간에서 동적 시스템을 재구성하고 시간 경과에 따른 인근 궤적의 발산을 추적합니다. 특히 MATLAB 포럼30에 게시된 Merve Kizilkaya의 MATLAB 루틴을 활용하여 LLE를 계산합니다. 이 루틴에는 시계열, 어트랙터의 평균 주파수, 시간 지연 τ, 시계열에 대한 데이터 수집 속도 및 발산에 맞는 간격 입력이 필요합니다.
  10. 9-15개의 데이터 세트에 대해 위의 절차를 반복하여 LLE 추정치의 불확실성을 줄입니다. 매일 LLE의 평균을 구한 다음 무어 곡선을 피팅합니다(그림 7).

결과

LLE 대 연령을 측정하는 동안 어트랙터의 주파수, MI 및 FNN과 같은 복잡한 동적 시스템과 관련된 다른 양도 측정했습니다. 3일에서 12일까지 연령 연구 데이터를 수집했습니다. 벌레는 생후 3일이 되기 전에 너무 작고 미성숙하여 수동으로 다루지 못합니다. 12일이 되면 벌레는 노화되고 신경 회로가 악화되고 신경계가 쇠퇴하기 때문에 거의 움직이지 않습니다31.

Rosenstein 알고리즘은 포함된 궤적의 모든 점에 대해 적어도 하나의 평균 주기 간격으로 인접한 점을 선택합니다. 알고리즘은 인접한 두 궤적의 두 점 사이의 분리 벡터(그림 8)를 시작으로 발산의 진화를 추적합니다. 궤적의 분리는 시스템(32)의 혼란스러운 특성으로 인해 처음에는 기하급수적으로 증가하고, 그 다음에는 궤적이 경계가 있기 때문에 정체된다. 시간 경과에 따른 평균 발산의 로그를 플로팅하면 궤적의 분리를 추적합니다(그림 8 및 그림 9). 선형 최소 제곱의 기울기는 평평해지기 전에 곡선의 첫 번째 부분에 적합하므로 시스템의 LLE33에 대한 신뢰할 수 있는 추정치가 됩니다. 불확실성은 최소 제곱 적합과 적합 자체에 대한 범위를 선택하는 데 포함됩니다. 초기 조건에 대한 민감도는 어트랙터에서 발산이 추적될 때 선형 적합 영역이 진동 동작을 나타내도록 합니다. 각 연령 그룹에 대해 평균화된 웜 간의 생물학적 변이는 이전 간행물10에서 나타난 바와 같이 단일 시험에 대한 선형 LLE 적합도의 가변성을 능가합니다.

시계열(그림 2A)은 최고점과 최저점이 수영 빈도, 모양 및 방향의 변화와 같은 웜 이동의 측면과 일치한다는 것을 보여줍니다. 시계열은 비주기적입니다. 시계열의 진동은 결코 반복되지 않지만 강도는 제한되어 있습니다. 주파수는 일정하지만 약간 변동하며 주파수의 복잡성과 경계성을 나타냅니다. 그림 10 은 벌레가 나이가 들면서 수영 빈도가 감소하는 추세를 보여주며, 이는 12일째에 분해됩니다. 대부분의 벌레의 평균 빈도는 12일째 이후에 점프합니다. 이것은 신경 회로가 파괴되었다는 신호일 가능성이 높습니다. 대조적으로, MI의 첫 번째 최소값에 의해 결정되는 평균 시차 τ는 주기가 길어지기 때문에 인구가 고령화됨에 따라 증가합니다(그림 11).

우리의 경우 MI는 지연된 두 시계열 간의 통계적 중복을 나타냅니다. MI가 최소이면 궤적 간의 겹침이 최소화됩니다. 이론적으로 혼돈의 궤적은 결코 겹치지 않습니다. 그러나 실제로는 제한된 유효 숫자와 일부 실험적 노이즈로 인해 일부 점이 일부 허용 오차 내에서 겹칠 것입니다24. MI를 최소화하여 중복 가능성을 최소화하는 것을 목표로 합니다. 최소화된 MI와 훨씬 더 큰 MI의 차이는 그림 4에 나와 있습니다.

임베딩 차원은 FNN(false Nearest Neighbors)에 의해 결정됩니다. FNN의 수는 임베딩 차원 3 또는 4 주변의 FNN 수가 5% 이하로 평평해집니다. 그림 6에서 선충류의 나이는 벌레의 수명이 거의 끝나는 12일째를 제외하고는 매복 치수에 영향을 미치지 않습니다.

LLE의 궤적은 5일에 정점을 찍는 무어 곡선(그림 7)을 따르며, 이는 C. elegans가 새로 성숙할 때 가장 예측할 수 없는(그리고 아마도 복잡한) 이동이 발생함을 나타냅니다. 그림 7에서 3일에서 12일까지의 LLE 그래프는 5일에 최고점을 찍고 5일 이후에 감소하는 선형 증가를 보여줍니다. 그림 10의 오차 막대는 평균 4,34의 표준 편차를 나타내며 생물학적 종 내의 다양성 및 LLE 추정을 포함한 여러 요인을 반영합니다. 웜 간의 변동은 LLE 피팅 루틴의 불확실성을 능가하는 경향이 있습니다. 5일과 7일과 같이 요일 간의 변동성은 겹치지 않으므로 데이터를 명확하게 구별할 수 있습니다. 나이에 따른 LLE의 추세는 다른 살아있는 유기체의 기억력과 이동에 대한 연령 영향을 설명하는 이전 연구의 무어 방정식18과 밀접하게 일치합니다.

표 1의 LLE는 일관적이며 나이가 들면서 천천히 증가한 다음 감소하는 추세를 보여줍니다. 이 값은 DOD10 및 비디오 분석34,35를 사용하여 이전에 발표된 결과와 일치합니다.

figure-results-1
그림 1: 실험적 원거리 회절 설정(축척에 맞게 그려지지 않음). 스티어링 미러는 잠망경을 형성합니다. C. elegans 가 들어 있는 큐벳은 스티어링 미러 사이에 배치됩니다. 레이저 빔은 웜에 의해 회절되고 두 번째 스티어링 미러를 통해 PD를 향해 이동합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 강도 시계열. DOD 시계열은 선충이 레이저 빔에서 움직일 때 강도 변동을 보여주며 (A) 데이터 분석을 위한 실행 가능한 시계열입니다. (B) 이 시계열은 11초와 30초 사이의 간격이 신호를 나타내지 않음을 나타냅니다. 더 짧은 정상 진폭은 주로 산란광에서 발생하므로 시스템의 소음 수준을 표시할 뿐입니다. (C) 이 시계열에는 포화 데이터의 몇 가지 인스턴스가 있습니다. 각 데이터 포인트는 그래프에서 절제되고 최저점에서 평평해지는 중요한 스파이크를 나타냅니다. 이 예에서 스파이크는 45초에서 50초 사이에 강도가 -100에서 100 AU 사이로 확장됨에 따라 평평해집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 전력 스펙트럼. 전력 스펙트럼은 약 0.95Hz에서 최대값을 보여줍니다. 어트랙터의 궤적에 있는 주파수가 이동하고 정확히 반복되지 않기 때문에 주파수가 분산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 9일 된 웜의 동일한 시계열에 대한 두 개의 서로 다른 지연이 있는 3D 지연 플롯에 포함된 실험 데이터. 이 시계열은 이동이 혼돈 이론과 일치하는 제한된 어트랙터임을 보여줍니다. (A) 궤적은 첫 번째 로컬 최소값(MI ≈ 2.11)을 사용하여 해결되어 약 0.183초(183개 데이터 포인트)의 지연을 제공합니다. 눈에 보이는 궤적 교차는 2차원 공간에 투영된 결과입니다. (B) 이 시차 플롯은 점이 구별할 수 없고 발산을 나타내지 않기 때문에 0.002초(2개의 데이터 포인트, (MI > 7))의 부적절한 시차로 인해 해결되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 상호 정보의 기하급수적인 감소. MI의 첫 번째 최소값은 위상 궤적을 해결하기 위해 이 특정 경우에 0.161초(161개 데이터 포인트)에서 데이터 세트의 지연을 결정합니다. 이 지연은 시계열 값을 이동하여 위상 공간에서 어트랙터를 재구성합니다. 지연은 궤적을 해결하기에 충분한 첫 번째 최소값에 가까워야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 각각 3일, 5일, 9일, 12일의 평균 임베딩 차원. 임베딩 차원의 확대 보기는 각 날짜의 임베딩 차원 간의 구체적인 차이를 표시하는 데 사용됩니다. 12일차에만 눈에 띄는 차이가 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 3일에서 12일 사이에 추정된 LLE의 평균. LLE는 5일에 정점에 도달합니다. 최대 5일 동안 선충류는 미성숙에서 성숙으로의 전환과 일치하는 성장 궤적을 나타냅니다. 그 5일 후에 선충류는 발산이 감소하는 것을 경험합니다. 불확실성은 웜 간의 변동이 지배하는 평균의 표준 편차를 측정한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-8
그림 8: 카오스 이론에 존재하는 발산에 대한 묘사. 양수 LLE는 초기에 가까운 궤적이 시간이 지남에 따라 발산하게 만듭니다. t는 시간 간격, d는 발산, x(t)는 위상 공간의 점입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-9
그림 9: 로그 척도의 위상 궤적 발산. 추정된 LLE는 0.96초에서 1.01초 사이의 어트랙터의 경계로 인해 평평해지기 전에 상승 영역에서 선형 적합(1.08 1/s)의 기울기입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-10
그림 10: 각 날의 평균 평균 빈도. 12일차 평균은 이동을 유도하는 신경학적 신호의 상당한 변화를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-11
그림 11: 각 일의 평균 지연. MI는 평균적으로 3일과 6일 사이에 더 낮은 시차를 유발하는 반면, 7일과 12일 사이에는 더 높은 평균 시차가 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

연령(일)데이터 세트 수LLE(1/초)평균의 표준 편차(1/s)
3111.140.02
4151.200.03
5131.340.03
6111.230.02
7101.160.03
8121.130.02
9121.070.02
1091.000.03
1190.960.03
1290.920.02

표 1: 연령 연구의 각 날짜에 대한 데이터 세트 수 및 평균 LLE. LLE는 DOD를 통해 수집된 이전 데이터와 일치하며 그림 7에서 무어 곡선의 증가 및 감소 궤적을 보여줍니다. 매일 데이터에 대해 9-15개의 데이터 세트가 수집되었습니다. 데이터 세트는 근육 저하 및 신경 쇠퇴의 특성으로 인해 벌레가 나이가 들면서 이동이 감소하는 추세였습니다.

토론

우리는 수영 빈도, 상호 정보(MI) 및 거짓 최근접 이웃(FNN)과 같은 매개변수에 의해 지원되는 다양한 연령에 걸쳐 LLE를 평가하여 C. elegans 이동을 분류했으며, 각 매개변수는 시스템의 동적 특성에 대한 추가 통찰력을 제공합니다. 이 시스템의 결정론적 및 비선형 특성은 대리 데이터 방법과 반복 플롯36을 사용하여 연구됩니다.

DOD를 사용하여 노화가 운동에 미치는 영향을 정량화하는 것은 기존 현미경을 보완하는 기술입니다. 이는 미세한 종을 육안으로 검사하는 것을 대신할 수 없습니다. 이는 전통적인 기술을 넘어 이동을 정량화하는 일관되고 효율적인 방법을 제공합니다. DOD는 비디오 분석을 우회하기 때문에 회절이 강도 분포를 푸리에 공간에 직접 매핑하기 때문에 계산 워크로드의 일부는 본질적으로 광학 기술에 의해 관리됩니다. 회절 중 광장의 중첩은 전체 미세한 종을 추적합니다. 이상적으로 해상도는 사용된 빛의 파장 λ(이 경우 632nm)에 의해 결정됩니다. 파장의 일부만 이동해도 강도가 변경됩니다. 이러한 이유로 해상도는 광검출기의 범위와 해상도, 레이저의 출력에 의해 좌우됩니다. 예를 들어, 검출기가 Vmin과 Vmax의 두 전압 사이에서 변동하는 시계열 신호를 감지하고 분해능이 n비트인 경우(프로토콜 단계 2.4 참조) 최대 분해능은 λ/n 또는 이 경우 632nm/12입니다. 이론적으로 이 방법은 모양이 변하는 모든 신체에 적용될 수 있습니다. 그러나 DOD는 적절한 파장을 가진 저렴한 레이저를 쉽게 구할 수 있고 비용 효율적이기 때문에 미세한 종에 특히 적합합니다.

명확하고 일관된 회절 패턴을 보장하려면 웜이 헤엄칠 때 주의 깊게 추적하고 레이저 빔 중앙에 유지해야 합니다. 웜이 정렬되지 않으면 신호가 저하되거나 완전히 손실될 수 있습니다. 포토 다이오드 포화 문제를 완화하고 확률 노이즈를 줄이기 위해 중성 밀도 필터를 사용하여 레이저 강도를 감쇠합니다. 이 필터링은 포토다이오드의 동적 범위를 유지하고 기록된 시계열에서 과포화를 방지하는 데 도움이 됩니다. 그럼에도 불구하고 과도한 포화 또는 낮은 신호 대 잡음비를 나타내는 데이터 세그먼트는 데이터 품질을 유지하기 위해 최종 분석에서 제외됩니다.

수영 주파수의 드리프트는 혼돈의 초기 지표인 연속적인 주파수 스펙트럼을 생성합니다13. 평균 주파수와 MI 사이의 반비례 관계는 주기의 약 1/8이 정현파 파형을 분석하는 데 필요한 해상도와 유사하게 LLE를 추정하기에 충분한 정확도로 궤적을 해결한다는 것을 시사합니다.

그림 6의 임베딩 차원 3과 4 주변의 FNN 비율이 낮다는 것은 C. elegans 이동과 광학 시스템 모두에서 낮은 노이즈 수준을 의미합니다. 그러나 12일 된 벌레에서 FNN의 비율은 약간 증가하지만 5% 미만으로 유지되는데, 이는 반드시 실제 매립 차원의 증가로 인한 것은 아니지만 노화 유기체의 신경 저하로 인한 운동 신호의 노이즈 증가 때문일 가능성이 높습니다34,37.

발달 전반에 걸쳐 LLE의 변화는 이동의 혼돈 정도가 나이에 따라 달라지며 무어 방정식의 예측과 밀접하게 일치한다는 것을 보여줍니다. 생애 초기에 LLE의 피크는 부모의 보살핌 없이 신경근 기능을 빠르게 발달시켜야 하는 C. elegans와 같은 R-선택 종의 특성과 일치합니다. 특히, 장거리 신경 연결의 70%는 벌레가 성체 크기의 20%에 불과할 때 형성됩니다37,38. 대조적으로, 인간과 같은 K-선택 종은 부모의 투자에 의해 지원되는 느린 신경학적 발달을 나타내므로 지연되지만 더 복잡한 운동 패턴을 초래합니다. 이러한 차이는 종 간 피크 LLE의 타이밍에 반영됩니다.

C. elegans의 짧은 수명주기는 약 14일이며 4개의 유충 단계2에 걸쳐 처음 이틀 동안 빠르게 발달하므로 이동의 최대 복잡성을 연구하는 데 특히 적합합니다. 이전 연구는 운동의 연령 관련 변화를 설명하기 위해 신경 구조 쇠퇴에 초점을 맞추었지만34,39, 우리의 연구는 이러한 물리적 변화를 시스템의 근본적인 혼란 역학과 연결합니다. DOD와 비선형 역학의 통합은 여러 길이 척도에 걸쳐 정밀한 정량적 특성화를 가능하게 하여 행동의 신경 동인에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 발달 단계 전반에 걸쳐 일관되게 양성 LLE는 운동 시스템에서 혼란스러운 행동의 존재를 강력하게 뒷받침합니다.

이 연구는 C. elegans의 연령 관련 행동 변화를 조사하기 위한 새로운 방법론적 프레임워크를 제공하여 운동 쇠퇴의 생물학적 및 역학적 상관관계에 대한 현재의 이해를 확장합니다. 또한 연령 관련 신경학적 변화에 대한 민감한 바이오마커로서 LLE의 사용을 검증하고 LLE가 노화에 의해 영향을 받는 운동 역학의 신뢰할 수 있는 정량적 측정임을 보여줍니다.

DOD는 미세한 유기체의 이동과 혼돈을 정량화하기 위한 강력하고 비침습적인 방법으로, 비디오 분석을 대체하기보다는 보완하는 것으로 가장 잘 간주됩니다. 현재 구현된 실험에서는 어린 벌레가 너무 작아서 신뢰할 수 있는 회절 신호를 생성하지 못하기 때문에 선충류가 최소 3일 이상 생후 되어야 합니다. 회절 패턴의 단일 지점에서 추출된 1차원 시계열은 필연적으로 공간 정보를 압축하여 유기체의 신체를 따라 국부적인 역학을 모호하게 만들 수 있습니다. 다중 채널 접근 방식은 회절장 전반에 걸쳐 매개변수 일관성을 확인하여 이러한 한계를 해결하는 데 도움이 되지만 미묘한 공간 이질성은 여전히 간과될 수 있습니다. LLE의 정확한 추정은 충분히 길고 노이즈가 없는 시계열을 얻는 데 달려 있습니다. 빔 밖으로 웜이 움직이거나 환경 변동과 같은 실질적인 문제는 데이터 품질을 저하시키고 LLE 값에 대한 신뢰도를 떨어뜨릴 수 있습니다. 모든 실험 방법과 마찬가지로 LLE 피팅 중 측정 노이즈와 주관적인 결정은 단일 측정의 경우 일반적으로 약 15% 이내로 유지되는 추가적인 불확실성을 초래합니다.

향후 작업은 다양한 실험 조건에서 LLE를 측정하여 모델링된 LLE와 측정된 LLE를 비교하는 데 중점을 둘 것입니다. 이는 시간이 지남에 따라 복잡한 운동 제어가 어떻게 나타나고 악화되는지에 대한 이해를 심화할 수 있는 예측 신경학적 모델의 개발을 촉진할 것입니다. 우리는 또한 이 생물학적 시스템의 결정론적 특성을 다시 검증하기 위해 엔트로피-복잡성 평면을 계산하는 것과 같은 다른 계산 방법을 탐색함으로써 연구 결과의 일관성을 계속 탐구할 것입니다40.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

재정 지원을 해준 Vassar College와 Lucy Maynard Salmon Research Fund에 감사드립니다. 또한 이 연구의 모든 단계에서 통찰력과 도움을 제공해 주신 Kathleen Susman 박사, Juan Merlo 박사 및 Susannah Zhang 박사에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
전면 알루미늄 미러 2개토를랩PF10-03-F01
632nm HeNe 레이저뉴포트LGX1어떤 적색광 레이저
빈 페트리 접시캐롤라이나971632선충 성장 한천을 부어 넣는 플라스틱 페트리 접시
대장균 K12, 살아있는 박테리오파지 숙주캐롤라이나124500C. elegans의 먹이원으로 사용되었으며; OD600
라이카 S9i 현미경라이카 마이크로시스템즈LED2500해부 현미경
라이터빅 라이터스각 벌레를 따기 전후로 곡괭이를 멸균하는 데 사용되는 모든 종류의 살균 도구
MATLAB수학 작품Merve Kizilkaya가 만든 MATLAB 포럼의 Rosenstein 알고리즘-루틴
선충 성장 한천캐롤라이나173520준비된 배지 병, 135 mL
광다이오드토를랩DET36A350-1100 nm Si 바이어스 검출기
피코스코프5204피코 테크놀로지PP376PC 오실로스코프 www.picotech.com
플래티넘 픽C. elegans를 퍼내는 데 사용되었고; 유리 핸드헬드 피스와 플래티넘 스쿱이 달린 작고 수제 픽입니다.
쿼츠 큐벳스타르나 셀21/G/5증류수를 채우면 C. elegans를 그 안에 넣으세요

참고문헌

  1. Zhen, M., Samuel, A. D. C. elegans locomotion: small circuits, complex functions. Curr Opin Neurobiol. 33, 117-126 (2015).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , http://www.wormbook.org (2015).
  3. Gjorgjieva, J., Biron, D., Haspel, G. Neurobiology of Caenorhabditis elegans locomotion: where do we stand. Bioscience. 64 (6), 476-486 (2014).
  4. Boyle, J. H. C. elegans locomotion: an integrated approach. , https://core.ac.uk/download/pdf/43059.pdf (2009).
  5. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20982-20987 (2008).
  6. Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J Exp Biol. 210 (13), 2383-2389 (2007).
  7. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), e198(2008).
  8. Barbulescu, R., Mestre, G., Oliveira, A. L., Silveira, L. M. Learning the dynamics of realistic models of C. elegans nervous system with recurrent neural networks. Sci Rep. 13 (1), 467(2023).
  9. Sarma, G. P., et al. OpenWorm: overview and recent advances in integrative biological simulation of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1758), 20170382(2018).
  10. Zanetti, R. F., Canavan, K. L., Zhang, S. G., Magnes, J. Multichannel measurements of C. elegans largest Lyapunov exponents using optical diffraction. Appl Opt. 62 (29), 7812-7818 (2023).
  11. Magnes, J., et al. Live C. elegans diffraction at a single point. Open J Biophys. 8, 155-162 (2018).
  12. Lorenz, E. N. The predictability of hydrodynamic flow. Trans N Y Acad Sci Ser II. 25 (4), 409-432 (1963).
  13. Magnes, J., et al. Chaotic markers in dynamic diffraction. Appl Opt. 59 (22), 6642-6650 (2020).
  14. Strogatz, S. H. Nonlinear dynamics and chaos: with applications to physics, biology, chemistry, and engineering. , Westview Press. Boulder, CO. (2001).
  15. Nolte, D. D. Introduction to modern dynamics: chaos, networks, space and time. , Oxford University Press. Oxford. (2015).
  16. Takens, F. Detecting strange attractors in turbulence. , Springer. Berlin. (1981).
  17. Murakami, H., et al. Manipulation of serotonin signal suppresses early phase of behavioral aging in Caenorhabditis elegans. Neurobiol Aging. 29 (7), 1093-1100 (2008).
  18. Marck, A., et al. Age-related changes in locomotor performance reveal a similar pattern for Caenorhabditis elegans, Mus domesticus, Canis familiaris, Equus caballus, and Homo sapiens. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 72 (4), 455-463 (2017).
  19. Cohen, N., Sanders, T. Nematode locomotion: dissecting the neuronal-environmental loop. Curr Opin Neurobiol. 25, 99-106 (2014).
  20. Moore, D. H. A study of age group track and field records to relate age and running speed. Nature. 253 (5489), 264-265 (2020).
  21. Varier, S., Kaiser, M. Evolution and development of brain networks: from Caenorhabditis elegans to Homo sapiens. Network. 22 (1-4), 143-147 (2011).
  22. Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction. J Vis Exp. (68), e4412(2012).
  23. Tzepos, D., Trader, O., Magnes, J. 16th Chaotic Modeling and Simulation International Conference, , https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-031-60907-7 (2024).
  24. Fraser, A., Swinney, H. Independent coordinates for strange attractors from mutual information. Phys Rev A. 33, 1134-1140 (1986).
  25. Starmer, J. The StatQuest illustrated guide to machine learning!!!: triple bam. , StatQuest Publications. (2022).
  26. Kizilkaya, M. MATLAB routine. , https://www.mathworks.com/matlabcentral (2020).
  27. Abarbanel, H. D. I., Kennel, M. B. Local false nearest neighbors and dynamical dimensions from observed chaotic data. Phys Rev E. 47, 3057-3068 (1993).
  28. Kizilkaya, M. False nearest neighbor algorithm. , https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37239-minimum-embedding-dimension (2020).
  29. Rosenstein, M. T., Collins, J. J., De Luca, C. J. A practical method for calculating largest Lyapunov exponents from small data sets. Physica D. 65 (1-2), 117-134 (1993).
  30. Kizilkaya, M. Largest Lyapunov exponent with Rosenstein's algorithm. , https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/38424-largest-lyapunov-exponent-with-rosenstein-s-algorithm (2020).
  31. Liu, J., et al. Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans. Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).
  32. Zhang, S. G., Singhvi, A., Susman, K. M., Hastings, H. M., Magnes, J. Dynamic markers for chaotic motion in C. elegans. Nonlinear Dyn Psychol Life Sci. 26 (1), 21-43 (2022).
  33. Giordano, N. J., Nakanishi, H. Computational physics. , Upper Saddle River, NJ. (2006).
  34. Olsen, A., Vantipalli, M. C., Lithgow, G. J. Using Caenorhabditis elegans as a model for aging and age-related diseases. Ann N Y Acad Sci. 1067 (1), 120-128 (2006).
  35. Ahamed, T., Costa, A. C., Stephens, G. J. Capturing the continuous complexity of behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat Phys. 17 (2), 275-283 (2021).
  36. Zhang, S. G., Singhvi, A., Susman, K. M., Hastings, H. M., Magnes, J. Dynamic markers for chaotic motion in C. elegans. Nonlinear Dyn Psychol Life Sci. 26 (1), 21-43 (2022).
  37. Kennel, M., Brown, R., Abarbanel, H. Determining embedding dimension for phase-space reconstruction using a geometrical construction. Phys Rev A. 45, 3403-3411 (1992).
  38. Varier, S., Kaiser, M. Evolution and development of brain networks: from Caenorhabditis elegans to Homo sapiens. Network. 22 (1-4), 143-147 (2011).
  39. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  40. Rosso, O. A., Larrondo, H. A., Martin, M. T., Plastino, A., Fuentes, M. A. Distinguishing noise from chaos. Phys Rev Lett. 99 (15), 154102(2007).

재인쇄 및 허가

태그

Caenorhabditis elegans의 운동의 연령 의존적 역학: Lyapunov 지수 분석
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.