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방법 논문

3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 후각 회로 뉴런의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징

1.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68956

⸱

2025년 10월 31일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 고정을 위해 국소 조직 접착제를 사용하여 초파리 유충 후각 뉴런에 대한 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 안정성을 향상시켜 신뢰할 수 있는 생체 내 및 생체 외 실험을 용이하게 합니다. 맞춤형 R 스크립트는 칼슘 신호를 분석하여 상세한 신경생리학적 연구를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

초록

칼슘 이미징은 신경 역학과 뇌 기능을 연구하는 데 중요합니다. 그러나 초파리 유충의 칼슘을 이미징하는 현재의 방법은 모션 아티팩트와 특수 장비 요구 사항으로 인해 어렵습니다. 여기에서는 샘플을 고정하기 위한 국소 조직 접착제를 사용하여 3령 초파리 유충에서 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징을 모두 수행하기 위한 실용적이고 저렴한 방법을 제시합니다. 또한 맞춤형 R 스크립트와 데이터 분석을 위한 프레임워크를 제공하여 다양한 실험 조건에서 칼슘 변화를 쉽게 측정할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하여 우리는 최소한의 운동 아티팩트로 한 쌍의 유충 CNS 뉴런에서 칼슘 과도 현상을 성공적으로 기록하여 준비 전반에 걸쳐 재현성을 입증했습니다. 이 방법은 표준 스피닝 디스크 공초점 시스템과 호환되며 DIY 또는 상업용 2광자 설정에 적용할 수 있으므로 다양한 자원을 갖춘 실험실에서 접근할 수 있습니다. 이 접근법은 유충 칼슘 이미징 연구에 대한 접근성을 높일 수 있으며 냄새와 같은 외부 자극과 신경 조절제와 같은 내부 자극의 효과를 모두 조사하는 데 적용될 수 있습니다.

서론

칼슘 이온은 신경 활동을 조절하고 자극에 대한 세포 반응을 유도하는 데 중추적인 역할을 하기 때문에 뉴런의 칼슘 역학을 이해하는 것은 신경 신호 전달과 뇌 기능의 기본 메커니즘을 밝히는 데 중요합니다. 신경 칼슘 역학은 칼슘 이미징을 통해 모니터링할 수 있으며, 이는 초파리 유충을 포함한 광범위한 유기체에 걸쳐 칼슘 매개 신호 전달에 대한 실시간 통찰력을 제공합니다. 초파리 유충은 행동의 기본 회로 기능을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템으로 부상하고 있습니다. 그것은 완전한 시냅스 분해능 뇌 커넥톰이 생성된 단 세 가지 유기체 중 하나입니다1. 유충은 전체 뇌 및 단일 뉴런 수준 모두에서 뉴런의 이미징 및 조작을 가능하게 하는 다양한 정교한 도구를 사용할 수 있습니다 2,3.

칼슘 이미징을 통해 초파리 유충 뉴런의 칼슘 역학을 측정하는 능력은 신경과학 연구를 발전시키는 데 매우 중요했습니다4. 칼슘 이미징의 최근 발전으로 유충5의 단일 시냅스 수준에서 칼슘 역학을 자유롭게 움직이는 유충6의 다중 신경기록에 이르기까지 측정할 수 있게 되었습니다. 칼슘 이미징은 전체 유충 4,7,8,9의 자연적인 생리학적 맥락 하에서 칼슘 사건이 포착되는 생체 내에서 수행될 수 있으며, 또는 시뮬레이션된 생리학적 조건10 하에서 보존된 해부된 유충 조직에서 칼슘 사건이 기록되는 생체 외에서 수행될 수 있다. 전반적으로 연구자들은 초파리 유충에서 칼슘 이미징 방법의 다양한 반복을 사용하여 신경 회로, 감각, 학습 및 기억, 행동의 기본 메커니즘을 밝혀냈습니다 8,11,12,13,14,15,16,17 . 그러나 유충 칼슘 이미징 연구는 특수 장비의 필요성과 모션 아티팩트로 인한 데이터 해석 문제로 인해 제한적입니다.

여기에서는 3령 초파리 멜라노가스터 유충의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징 모두에 대한 비용 효율적이고 쉽게 구현할 수 있는 방법론을 소개합니다. 우리는 억제성 후각 회로뉴런인 Keystone-LN에서 생체 내 칼슘 이미징을 보여주기 위해 전체 유충 준비 내에서, 그리고 생체 외 칼슘 이미징을 보여주기 위해 해부된 유충 뇌에서 칼슘 역학을 이미지화합니다. 전체 유충과 해부된 뇌는 이미징 조건에서 약 10-15분 동안 생존 가능하고 반응성을 유지하므로 샘플당 여러 자극 시험을 획득할 수 있습니다. 조직 생존력을 유지하고 실험적 변동성을 줄이면서 전체 유충 또는 조직 샘플을 고정하는 문제를 해결하기 위해 생체 적합성 시아노아크릴레이트 국소 조직 접착제인 GLUture의 사용을 최적화했습니다.

아가로스 포매 또는 고정과 같은 전통적인 유충 고정 방법과 비교할 때, 이 접착제 기반 접근법은 조직 생존력을 보존하면서 모션 아티팩트를 줄입니다20,21; 2광자 이미징 시스템에 비해 회전 디스크 설정은 계측 비용을 낮추고 자원이 제한된 실험실의 접근성을 향상시킵니다. 마지막으로, 데이터 분석을 위해 맞춤 개발된 R 스크립트와 결합된 간단한 이미징 접근 방식을 설명합니다. 우리의 접근 방식은 유충 칼슘 영상 연구에 대한 접근성을 높일 수 있으며 냄새와 같은 외부 자극과 신경 조절제와 같은 내부 자극의 효과를 모두 조사하는 데 적용될 수 있습니다.

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프로토콜

1. 칼슘 이미징을 위한 3령 초파리 유충 준비

  1. 표준 플라이 푸드( 재료 표 참조)에서 25°C, 50-60% 상대 습도(RH) 및 12시간의 빛/암흑 주기로 파리를 유지합니다.
  2. 관심 뉴런(들)('X')에서 뉴런 식별을 위한 적색 형광 단백질(RFP) 및 GCaMP6f(칼슘 지표)를 발현하기 위해 X-Gal4 계통의 처녀 암컷을 UAS-GCaMP6f 및 UAS-tdTomato22를 운반하는 수컷과 교배합니다.
    참고: 이 연구를 위해 Keystone-Gal4 라인을 사용하여 유충 뇌18,19에서 단일 쌍의 억제성 국소 뉴런(Keystone-LN)에서 tdTomato 및 GCaMP6f의 발현을 유도했습니다.
  3. 수컷과 암컷 파리가 짝짓기를 하고 48시간 동안 알을 낳도록 한 후 성충을 신선한 약병으로 옮깁니다.
  4. 3령 유충(알을 낳은 후 약 120시간)을 15% 자당 용액에 띄워 추출합니다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 떠다니는 유충을 1,000mL 유리 비커로 옮깁니다.
  5. 비커의 물을 매번 800mL의 신선한 증류수로 교체하여 유충을 3-4회 씻습니다. 나머지 프로토콜을 진행하기 전에 유충을 10분 동안 쉬게 하십시오.

2. 3령 초 파리 유충에 대한 기아 프로토콜(굶주림 대 굶주리지 않은 조건을 테스트하는 경우)

  1. 6cm 페트리 접시에 실험실 물티슈의 작은 사각형을 놓아 두 개의 공급 챔버를 준비합니다. 굶주리지 않은 조건의 경우 350μL의 0.2M 자당 용액을 첨가하십시오. 굶주린 상태의 경우 증류수 350μL를 추가합니다.
  2. 동일한 수의 세척된 유충을 각 먹이실로 옮깁니다. 유충이 실온에서 2시간 동안 자당(굶주리지 않음) 또는 증류수(굶주림)를 먹도록 합니다.

3. 생체 내 칼슘 이미징

참고: 조직 접착제와 관련된 모든 실험은 표준 실험실 안전 관행을 사용하여 수행되어야 합니다. 니트릴 장갑, 실험실 가운, 보안경 또는 안면 보호대를 포함한 개인 보호 장비(PPE)가 필요합니다. 면 장갑은 시아노아크릴레이트와의 발열 반응으로 인해 피해야 합니다. 접착제가 피부, 눈 또는 점막에 닿지 않도록 하십시오. 피부가 접착된 경우 따뜻한 비눗물에 해당 부위를 담그고 부드럽게 분리하십시오. 눈에 노출된 경우 미지근한 물로 ≥5분 동안 헹구고 즉시 의사의 진료를 받으십시오. 접착제는 화상을 입으면 자극적인 연기를 방출할 수 있으므로 화염과 고열에서 멀리 보관해야 합니다. 접착제를 사용하지 않을 때는 습기와 직사광선을 피해 ≤30°C에서 단단히 밀봉된 용기에 담아 보관하십시오.

  1. NaCl 110 mM, KCl 5.4 mM, CaCl2 1.2 mM, MgCl2 0.8 mM, D-포도당 10 mM 및 HEPES 10 mM의 조성으로 칼슘 이미징 완충액을 준비합니다. 사용하지 않을 때는 4°C에서 보관하십시오.
    참고: 110mM NaCl을 함유하는 변형 식염수는 유충 CNS 해부 및 이미징을 위해 널리 인정되는 제형이며 전기생리학 및 이미징 연구(≈108-128mM NaCl)23,24,25,26에 사용되는 일반적인 범위 내에 속합니다.
  2. 24 x 50mm(1.5mm 두께) 현미경 커버 유리에 주사기에서 분배된 바셀린을 사용하여 우물을 만듭니다.
  3. 국소 조직 접착제(60% 2-옥틸 및 40% n-부틸 시아노아크릴레이트)를 커버 유리 중앙에 작은 방울을 놓습니다. 유리 막대를 사용하여 접착제를 얇고 균일한 층으로 고르게 펴 바릅니다.
  4. 브러시나 가는 와이어를 사용하여 한 마리의 유충을 접착제 위에 조심스럽게 옮깁니다. 유충의 복부면을 접착제 위에 부드럽게 누릅니다. 접착제를 건조시켜 유충이 완전히 고정되도록 합니다.
  5. 유충이 고정되면 커버 유리를 도립 현미경 스테이지에 놓습니다(그림 1A).

4. 생체 외 칼슘 이미징

  1. NaCl 110 mM, KCl 5.4 mM, CaCl2 0.3 mM, MgCl2 0.8 mM, D-포도당 10 mM 및 HEPES 10 mM의 조성으로 유충 해부 완충액을 준비합니다. 사용하지 않을 때는 4°C에서 보관하십시오.
  2. Ishimoto와 Sano10이 설명한 대로 뇌 해부를 해부합니다. 간단히 말해서, 브러시나 가는 와이어를 사용하여 한 마리의 유충을 바닥에 실리콘 엘라스토머를 겹겹이 쌓인 3.5cm 페트리 접시에 옮깁니다.
  3. 해부 현미경으로 유충의 복부면이 위를 향하도록 배치하고 뇌를 찾습니다. 해부 가위를 사용하여 유충의 앞쪽 끝에서 약 1/3 정도 절단합니다. 입 갈고리에서 또 다른 자르기를 만듭니다. 몸과 입 갈고리를 제거하면서 뇌를 보존합니다(Janelia Flylight 프로토콜27에서 채택).
  4. 복측 코드에서 운동 뉴런 함유 신경 클러스터를 식별합니다. 집게를 사용하여 해부된 나머지 유충에서 뇌를 부드럽게 당깁니다. 뇌에서 과도한 조직을 잘라냅니다.
    알림: 부드럽게 다루십시오 - 과도한 힘은 뇌가 깨지기 쉽기 때문에 조직 손상을 일으킬 수 있습니다.
  5. 3.2 - 3.3단계에 설명된 대로 칼슘 이미징을 위해 조직 접착제가 있는 현미경 커버 유리를 준비합니다.
  6. P10 마이크로피펫을 사용하여 페트리 접시에서 5μL의 해부 용액으로 해부된 뇌를 조심스럽게 흡인합니다. 뇌를 접착제 위로 천천히 배출합니다. 접착제가 마르기 전에 뇌를 등쪽이 위로 향하도록 합니다(두 개의 뇌엽이 아래를 향하고 등쪽 복측 탯줄이 위를 향하도록 함).
  7. P200 마이크로피펫을 사용하여 100μL의 칼슘 이미징 완충액을 커버 유리의 고정된 유충 뇌 위로 옮깁니다.
  8. 칼슘 이미징을 위한 회전 디스크 공초점 스캐너 모듈과 CCD 카메라에 연결된 도립 현미경에 뇌가 있는 커버 유리를 놓습니다(그림 1B).
    알림: 생체 외 준비의 경우 접착제가 아직 젖어 있는 동안 뇌의 방향을 올바르게 지정해야 합니다. 최적의 이미지 품질을 위해 ROI가 현미경 대물렌즈에 가장 가깝도록 뇌를 배치하고 ROI 근처에 과도한 접착제를 바르지 마십시오.

5. 이미징 프로토콜

  1. 공초점 현미경을 사용하여 칼슘 이미징용 소프트웨어를 엽니다. GFP 레이저(여기 488 nm, 강도 70%, 방출 525 nm/50 m, OD8)와 RFP 레이저(여기 561 nm, 강도 50%, 방출 610 nm/75 m, OD8) 사이의 필터 전환이 있는 10x/1.4 NA 대물렌즈를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 노출을 100ms에서 1,000ms 사이로 설정하고, 게인을 해당 노출 값의 50%로 설정하고, 이미지 캡처 중에 비닝 계수를 2로 설정합니다.
  2. 현미경을 10배 배율로 조정하고 명시야 조명 아래에서 뇌를 찾습니다.
  3. RFP 레이저(여기가 561nm로 설정됨)로 tdTomato 신호를 검색하여 관심 있는 뉴런을 식별합니다.
    참고: 채도를 선택하고 감마를 줄여 올바른 노출 값을 설정합니다.
  4. 관심 영역(ROI)이 식별되면 GFP 레이저(여기가 488nm로 설정됨)로 전환하여 GCaMP6f 신호를 캡처합니다. 두 채널의 스택 이미지를 캡처하기 전에 tdTomato 및 GCaMP 신호가 모두 공동 국지화되는지 확인합니다.
    참고: 형광을 최대화하려면 tdTomato 및 GCaMP6f 스택 녹화에 대한 이미지 설정을 조정합니다.
  5. tdTomato 및 GCaMP6f 신호의 두 개의 개별 시계열 기록을 0.5프레임/s(총 2분 동안)의 속도로 동시에 캡처합니다.
    참고: 해부된 유충 뇌는 이러한 완충 조건에서 약 10분 동안 생존 가능한 상태를 유지합니다. 이 시간이 지나면 신호가 저하됩니다.
  6. 샘플을 이미징할 준비가 되면 tdTomato 및 GCaMP6f 신호의 두 개의 개별 시계열 기록을 0.5프레임/s(총 2분 동안)의 속도로 동시에 캡처합니다.
    참고: 해부된 유충 뇌는 이러한 완충 조건에서 약 10분 동안 생존 가능한 상태를 유지합니다. 이 시간이 지나면 신호가 저하됩니다.
    참고: 정량 분석을 수행하는 동안 선형 강도 스케일링을 유지하면서 필요에 따라 레이저 출력을 높이고 검출기 노출 이득을 조정하는 것이 좋습니다.

6. 데이터 처리 및 분석

  1. tdTomato 및 GCaMP6f 신호 스택을 열고 ImageJ(NIH)28로 가져옵니다.
  2. 올바른 관심 영역(ROI)을 식별하려면 tdTomato 및 GCaMP6f 신호를 병합하여 공동 국소화를 확인합니다. 확인 후 tdTomato 및 GCaMP6f 채널을 분할합니다.
  3. 상단 메뉴에서 플러그인 | New를 클릭하고 매크로를 클릭하여 새 매크로를 시작합니다. 그런 다음 사용자 지정 ROI 기반 매크로를 ImageJ로 가져옵니다. GCaMP6f 스택을 선택하고 칼슘 분석을 위해 실행을 누르십시오.
  4. 사용자 정의 ImageJ 매크로(https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging)를 사용하여 형광 신호를 처리합니다. 매크로는 먼저 최대 강도 투영을 생성하고, StackReg 플러그인(Rigid Registration 모드)29를 사용하여 모션 보정을 수행하고, 표백제 보정을 적용한다.
  5. 수동 ROI 선택을 요청하는 "조치 필요" 팝업이 나타나 사용자가 광범위한 ROI를 수동으로 도출할 수 있습니다. 확인 을 클릭하여 분석을 계속합니다. 모션 보정을 수행하려면 프레임 전체에서 로컬 공간 및 ROI 모양을 유지하면서 정확한 모션 보정을 위해 직사각형 상자가 모든 프레임의 전체 ROI를 덮어야 합니다.
    참고: StackReg를 사용하여 ImageJ에 녹화가 등록되었습니다. 면내 움직임이 크거나(누적 XY 변위 > 1μM) 축 방향 Z-드리프트로 인해 초점이 손실되면 등록이 신뢰할 수 없거나 샘플이 이미징 창에서 완전히 손실되었습니다. 따라서 극단적인 드리프트 또는 감소하는 칼슘 신호(>30%)를 보이는 샘플은 자동으로 태그가 지정되어 다운스트림 분석에서 제외되어 뉴런 활동의 정확한 측정을 보장했습니다. 이러한 임계값은 칼슘 이미징 연구30,31,32,33에서 일반적으로 적용되는 품질 관리 관행과 일치합니다. 또한 제외는 신뢰할 수 있는 자극 연결 칼슘 과도 현상이 있는 안정적인 기록만 분석에 사용되도록 보장했습니다.
  6. 분석을 위해 픽셀 자기 상관에 따라 수동으로 정의된 원형 ROI에서 형광 흔적을 추출합니다. 이러한 ROI는 전체 키스톤 뉴런 필드를 포괄합니다.
    1. ImageJ(v1.54p)의 사용자 정의 매크로를 사용하여 두 개의 형광단(GCaMP6f/GFP 및 tdTomato/RFP)에 대한 원시 형광 강도 데이터를 추출합니다(https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, 재료 표 참조).
    2. 20 x 20픽셀 ROI와 시야 전체에 걸쳐 10픽셀의 스텝 크기를 가진 슬라이딩 창을 적용합니다. 각 ROI에 대해 매크로는 (1) 모든 프레임의 강도, (2) 기준선 변동 차이(즉, 처음 10개 프레임 동안의 최대 강도 값과 최소 강도 값 간의 차이) 및 (3) 최대 프레임 간 강도 변화(ΔF)를 계산합니다. 강도 변동이 10단위 미만인 ROI는 제거되고 추가 분석을 위해 가장 날카로운 ΔF 값만 선택됩니다.
    3. 다음 방법을 사용하여 형광 트레이스를 정규화합니다.
      1. Fmax 및 Fmin 정규화: 다음 공식을 사용하여 정규화된 Δ를 계산합니다.
        figure-protocol-1
        여기서 F는 각 시점의 원시 형광이고, Fmin은 최소 형광(기준선), Fmax는 기록 중 최대 형광입니다.
      2. ΔF/F 0 정규화: 또한 다음 공식을 사용하여 ΔF/Fo 정 규화를 수행합니다. 여기서 Fo(기준선)는 다음 공식을 사용하여 각 기록의 처음 10개 프레임에 의해 결정됩니다.
        figure-protocol-2
        여기서 Ft 는 시간 t의 형광이고 F0 은 처음 10개 프레임에서 계산된 기준선 값입니다.
  7. GCaMP6f 신호를 추출한 후 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 모두 선택, 잘라내기 및 붙여넣기를 눌러 모든 값을 새 Excel 스프레드시트로 전송합니다. 상단 메뉴 모음에서 데이터 | 텍스트를 열로 변환합니다. "Text-to-Column" 마법사 팝업이 나타납니다. 1단계에서 구분 기호를 선택한 후 다음을 클릭합니다. 2단계의 구분 기호에서 탭 및 쉼표를 선택한 후 다음을 클릭합니다. 3단계에서 마침을 선택합니다.
    선택 사항: 정규화된 칼슘 신호를 플로팅하려면 Fnorm_FminFmax 강조 표시하고 산점도를 선택합니다.
  8. (1) 원시 형광 값 F, (2) ΔF/Fo 및 (3) Fnorm(정규화된 형광 강도)을 포함하는 생성된 .csv 파일을 찾습니다. 최종 데이터 세트를 (1) 시간(프레임), (2) 표본 조건(굶주림 또는 먹이), (3) 복제 ID(개별 표본) 및 (4) 정규화된 강도(0에서 1까지 조정된 Fnorm 값)의 네 열로 구성합니다.
  9. 마지막으로 사용자 정의 R 스크립트를 사용하여 R에서 데이터 분석 및 시각화를 수행합니다(https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. 재료 표 참조).
    1. 사용자 지정 R 스크립트를 새 R 프로젝트로 가져옵니다. 분석을 실행하기 전에 ggplot2, dplyr 및 readr을 포함한 필수 R 패키지가 설치 및 업데이트되었는지 확인합니다.
    2. 사용자 지정 R 스크립트의 1행부터 시작하여 계속 실행을 눌러 칼슘 분석을 수행합니다. 또한 출력에 시계열 기록의 처음 30프레임, 60프레임 및 모든 프레임에 대한 정규화된 칼슘 강도를 보여주는 히트맵과 정규화된 강도의 중앙값을 표시하는 상자 그림이 포함되어 있는지 확인합니다.
    3. Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 정규화된 칼슘 강도의 중요성을 평가합니다.

7. 폐기물 처리 및 오염 제거

  1. 실험 후 흐르는 물에 공구와 표면의 심각한 잔해물을 제거한 다음 70% 에탄올 또는 10% 표백제로 소독한 다음 멸균수로 소독합니다. 소독된 표면에서 작업하고 장갑을 벗은 후 손을 씻으십시오. 실험실에서 먹거나 마시지 마십시오.
  2. 폐기하기 전에 유충 조직과 오염된 일회용품을 생물학적 위험 백과 오토클레이브에 넣으십시오.
  3. 완전히 경화된 접착제 폐기물을 일반 쓰레기로 버리십시오. 경화되지 않은 접착제와 오염된 일회용품은 밀봉되고 라벨이 붙은 유해 화학 폐기물 용기에 수거해야 합니다.
  4. 모든 날카로운 물건(칼날, 바늘, 깨진 유리)을 구멍 뚫기 방지 날카로운 물건 용기에 넣으십시오.
  5. 가연성 용매(에탄올, 아세톤)를 라벨이 붙은 가연성 폐기물 용기에 수거합니다.

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결과

유충 칼슘 이미징 접근법을 입증하기 위해 초파리 유충의 생체 내 및 생체 외 제제 모두에 성공적으로 적용했습니다(그림 2 및 그림 3, 비디오 1, 비디오 2, 비디오 3 및 비디오 4). 우리는 유충 뇌의 단일 Keystone-LN 쌍에서 GCaMP6f 및 Td-Tomato를 발현하는 3령 초파리 유충의 칼슘 역학을 측정했습니다18,19. 비교 측정을 보여주기 위해 우리는 굶주린 유충과 굶주리지 않은 유충의 칼슘 역학을 비교했습니다.

생체 내 제제의 경우, 온전한 유충 전체에서 Keystone-LN...

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토론

여기에서는 3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징에 대한 접근 방식을 설명합니다. 우리는 초파리 유충의 억제성 국소 뉴런인 Keystone-LN에서 칼슘 역학을 이미지화했습니다. 우리는 전체 유충 제제(생체 내) 및 유충 뇌의 해부된 제제(생체 외)에서 Keystone-LN 칼슘 역학을 측정했습니다(그림 1).

우리는 이전에 소수의 유충에 대해 GCaMP5, GCaMP6s 및 GCaMP6f 간의 정성적 비교를 수행했습니다. 우리는 Keystone-LN을 사용한 실험을 위해 GCaMP6f를 선택했는데, 이는 Keystone-LN에서 강력한 신호, 빠른 동역학 및 자극 연결 칼슘 과도 현상의 안정적인 검출을 제공했기 때문입니다. 그러나 우리는 다른...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이러한 실험을 위해 연구실의 회전 디스크 공초점 현미경을 사용할 수 있도록 해준 Jeffrey Harper 박사에게 감사드립니다. 우리는 플라이 라인의 선물에 감사드립니다: w; UAS-GCaMP6f/CyO, 울음; 김정환 박사의 UAS-td토마토 . 이 작업은 수상 번호 2341202 및 2129234에 따라 국립 과학 재단의 자금 지원을 받았습니다. 그림 1 은 Biorender를 사용하여 작성되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
플라이 스톡 & 정비
뉴트리플라이 파리 먹이제네시 사이언티브66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoJH 김 박사의 기증 및 nbsp;
w;; 키스톤-갤런4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
기아 프로토콜용 시약
6cm 페트리 접시제네시 사이언티브32-106G
자당밀리포어 시그마S0389-500G
영상 및 해부 버퍼용 시약
염화칼슘J.T. 베이커, 아반토 사이언스JT1311-1CAS: 1311-01, 500g
D-(+)-포도당써모피셔 사이언티브A16828.36CAS: 50-99-7, 500g
HEPES-2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라자닐]-에탄설폰산J.T. 베이커, 아반토 사이언스JT4018-1CAS: 4018-01, 100g
염화마그네슘VWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100g
염화칼륨써모피셔 사이언티브J64189.36CAS: 7447-40-7, 500g
소금EMD 밀리포어 시그마EMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500g
해부용 도구 및 시약
해부 버퍼구성 문은 본문에 제공된다
올림푸스 페트리 접시, 60 x 15mm 통풍제네시 사이언티브32-105
실가르드 184 엘라스토머 베이스전자현미경 과학24236-10A
실가드 184 엘라스토머 베이스 경화제전자현미경 과학24236-10B
핀셋 스타일 5, EMS전자현미경 과학78320-5
Vannas 스프링 가위 - 3mm 절단 엣지파인 사이언스 툴즈15000-00
영상 및 장착 장비/시약
초점 스캐너 모듈요코가와CSU-W1현미경과 연결되어
영상 버퍼구성 문은 본문에 제공된다
역현미경라이카 마이크로시스템즈DMi8 회전 디스크 공초점 스캐너 모듈과 CCD 카메라에 연결되어 있습니다
현미경 커버 유리, 24mm x 50mm, 두께 # 1.5글로브 사이언티픽 주식회사1415-15
MWI 수의학 GLUTURE 국소 접착제피셔 사이언티브NC0632797
순수 바셀리월그린스912556
공개 자료 링크
바이오렌더https://www.biorender.com/
이미지JNIH912556https://imagej.net/ij/
자넬리아 플라이라이트 프로토콜 영상https://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
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참고문헌

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