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방법 논문

실험 절차를 위한 약물 내성 세포주 개발

1.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68957

⸱

2025년 8월 12일

 ,  ,  , 
1Department of Urology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Urology, Kanazawa University, 3Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor, 4Single Cell Spatial Analysis Program, University of Michigan, Ann Arbor

이 논문에서

요약

약물 내성 세포주를 통해 치료 내성 메커니즘을 이해하고 새로운 화합물, 용도 변경된 약물 및 병용 요법에 대한 비임상 평가를 수행할 수 있습니다. 이 논문은 모세포주를 표적 약물의 농도가 단계적으로 증가시켜 내성 세포주를 생성하기 위한 프로토콜을 소개합니다.

초록

약물 내성 세포주의 개발은 약물 내성의 메커니즘을 이해하고 암 치료에서 치료 실패를 극복하기 위한 전략을 식별하는 데 필수적입니다. 내성 모델을 사용하면 새로운 화합물, 용도 변경된 약물 및 병용 요법에 대한 전임상 평가가 가능합니다. 내성 세포를 생성하기 위해 부모 암 세포주는 몇 주에 걸쳐 점진적으로 증가하는 표적 약물의 농도에 반복적으로 노출됩니다. 각 단계에서 생존하고 증식하는 세포를 선택하고, 확장하고, 더 높은 약물 용량에 노출시킵니다. 내성의 발달은 세포 생존율 분석 및 비선형 회귀 분석을 사용하여 부모 세포와 내성 세포 사이의 절반 최대 억제 농도(IC50) 값을 정량화하고 비교함으로써 확인됩니다. IC50 값이 크게 증가하면 약물 압력에 대한 성공적인 적응과 내성 발생을 나타냅니다. 이러한 약물 내성 세포주는 마이크로어레이 및 단일 세포 시퀀싱과 같은 포괄적인 분석은 물론 다양한 시험관 내 또는 생체 내 실험에 사용할 수 있습니다. 이러한 모델은 약물 내성을 극복하기 위한 잠재적인 치료 전략을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서론

화학 요법은 수술이나 방사선 요법이 불가능한 국소 암 또는 전이성 암에 가장 자주 사용되는 치료 옵션입니다. 분자 표적 약물과 화학 요법은 많은 악성 종양의 1차 치료제로 사용되며 그 효능은 널리 인정받고 있습니다. 일부 암은 치료 시작부터 특정 약물에 대한 내성을 나타내어 치료가 효과가 없게 됩니다. 그러나 더 일반적인 경우에는 처음에는 효과적이었던 치료가 약물 내성의 발달로 인해 효과가 없어져 암의 진행으로 이어집니다.

약물 내성은 약물을 회피하거나 세포 성장을 돕는 유전자 산물의 발현을 유도하는 암세포의 유전적 돌연변이 또는 후생유전학적 반응에 의해 발생합니다1,2. 또한, 많은 경우, 이 내성은 다제내성으로 발전하여 암세포가 여러 약물에 내성을 갖게 됩니다 3,4. 따라서 약물 내성의 메커니즘을 규명하고 이를 극복하기 위한 전략을 개발하는 것은 암 치료의 발전에 매우 중요합니다.

약물 내성 세포주는 치료 내성의 메커니즘을 연구하는 데 자주 사용되는 모델이며 시험관 내 및 생체 내 실험 모두에서 중요한 역할을 합니다5. 이러한 모델은 약물 작용 경로에 대한 더 깊은 이해를 얻고, 치료 효능에 영향을 미치는 바이오마커를 식별하고, 약물 내성 형성을 억제하는 치료 전략을 찾는 데 필수적인 도구입니다. 약물 내성 세포주를 만드는 기본 과정은 세포주를 표적 약물 3,6의 증가 수준에 노출시켜 내성을 유도하는 것입니다.

사용된 농도와 약물 노출 기간은 이 과정의 중요한 구성 요소입니다. 각 농도 수준에서 생존한 세포의 하위 집합이 증폭된 다음 반복적인 방식으로 다음 농도의 약물에 노출됩니다. 궁극적으로, 모세포주에 비해 약물에 대한 절반 최대 억제 농도(IC50)가 증가한 약물 내성 세포주가 파생됩니다. 이 보고서는 간헐적인 약물 노출로 단계적 방법을 사용하여 인간 전립선암 세포주 DU145에서 파클리탁셀 내성 세포주(DU145-TxR)를 생성하는 절차를 자세히 설명합니다.

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프로토콜

1. 세포 배양 및 세포 생존율 분석

참고: 파클리탁셀은 항암제이며 세포독성이 있습니다. 취급 시 가운, 고글, 장갑을 착용하고 신체로 흡입되지 않도록 안전 캐비닛 내부에서 작업하십시오. DMSO는 세포독성이 높지는 않지만, 피부나 점막에 닿으면 용해된 약물의 투과성이 높아지므로 가운, 고글, 장갑을 착용하여 취급하십시오.

  1. 완전 배지(RPMI-1640 + 1% 페니실린-스트렙토마이신[펜-연쇄상구] + 10% 소 태아 혈청[FBS])를 사용하여 10cm 세포 배양 접시에서 5% CO2 에서 80% 합류할 때까지 배양합니다.
  2. 배양 배지를 흡인하고 DPBS로 세척하고 0.05% 트립신을 첨가한 다음 인큐베이터에 5분 동안 그대로 둡니다.
  3. 세포가 플레이트에서 분리되어 떠 있는 것을 현미경으로 두드리고 확인한 후, 트립신의 작용을 멈추기 위해 완전 배지 1mL를 첨가합니다.
  4. 세포 수를 계산하고 96웰 플레이트의 각 웰에 있는 완전 배지에서 웰당 1.0 × 104/99 μL의 밀도로 시딩합니다. 세포가 플레이트 바닥에 부착되도록 2시간 동안 배양합니다. 세포는 각 테스트 그룹에 대해 3중 또는 4중으로 도금되어야 합니다.
  5. 각 웰에 첨가할 파클리탁셀과 DMSO를 조정합니다. 각 웰에 첨가되는 DMSO의 양이 동일하고 DMSO의 최종 농도가 1%를 넘지 않는지 확인하십시오.
    1. 이를 수행하고 프로토콜에 따라 DMSO에서 10mM 파클리탁셀로 시작하여 튜브에 있는 이 약물의 12.8μL에 87.2μL의 DMSO를 첨가하여 1,280μM에서 100μL의 파클리탁셀을 얻습니다.
    2. 이 용액 50μL를 다른 튜브로 옮기고 50μL의 DMSO(640μM)로 절반 강도로 희석합니다.
    3. 이 절차를 반복하여 연속 희석을 수행하고 0(DMSO만 해당), 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 및 1,280μM의 농도로 파클리탁셀 용액을 준비합니다.
      참고: DMSO로 희석된 파클리탁셀은 후속 실험에서 재사용할 수 있도록 냉동 보관해야 합니다(동결-해동 주기를 최소화하려면 분취량으로 보관).
  6. 별도의 튜브에 9μL의 완전 배지로 이전에 준비된 파클리탁셀 용액 1μL를 희석하고, 세포를 파종한 후 2시간 후에 각 웰에 1μL를 첨가합니다. 각 웰의 파클리탁셀 농도는 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 및 1,280 nM이며 각 웰에는 100μL의 배지가 포함됩니다.
    참고: 세포 생존율 분석에 사용되는 약물의 농도를 설정할 때 이전 논문에 발표된 IC50 값을 확인하고 농도가범위 3 내에 있는지 확인하십시오. 각 웰의 DMSO 농도는 전체적으로 0.1%였습니다(1% 미만이 바람직함).
  7. 48시간 동안 배양합니다. 각 웰(배양 배지 100μL)에 10 μL의 세포 증식 시약 WST-1을 첨가하고 추가로 0.5 내지 4.0시간 동안 배양합니다.
    참고: 최적의 배양 시간은 세포주와 세포 밀도에 따라 다릅니다. 본 연구에서는 약 1.5시간 동안 세포를 배양하였다. 배양 시간이 너무 짧거나 너무 길면 다음 단계에서 각 웰의 흡광도가 너무 낮거나 너무 높습니다. 결과적으로 세포 생존력의 차이를 확인할 수 없습니다. 따라서 초기 테스트의 경우 적절한 배양 시간을 확인하기 위해 여러 배양 시간을 테스트해야 합니다.
  8. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 WST-1 흡광도를 측정합니다.
    참고: 타겟 흡광도는 450nm(420-480nm 권장)이고 배경 흡광도는 650nm(600nm 이상 권장)입니다.

2. 세포 생존율 및 절반 최대 억제 농도(IC50) 값 계산

  1. 흡광도에서 세포 생존력을 계산합니다. 흡광도는 (A450nm-A650nm)입니다.
    세포 생존율(%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
    As: 샘플 흡광도(약물 처리 세포)
    Ab: 블랭크 흡광도(배지 전용, 세포 없음)
    Ac: 제어 흡광도(약물 처리되지 않은 세포)
  2. 이전 섹션에서 계산된 세포 생존율을 스프레드시트 소프트웨어로 요약합니다.
  3. 비선형 회귀 분석을 통해 부모 세포에 대한 IC50 을 계산하고 기록합니다.
    참고: 4매개변수 로지스틱 모델(4PL)이 적합한 계산 방법인 경우가 많습니다. 온라인 IC50 계산 도구를 사용할 수 있습니다7. 그러나 4PL 모델은 화합물의 효능이 농도 범위를 벗어나고 데이터가 S상 곡선의 하부 및 상부 점근을 완전히 나타낼 수 없는 경우에는 사용해서는 안 됩니다.
    1. 이러한 증가를 방지하려면 가능한 한 많은 농도점에서 세포 생존력을 측정하십시오. 시그모이드 곡선을 얻을 수 없는 경우 최소값과 최대값이 고정된 2개 또는 3개의 매개변수 모드를 사용합니다7.
    2. 웹에서 사용할 수 있는 것을 포함하여 계산 소프트웨어 또는 통계 소프트웨어를 사용하지 않는 경우 다음 공식을 사용하십시오.
      IC50=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
      A: 세포 생존율 ≤50%로 측정된 약물 농도 중 가장 낮은 값
      B: 세포 생존율 >50%로 측정한 약물 농도 중 가장 높은 값
      C: B에서의 세포 생존력
      D: A에서 세포 생존력
      참고: 이 공식은 IC50 값을 끼우는 두 점 사이의 그래프가 직선이라고 가정합니다.

3. 약물 노출

참고: 이 섹션에 설명된 절차의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

  1. 세포 배양 플레이트에 부모 세포를 시종합니다(100mm 접시의 경우 2.0 × 106 세포/접시).
  2. ~10-20%의 세포 생존율 억제 농도(이 경우 IC10-20, ~0.5nM)의 파클리탁셀을 배지에 첨가하고 인큐베이터에서 2일 동안 배양합니다.
  3. 파클리탁셀이 없는 배지로 교체하고 며칠 동안 배양합니다.
  4. 세포가 성장하고 80% 합류가 되면 새로운 세포 배양 플레이트로 계대시킵니다. 나머지 세포를 냉동 보존합니다.
  5. 시작 농도의 ~1.5-2.0배(0.75-1nM)의 농도로 통과된 세포에 파클리탁셀을 첨가합니다. 인큐베이터에서 2일 동안 배양합니다.
  6. 파클리탁셀이 없는 배지로 교체하고 며칠 동안 배양합니다.
  7. 세포가 유사하게 성장하면 3.4-3.6단계를 반복하여 파클리탁셀 노출 농도를 단계별로 증가시킵니다.
    참고: 약물 농도의 증가(1.5-2.0배)는 실험자가 자유롭게 설정할 수 있으며 실험은 해당 농도에서 반복되어야 합니다. 약물 농도가 증가할 때마다 세포를 냉동 보관하는 것이 좋습니다. 파클리탁셀 농도가 계속 증가하면 세포 증식이 회복되지 않고 세포가 사멸할 수 있습니다. 이러한 경우에는 사멸 전의 농도로 증식한 세포를 해동하고, 파클리탁셀 증가를 1.1-1.5배(1.2배 권장)로 줄인 후 배양을 반복한다.
  8. 약물에 대한 세포주의 내성을 점차적으로 증가시킨 후, 섹션 2에 설명된 대로 WST-1 및 소프트웨어를 사용하여 IC50 을 계산하고 기록한다.
    참고: IC50 의 증가가 최소 3-5배 관찰되면 균주가 약물 내성 세포주임을 확인할 수 있습니다.

4. 약물 내성 유지

  1. 약물 내성 세포주의 내성 표현형을 유지하기 위해 IC10-20의 약물 농도로 배양합니다.
    참고: 약물 내성이 변할 수 있으므로 세포 생존 분석에서 IC50 을 주기적으로 측정하는 것이 좋습니다.

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결과

이 방법을 사용하여 우리는 이전에 파클리탁셀 내성 DU145 세포(DU145-TxR)를 성공적으로 확립하는 데 9개월을 보냈습니다. 세포 생존율 분석 결과는 DU145 모세포주에 대한 파클리탁셀의 IC50 값은 1.1 nM인 반면, DU145-TxR에 대한 IC50 값은 모세포주(IC50: 164.6 nM)보다 149.6배 더 높았다(표 1 및 도 2). 이 결과는 DU145-TxR이 매우 높은 약물 내성을 획득했음을 나타냅니다.

세포 형태는 세포 파종 및 파클리탁셀 첨가 후 48시간에 세포 생존율 분석 직전에 디지털 도립 현미경을 사용하여 관찰되었습니다. 그 결과, 파클리탁셀 농도가 1nM에서 10nM으로 증가함에 따라 모세포주 DU145는 세포사멸을 암시하는 명확한 세포 위축 및 형태학적 변화를 보였다. 그러나 DU145-TxR 세포주...

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토론

약물 내성 암세포주의 개발은 약물 독성 및 내성 메커니즘을 조사하기 위한 확립된 방법이지만, 연구자들이 직면한 첫 번째 과제는 내성을 발현하기 위한 적절한 모델을 선택하는 것입니다. 시험관 내에서 약물 내성 세포주를 만드는 일반적인 방법은 세포주를 표적 약물에 노출시키는 것입니다만, 노출 농도를 설정하는 방법(단계적 또는 일제로)과 무약물 기간(펄스 또는 연속)을 설정할지 여부를 고려할 필요가 있습니다.

약물 없는 기간이 있는 펄스 방법은 짧은 기간 동안 약물 노출 후 회복 기간이 있기 때문에 암 환자가 여러 주기의 화학 요법을 받는 것과 유사합니다. 따라서 이 방법은 임상 모델에 가깝고 널리 사용됩니다. 반대로, 지속적인 약물 노출 방법은 매일 투여되는 일부 화학 요법 및 분자 표적 요법과 같이 혈중 약물 수준이 안정적인 모델을 모방합니다.

세포주가 노출되는 최대 약물...

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공개 사항

저자는 잠재적인 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 P01 CA093900의 지원을 부분적으로 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.05% 트립신-EDTAGibco25300-054
10 mL 일회용 혈청학적 피펫Fisher scientific13-678-11E
100 mm 접시Corning353003
15 mL 원뿔형 튜브Corning352097
2.0 mL 극저온 바이알 Corning431386
96웰 세포 배양 플레이트Corning353072
세포 계수 챔버 슬라이드InvitrogenC10228
세포 증식 시약 WST-1시그마5015944001
원심분리기 5702 Reppendorf
무수한 IIInvitrogen세포 계수기
Dimethyl sulfoxide 시그마D2650
DPBSGibcoD4W2J
DU145ATCCHTB-81전립선암 세포주
EVOS FLcThermo Fisher Scientific디지털 도립 현미경
FBSGibcoA5670701
PaclitaxelSelleckS1150
Penicillin– 스트렙토마이신Invitrogen15140-122
RPMI 1640Gibco11875-093
Synergy H1BioTek마이크로플레이트 리더
트리판 블루 용액 0.4%Invitrogen15250061

참고문헌

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