200 kV 투과 전자현미경과 듀얼 콘덴서 렌즈 시스템을 이용한 고품질 단층 촬영 데이터 수집 달성

Summary

전자 단층촬영은 냉동생물학적 샘플 내 조직 내 소기관, 세포, 고분자를 원자 수준에 가까운 영상화를 가능하게 합니다. 이러한 해상도를 달성하려면 엄격하게 통제된 영상 조건이 필요합니다. 여기서는 2단계 응축 렌즈 시스템을 갖춘 200 kV 투과 전자현미경을 예로 사용하여 고품질 전자 단층촬영 데이터 수집 방법을 설명합니다.

Abstract

냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)은 세포 소기관과 대형 단백질 복합체의 구조를 그 자연 환경에서 규명하는 강력한 기법으로 부상했습니다. 기존의 상온 전자현미경과 달리, 크라이오-ET는 방사선 유발 및 준비 유발 내부 구조 손상을 최소화합니다. 더불어, 단일 입자 분석(SPA)과 달리 크라이오-ET는 반복적인 정제 필요성을 줄여 샘플의 가장 정확한 구조 정보를 보존합니다. 고해상도 영상을 달성하기 위해 크라이오-ET는 TEM의 영상 조건에 엄격한 요구사항을 부과합니다. 극저온 ET 데이터 수집 효율성이 지속적으로 개선되고 수많은 소프트웨어 플랫폼이 등장했음에도 불구하고, 대부분의 솔루션은 독점적이고 벤더 특화이며 특정 전자현미경 모델과 밀접하게 연동되어 있어 높은 구현 비용이 발생합니다. 본 연구에서는 200 kV 전자현미경(Glacios 2 cryo-TEM)에 오픈소스 소프트웨어 SerialEM을 이중 응축기 렌즈 시스템을 장착하고, 고품질 단층 촬영 데이터 수집을 위한 종합적인 보정을 수행했습니다. 아포페리틴을 모델 표본으로 사용하여 냉동 샘플 준비부터 자동 냉동 ET 데이터 수집, 그리고 단층촬영술 재구성 및 하부 단층촬영술 분석까지 전체 작업 과정을 설명합니다. 이 방법은 특히 독점 소프트웨어에 접근하지 못한 글라시오스 현미경을 사용하는 실험실에 비용 효율적이고 접근성 좋은 냉동 에너지 데이터 수집 솔루션을 제공합니다.

Introduction

냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)은 고분자 복합체와 세포 소기관의 원래 구조를 현장에서 연구하는 강력한 기법으로 부상했습니다. 크라이오-ET가 단일 입자 분석(SPA)에 비해 가지는 주요 장점은 과도한 정제 단계를 피할 수 있어, 표적 생체분자의 생물학적 맥락 내에서 자연 상태를 보존할 수 있다는 점입니다. 현재 정제된 소기관 ^1,2,3,4, 세포막 시트, 고분자 복합체⁵, 바이러스⁶, 세포 라멜라 7, 조직 단편 ^8,9,10 등 광범위한 표본을 냉동 ET로 조사할 수 있습니다. 샘플 유형과 실험 목적의 다양성을 고려할 때, 데이터 수집 전략은 상당히 다양하며, 시료와 특정 기기 구성 모두에 신중하게 맞춰져야 합니다.

데이터 수집은 냉동 외계 과정에서 매우 중요한 단계로, 데이터 품질과 획득 효율성이 후속 처리와 실험의 전반적인 성공에 직접적인 영향을 미칩니다. 진화하는 실험 요구에 대응하기 위해 여러 데이터 수집 플랫폼이 개발되었습니다. 가장 널리 사용되는 것 중에는 상업용 단층촬영(Tomography)과 오픈 소스 소프트웨어인 SerialEM^{11, 12, 13}이 있습니다. 단층촬영은 학습 곡선이 적고 통합적이고 사용자 친화적인 인터페이스를 제공하지만, 유연성은 낮고 상업용 라이선스가 필요합니다. 반면, SerialEM은 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 기반과 스크립트 기반 워크플로우를 모두 지원하는 무료 오픈 소스 패키지로, 더 큰 유연성과 확장성을 제공합니다.

냉동 층층에서 토모그래피 데이터 수집은 독특한 도전 과제를 안겨줍니다. 고품질 라멜라는 준비가 어렵고, 기계적 불안정성과 전자 방사선 탐사에 대한 높은 민감도가 데이터 수집을 더욱 복잡하게 만듭니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 Fabian Eisenstein은 PACEtomo 워크플로우¹⁴를 개발했는데, 이는 SerialEM의 향상된 기능으로, 빔-영상 이동을 도입해 틸트 시리즈당 여러 토모그램을 획득함으로써 초점 및 추적 조정 빈도를 줄였습니다. 이 전략은 각 구간에서 사용 가능한 데이터의 양을 극대화하면서 불필요한 전자 노출을 최소화합니다. 유사한 기능은 상용 Tomography5 소프트웨어에서도 제공됩니다.

반면, 냉동 고정 소기관이나 막 시트에서 데이터 수집은 일반적으로 더 간단한데, 이 샘플들은 보통 구멍이 뚫린 탄소 그리드에서 준비되어 초점 맞추기^{와 추적에} 충분한 공간을 제공하기 ^{때문입니다.} 이러한 경우, SerialEM의 내장 크라이오-ET 획득 워크플로우는 GUI를 통해 직접 접근할 수 있어 초보자나 소규모 실험실에 특히 적합한 편리하고 스크립팅 없는 옵션을 제공합니다. 그럼에도 불구하고 효율성 측면에서 가능한 한 빔 이미지 이동 기반 전략을 권장합니다.

극저온 전자현미경의 높은 비용을 고려할 때, 기기 활용도를 극대화하기 위한 데이터 수집 전략 최적화가 필수적입니다. 2단계 응축 렌즈 시스템이 장착된 200 kV TEM은 300 kV 기기보다 두꺼운 시료에서 전자 투과율이 약간 낮지만, 적절히 보정하면 극저온 ET에도 충분히 적합합니다. 하지만 평행 빔 조건의 상대적으로 좁은 범위와 배율 전반에 걸쳐 고정된 스팟 크기로 인해 시스템이 정밀하게 최적화되지 않는 한 고해상도 극저온 ET에는 일반적으로 적합하지 않습니다.

우리의 전자현미경 장비에는 Falcon 4i 직접 전자 검출 카메라가 장착되어 있어 단일 전자 계수 능력과 고속 연속 영상 촬영에 상당한 이점을 제공합니다. 이 검출기의 성능을 최대한 활용하려면 TEM은 잘 최적화된 영상 조건에서 작동해야 합니다. 2단계 응축기 시스템을 사용하는 TEM의 경우, 병렬 빛의 조명 조건을 정밀하게 보정하는 것이 영상 품질 향상에 중요한 요소입니다^17,18. 현대 2단계 응축기 시스템에서는 2단계 응축기 렌즈의 초점이 상부 대물렌즈의 전면 초점면과 일치해야 시료면과 교차하는 광학 경로가 평행하게 유지됩니다. 정확히 설정된 평행광 조건은 수집된 이미지 내 국부 위치에서 초점 부족 값과 배율이 일관되게 유지되도록 하는 데 매우 중요합니다.

본 연구에서는 아포페리틴을 모델 샘플로 사용하여 고품질 냉동 외전외전(cryo-ET) 워크플로우를 구축하는 데 집중했습니다. 200 kV 투과 전자현미경 시스템은 상업용 단층촬영 소프트웨어에 라이선스가 없기 때문에, 대신 오픈소스 SerialEM 플랫폼을 설치하고 교정했습니다. 현미경의 2단계 응축 렌즈 시스템의 병렬 빔 매개변수를 세심하게 최적화함으로써, Python 스크립트나 복잡한 설정 없이도 SerialEM 그래픽 인터페이스를 통해 자동 단층 촬영 데이터 수집을 달성했습니다. 이 접근법은 Glacios와 같은 200 kV 기기에서 효율적인 극저온 ET 데이터 수집을 위한 사용자 친화적이고 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.

Protocol

1. 냉동 샘플의 준비 및 적재

1. Vitrobot을 준비하려면 전원을 켜고 온도를 10°C로 설정하세요. 습도를 100%로 설정하세요. 필터 페이퍼를 교체하세요.
2. 300메시 R1.2/1.3 구멍 탄소 필름 퀀티포일 Cu 그리드를 글로우 배출 시스템에 넣으세요. 글로우 방전 조건을 15 mA로 설정하고, 진공압 0.39 mBar, 음전하 상태로 60초 동안 유지하세요. 그리드 표면을 소화하기 위해 글로우 방전을 수행합니다.
3. Vitrobot 매개변수를 다음과 같이 설정하세요: 블롯 시간: 3초, 대기 시간: 0초, 블롯 강도: 2, 온도: 8 °C, 습도: 90%.
4. 액체 질소로 감싼 에탄 컵에 액체 질소를 냉각하여 준비합니다.
5. 3 μL 아포페리틴 샘플을 글로우 방전 그리드에 적용합니다. 즉시 액체 에탄으로 샘플을 유리화하세요
6. 에탄에서 액체 질소로 미리 냉각된 저장 상자로 샘플을 옮깁니다. 냉동 샘플 준비가 완료되었습니다.
   주의: 액체 질소와 에탄을 다룰 때는 다음 안전 프로토콜을 엄격히 따라야 합니다: 작업 중 동상 방지를 위해 개인 보호 장비(예: 극저온 장갑 및 안전 고글)가 필요합니다; 에탄 응축 전에, 급격한 끓임으로 인한 튀김을 방지하기 위해 받기 컵에 액체 질소가 없도록 하세요; 사용 후에는 누출을 방지하기 위해 에탄 가스 시스템의 주 밸브와 압력 조절 밸브를 단단히 닫아야 합니다; 잔류 에탄과 액체 질소는 샘플 준비 후 준비실 내 지정된 환기 장비에 폐기되어야 합니다.

2. 전자현미경을 위한 평행 빛 조건 결정

1. 평행 빔 정렬을 수행하기 전에 먼저 스코프의 다음 매개변수를 조정합니다: 중심 높이의 스테이지, 초점 시 대물렌즈, nP 빔 기울기 ppX/ppY, 코마 없는 피벗 포인트 X/Y, 코마, 그리고 스티그마.
2. 교차 격자를 사용해 시료가 동심 높이와 적절한 초점을 맞춘 것을 확인하고, 나노 프로브 모드에서 에너지 필터 없이 SA 73,000× 배율로 적절한 초점을 맞춥니다.
3. 회절 모드(카메라 길이: D750 mm)로 전환하고 100 μm 대물렌즈 조리개를 삽입하세요 (그림 1A, 1B).
4. 대물렌즈 조리개 조절 탭을 클릭한 후 다기능 X와 Y 노브를 사용해 대물렌즈 조리개를 중심에서 벗어나 조리개 가장자리가 금 회절 링과 겹치고 중앙 부분을 부분적으로 가리게 하세요(그림 1C).
5. 초점 노브를 사용해 회절 초점을 조절하여 대물렌즈 조리개 가장자리가 최대한 선명해질 때까지 대물렌즈의 후방 초점면을 시야에 들어오게 합니다(그림 1D).
6. 빔 세기(C2 세기)를 조절하여 금 회절 링의 폭이 최소화됩니다.
7. 대물렌즈 조리개 중앙에 맞추세요. 회절 카메라 길이를 늘려 중앙 점만 보이게 합니다(그림 1E).
8. 스티그메이터 패널의 회절 탭을 클릭하고, 다기능 X와 Y 노브를 사용해 교차점 위아래로 순환하며 중심 스팟의 형태를 조정해 빔을 원형으로 만듭니다(그림 1F).
9. 중심 지점이 최소화될 때까지 빔 세기를 조절하세요. 이렇게 하면 평행 조명 조건이 설정됩니다. 평행 조명 조건은 스팟 크기에 따라 달라질 수 있으므로, 향후 실험 시 빠른 구성을 위해 일반적으로 사용되는 각 스팟 크기에 해당하는 C2 설정을 문서화하세요.
   참고: 데이터 수집 시 사용되는 특정 스팟 크기는 배율과 C2 조리개 설정에 따라 달라집니다; 카메라에 최적의 선량률로 영상이 수행되도록 해야 합니다.

3. 아포페리틴 샘플을 위한 고품질 전자단층촬영 데이터 수집

참고: 이 절은 숙련된 사용자와 신규 연구자 모두에게 적합한 고처리량 단층촬영 데이터 수집을 위한 표준화된 절차를 개괄합니다.

1. 그리드를 클립하고 준비된 냉동 샘플을 전자현미경에 넣으려면, O-링을 정렬 도구에 넣고, 준비된 그리드는 O-링 중앙에 배치합니다. 스프링 펜을 사용해 C-링을 O-링에 클립으로 고정하고, 그 사이에 샘플을 고정하세요.
2. 오토그리드를 카세트 슬롯에 수직으로 삽입한 뒤, 워크스테이션을 통해 나노컵으로 옮긴 후 전자현미경에 넣습니다.
3. SerialEM을 사용해 전체 그리드의 전체 몽타주를 캡처하려면 SerialEM 소프트웨어를 실행하세요. 저용량 모드를 활성화하세요. 검색 모드를 115× 배율로 정의하세요.
   참고: 탐색 확대율은 일반적으로 넓은 면적의 지도를 획득하는 데 사용됩니다. 이 배율은 매핑 과정을 빠르게 하면서도 이미지 스티칭의 정확성을 보장하기 위해 가능한 한 낮게 설정됩니다.
4. 내비게이터 파일을 열어보세요. Navigator > 몽타주 및 그리드로 가서 전체 몬타주 설정> 대화 상자에서 '검색 모드 사용'을 설정하세요; 이미지를 bin4 형식으로 저장하세요. Montage Controls 아래에서 시작 을 클릭하세요.
5. 검색 및 보기 필드를 보정하기 위해 검색 모드에서 매우 인지성이 높은 랜드마크를 찾아보세요(그림 2A). 내비게이터에서 '마커 추가' 를 클릭하세요. ' 마커로 이동' 을 클릭하면 마커 위치로 이동합니다.
6. View(2600×) 모드로 전환하여 같은 랜드마크를 찾으세요. 랜드마크를 클릭하세요. Navigator로 가서 Shift를 클릭하여 마커로 이동 해 필드를 정렬하세요(그림 2B). 대화 상자의 안내에 따라 두 배율의 빔 이동이 검색 지도 내 모든 마커에 할당되고, 이동 값이 저장됩니다(그림 2C).
   참고: 뷰 확대율은 일반적으로 선택 영역(SA)의 가장 낮은 배율로 설정되어 있어 뷰와 기록 모드가 동일한 모드에 있도록 하여 확대 전환 시 중심 맞추기 과정을 쉽게 합니다.
7. 뷰 및 기록 필드를 보정하기 위해(그림 3). 뷰 모드에서는 매우 인지하기 쉬운 랜드마크를 찾아보세요. 기록(120k×) 모드로 전환하세요. 마우스를 사용해 기록 모드에서 랜드마크를 중앙에 맞춰보세요.
   참고: 기록 배율 설정은 추정된 타겟 해상도(타겟 해상도가 픽셀 크기의 두 배)와 샘플 크기에 따라 달라집니다.
8. 뷰 모드로 다시 전환해서 사진을 찍으세요. 오른쪽 마우스 버튼을 사용해 대상 객체를 시야 확대 아래 십자선으로 드래그하여 시야 중앙을 나타냅니다.
9. 디포커스 섹션에서 Shift 옆의 Set 을 클릭해 필드를 정렬하세요.
10. 목표 칸을 선택하고 전체 몽타주에서 중간 배율 지도인 5.1을 캡처하려면 캡처할 영역을 그려 ' 다각형 추가 '를 클릭하세요. 영역을 윤곽선으로 그린 후에는 ' 추가 중지 '를 눌러 선택을 최종 확정하세요.
11. 원하는 모든 부위에 대해 3.10 단계를 반복하세요. 내비게이터의 각 폴리곤에 대해 아이템 옵션에서 획득 (A) 및 새 파일을 확인하세요.
12. 항목에서 새 파일을 체크한 후 나타나는 대화상자에서 다음 항목을 선택하세요: 몽타주 이미지; 몬타주를 폴리곤에 맞추고; 다음 새 파일을 열 때 파일을 닫으세요. 확인 버튼을 누르세요.
13. 새 대화상자에서 다음 선택을 하세요: 이미지 이동 대신 단계 이동; 저용량 모드에서 뷰 파라미터를 사용하세요. 이미지를 지정된 위치에 저장하세요.
14. 중배율 지도를 캡처하려면 내비게이터 메뉴에서 아이템에서 획득을 클릭하세요. 다음 옵션을 확인해 보세요: 이미지 또는 몽타주 획득 및 저장; 내비게이터 지도를 만드세요.
15. 주요 행동 관련 섹션에서 이미지 캡처를 위해 '보기 모드 사용'을 확인하세요. 초등학교 전후 과제 섹션에서 대략적인 중심심도를 확인하세요. 중배율 지도 캡처를 시작하려면 GO를 클릭하세요.
16. 중간 배율 지도에서 포인트를 선택하려고요. 내비게이터 인터페이스에서 중간 배율 지도를 열어보세요. Add Point를 클릭하고 지도에서 Target Objects를 왼쪽으로 클릭하세요.
17. 원하는 모든 점에 대해 반복하세요. 모든 포인트를 선택한 후, ' Stop Add 'Stop '을 클릭하여 선택을 최종 확정하세요.
18. 조리개 정렬을 위해서는 현미경 UI에서 직접 정렬을 사용해 nP 빔 기울기 ppX/Y와 코마 없는 피벗 포인트 X/Y를 조정하여 시야에서 빔 스팟 흔들림을 최소화하세요.
19. SerialEM 스크립트 라이브러리(https://serialemscripts.nexperion.net/script/47)의 스크립트를 사용하여 튠 스코프를 수행합니다.
20. 단층촬영 데이터 수집을 시작하려면 내비게이터 인터페이스에서 ROI를 찾아 틸트 시리즈를 확인하세요. 대화상자에서 '프레임 이미지'를 선택하세요; 데이터 저장 위치를 선택하세요.
21. 설정 대화상자에서 -50°에서 50° 사이의 각도 범위를 설정하세요. 기본 증가를 2.5°로 설정하고, 시작 각도를 0°로 하며, 선량 대칭 방식을 활성화하세요.
    참고: 틸트당 용량, 틸트 각도 범위, 틸트 스텝 설정은 일반적으로 아래에 명시된 원칙을 따릅니다: 총 용량은 약 100 e⁻/Ų로 유지됩니다. 기울기 범위는 가장 높은 기울기 각도에서도 시료가 거의 방해받지 않고 충분한 전자 투과 및 이미징을 가능하게 하도록 선택됩니다. 틸트 범위가 상대적으로 넓다면(예: ±60° 이상), 틸트 스텝을 3°로 설정할 수 있습니다. 더 작은 틸트 범위(예: 약 ±50°)의 경우, 틸트 스텝을 2.5° 또는 2°로 줄여 총 선량이 약 100 e⁻/Ų 정도로 유지되도록 할 수 있습니다. 이는 방사선 손상이 300 kV 현미경보다 더 심각하기 때문에 과도한 총선량을 피하는 것이 필수적인 200 kV 현미경에서 특히 중요합니다.
22. 빔 강도 또는 노출 제어 섹션에서 '빔 강도 유지'를 확인하세요. 디포커스 타겟을 -3 μm으로 설정하고, 오토포커스 주파수는 틸트당 한 번씩 설정하세요.
23. 자동 정렬이 이미지 크기의 60% 이상을 이동시키면 Stop 을 확인하고, Track Before and after를 설정하세요.
24. 데이터 수집을 시작하려면 Navigator에서 ' 아이템에서 획득'을 클릭하세요. 기본 행동에서는 자동 초점에서 사이클 디포커스 목표, 드리프트 대기, TS를 확인하세요.
25. 디포커스 범위를 -3.5에서 -4.5 μm까지 4단계로 설정하세요. 일반 항목에서 끝에 닫힌 컬럼 밸브를 활성화하세요. 주요 과제 전후 작업 섹션에서 항목 재정렬 과 기본 과제 전에 미세 중심성을 활성화하세요.

4. 아포페리틴의 단층촬영술 평균화

1. Warp¹⁹를 사용해 모션 보정과 CTF 추정을 수행합니다. AreTomo3²⁰을 사용하여 단층촬영 틸트 시리즈 정렬을 수행하세요.
2. Warp를 이용해 단층촬영 재구성 및 디컨볼루션을 실행하세요. PyTom²¹을 사용해 템플릿 기반 파티클 픽킹을 수행합니다.
3. 초기 정제는 RELION 5²²를 사용해 수행하세요. M²³을 사용해 고해상도 정제를 수행하세요.
4. 8개의 틸트 시리즈를 처리한 후 5,939개의 입자를 선택하고 반복적으로 정제하여 최종 해상도 2.8 Å를 달성하여 최종 구조를 결정합니다(그림 4).

Results

정밀 평행 빔 정렬 후, SerialEM의 그래픽 인터페이스 기능을 사용하여 아포페리틴에 대한 단층촬영 데이터 수집을 수행했습니다. 이후 Warp, AreTomo, PyTom, RELION 및 기타 관련 소프트웨어를 사용해 최종 구조를 2.8 Å 해상도로 만들었습니다. 이 해상도는 우리 데이터의 높은 품질을 충분히 입증하며, 현재 비교적 높은 해상도의 서브토모그래핑 평균화로 달성 가능한 수준에 도달합니다. 그림 4에서 보듯, 정렬 및 재구성된 결과(그림 4A)는 아포페리틴의 전체 구조와 공간적 분포를 명확히 보여줍니다. 8개의 정렬 및 재구성된 틸트 시리즈에서 추출한 입자에 대해 절부촬영술 평균화가 수행되어 2.8 Å 해상도의 구조를 얻었습니다(그림 4B). 해당 푸리에 셸 상관계수(FSC) 곡선은 그림 4C에 제시되어 있습니다.

그림 1: 두 번째 응축 렌즈 시스템을 이용한 평행 조명 조건 결정. (A) 조리개 없는 회절 모드에서의 회절 패턴. (B) 100 μm 대물렌즈 개구 삽입 후 회절 패턴. (C) 가장자리 선명도를 더 잘 시각화하기 위해 회절 중심에서 조리개 오프셋. (D) 초점 조리개 가장자리와 대물렌즈 및 C2 렌즈 전류를 조절하여 회절 링을 최적화했습니다. (E) 스티그메이터 패널을 통해 보정이 필요한 타원형 중심 회절 점. (F) 최적화된 평행 조명을 나타내는 원형의 최소화된 중앙 회절 점. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 서치(115×)에서 뷰(2600×)까지 고배율에서 저배율 정렬 과정. (A) 구멍 가장자리에 표시된 마커(빨간 화살표)가 있는 탐색 모드 이미지. (B) (A)와 동일한 물체 위치에 위치한 마커(빨간 화살표)를 사용하는 모드 이미지 보기. 내비게이터에서 'Shift to Marker' 옵션을 클릭하면 됩니다. (C) 팝업 창에서 두 배율의 빔 이동이 검색 지도의 모든 마커에 할당되고, 이동 값이 저장됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: View(2600×)에서 Record(120k×)까지 고배율에서 저배율 정렬 과정. (A) 기록 모드에서는 목표 객체가 시야 중앙에 위치하며(빨간 점선 원이 목표 객체를 강조함). (B) View 모드에서 촬영된 이미지로, 대상 객체가 빨간 십자선과 정렬되지 않음(빨간색 점선 원이 목표 객체와 빨간 십자선을 강조). (C) 대상 객체를 오른쪽 클릭으로 빨간 십자선의 중앙으로 드래그한 후, Shift 버튼 옆에 있는 Set 버튼을 누릅니다(빨간 점이 버튼 강조). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 아포페리틴의 구조 결정. (A) 구조 영상. 최종 단층도술 평균의 국소 해상도 지도. 질감은 균일하게 보이며, 시야 전체에 걸쳐 촘촘하게 배열된 반복되는 나노 규모 특징들이 있습니다. (B) 공간적으로 해소된 정량적 매핑. 동일하거나 관련된 나노구조 영역의 가짜 색상 원형 지도입니다. 색상은 아래 색상 스케일(임의 단위로 약 2.5에서 3.5)에 표시된 수치에 해당하는 파란색/초록색에서 노란색/빨간색까지 다양합니다. 이질적인 색상 분포는 샘플 전반에 걸쳐 측정된 특성(예: 높이, 두께, 굴절률, 기계적/광학 반응)의 공간적 변동을 나타냅니다. (C) 전역 스펙트럼 또는 기능적 특성 분석. 해상도 추정에 사용되는 푸리에 셸 상관(FSC) 곡선. 최종 해상도 2.8 Å는 FSC = 0.143의 점선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

냉동 샘플 준비 및 전자 단층촬영 데이터 수집 절차는 특정 시료 유형에 맞게 조정되어야 합니다. 여기서 설명한 실험 전략은 생물학적 고분자, 단백질 복합체, 작은 소기관에 적합합니다. 이 시료들은 전자기 격자에 직접 유리화할 수 있으며, 비교적 얇은 두께 덕분에 전자 투과와 고대비 이미지 획득이 가능하다. 이상적으로는 샘플 두께가 200 nm를 넘지 않아야 합니다.

플런지 냉동 시료의 경우, 결정 얼음 형성을 최소화하기 위해 일반적으로 10 μm 미만의 횡방향이 선호되며, 이는 구조적 완전성을 저해할 수 있습니다. 더 큰 샘플의 경우, 고압 냉동이나 글리세롤과 같은 극저온 보호제를 버퍼에 포함시키면 얼음 핵생성²³을 지연시킬 수 있습니다. 그러나 TEM의 두께 요구사항을 충족하기 위해서는 추가 신하가 종종 필요합니다. 사용 가능한 희석 방식 중에서, 정밀하고 손상이 적어 고해상도 극저온 ET에 적합한 층상을 생산하는 집집 이온 빔(FIB) 밀링²⁴가 가장 널리 채택되었습니다.

라멜라 데이터 수집 시에는 라멜라 활용을 극대화하는 것이 매우 중요합니다. 빔-이미지 시프트 획득의 구현은 반복적인 초점 및 추적 단계를 줄여 데이터 수집 처리량을 높일 수 있습니다. 여기서 자세히 설명하지는 않았지만, 이 기법은 PACEtomo 방법론에서 광범위하게 설명되어 있습니다.

현재 단층촬영 데이터 수집을 위한 인기 있는 소프트웨어 옵션으로는 단층촬영(Thermo Fisher Scientific)과 SerialEM이 있습니다. 단층촬영은 맞춤화 유연성이 제한적인 상업용 솔루션인 반면, 콜로라도 대학교 볼더 캠퍼스의 데이비드 마스트로나드가 개발한 SerialEM은 스크립트 기반 자동화를 지원하는 오픈 소스 소프트웨어입니다. 하지만 SerialEM의 기능을 완전히 활용하려면 상당한 학습 곡선이 필요합니다. 본 연구에서는 SerialEM의 GUI를 활용해 스크립팅이나 Python 기반 구성을 없애고 무인 야간 데이터 수집을 가능하게 하는 간소화된 워크플로우를 제시합니다.

이 방법을 이용한 단층촬영 데이터 수집 중 자주 발생하는 문제 중 하나는 부정확한 추적으로, 이는 각도가 누락된 틸트 시리즈가 불완전하거나 이후 정렬을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이러한 문제를 완화하기 위해 추적 매개변수는 샘플의 대비와 틸트 단계 안정성을 기반으로 최적화되어야 합니다. 효과적인 전략으로는 추적 위치에서의 노출 시간을 조정하여 이미지 선명도를 보장하고, 추적 위치와 초점 위치를 물리적으로 분리하여 누적 방사선 손상을 줄이고, 단계 안정성이 좋지 않을 경우 추적 배율을 낮춰 신뢰할 수 있는 패턴 매칭을 돕는 것이 포함됩니다. 이러한 조정들은 다양한 실험 조건에서 견고한 추적 성능을 달성하는 데 필수적입니다. 이 연구에서는 아포페리틴을 모델 표본으로 사용합니다. 병렬광의 테스트 및 보정을 전제로, SerialEM의 내장 기능을 활용해 크라이오-ET용 고품질 데이터를 수집하고, 페리틴 샘플에 대한 아단층촬영술 계산을 수행하여 최종 구조를 2.8 Å로 얻었습니다.

이 방법은 200 kV 전자현미경의 고해상도 극저온 외계 실험 적용 가능성을 확장하기 위해 개발되었습니다. 이러한 해상도를 달성하려면 기본적으로 고품질 영상 데이터를 얻는 것이 중요하며, 이는 정밀한 조명 조건을 요구합니다. 이를 위해 중요한 준비 단계로서 정확한 평행 조명 정렬을 수행했습니다. 여기서 설명한 정렬 절차는 Thermo Fisher Scientific Talos Arctica 및 Glacios와 같은 2-응축기 렌즈 시스템이 장착된 TEM을 위해 특별히 설계되었습니다. 세 번째 콘덴서 렌즈(C3)를 가진 기기와 달리, 이 시스템들은 병렬 조명 조건을 C2 렌즈의 단일 특정 여기 값으로 제한합니다. 이 내재된 제약은 전자 빔을 매우 정밀하게 정렬하여 소스 이미지를 상단 대물렌즈의 전면 초점면에 위치시켜야 하며, 이는 최적의 영상 성능을 위한 전제 조건입니다. 이후 데이터 처리 결과, 이 정렬 후 이 200 kV 현미경으로 테스트된 샘플의 데이터 수집 품질이 일반적으로 300 kV 기기에서 기대되는 품질과 거의 비슷함을 보여줍니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTCryoTM niti grid	나징딩신	M04240922A	냉동 샘플 준비에 사용
아포페리틴	바이오투스	BP17854-00A	냉동 샘플 준비에 사용
교차 격자 격자	아가르 사이언티브	AGS106	평행 빛 조건을 결정하는 데 사용됩니다
글라시오스2	서모피셔	9959084	토모 데이터 수집에 사용
넘버 2 필터 페이퍼, 55mm	왓맨	10311807	블로팅 페이퍼
펠코 이지글로우	테드 펠라	91000-01020	글로우 방전용으로
양화일 Cu 격자	양화일	N1-C14nCu30-01	냉동 샘플 준비에 사용
비트로봇 마크 IV	서모피셔	230101164	냉동 샘플 준비에 사용