형광 단백질을 발현하는 세포에서 텔로미어 FISH 및 면역형광을 수행하기 위한 유연한 절차

요약

이 프로토콜은 텔로미어 FISH(천연 또는 변성)를 면역형광 및/또는 형광 단백질의 시각화와 결합하는 방법을 설명합니다.

초록

TelFISH(Fluorescence in situ hybridization)를 사용하여 텔로미어를 시각화하는 것은 오랫동안 텔로미어 생물학 실험에서 필수적인 도구였습니다. TelFISH와 면역형광(IF)을 결합하는 것은 예를 들어 텔로미어가 53BP1과 공동 국소화되는 텔로미어 기능 장애 유발 병소를 식별하는 데 있어 잘 확립된 방법(IF-TelFISH)이기도 합니다. 보다 최근에는 천연 텔로미어 FISH(nTelFISH)가 일부 종양 세포에서 사용되는 텔로미어 유지 메커니즘인 텔로미어의 대체 연장을 분석하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 형광 단백질을 발현하는 것은 세포 생물학에서도 필수적인 도구로, 다른 방법으로는 감지할 수 없는 단백질과 구조를 시각화할 수 있습니다. FISH는 단백질을 변성시키기 때문에 발현된 형광 단백질(FP)이 있는 세포에서 분석을 수행하면 FP 신호가 손실됩니다. FISH 이후에도 FP 신호를 보존하는 발현 형광 단백질을 가진 세포에서 IF와 텔로미어 FISH를 통합하는 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 변성 및 천연 텔로미어 FISH에 대한 대안이 여러 IF 및 FP 시나리오와 함께 제공됩니다. 종합하면, 이 프로토콜은 정상 세포와 종양 세포 모두에서 텔로미어 생물학을 탐구하기 위한 유연한 프레임워크를 제공합니다.

서론

선형 염색체를 가진 유기체는 두 가지 문제와 싸워야 합니다. 첫째, 말단 복제 문제로 인해 DNA가 복제될 때마다 염색체의 말단이 약간 침식됩니다. 둘째, 세포는 자연적인 DNA 말단과 DNA 절단을 구별할 수 있어야 합니다. 텔로미어는 이러한 문제에 대한 해결책으로 진화했습니다. 리보핵단백질 텔로머라아제의 작용을 통해 인간에서 짧은 직렬 반복-TTAGGG를 추가하여 염색체가 길어집니다. 이러한 반복은 세포 DNA 손상 복구 기계로부터 염색체 말단을 숨기는 쉘테린 복합체에 의해 결합됩니다¹. 짧거나 기능 장애가 있는 텔로미어는 세포 노화 및 노화 표현형으로 이어지는 반면², 텔로미어 위기에서 벗어나는 것은 종양 형성의 주요 이정표입니다³. 이러한 이유로 텔로미어 생물학은 인간의 건강과 질병을 이해하는 데 특별한 관심을 갖고 있습니다.

텔로미어 형광 제자리 혼성화(FISH)는 오랫동안 간기 세포 또는 중기 확산에서 텔로미어를 시각화하는 중요한 방법이었습니다⁴. 수십 년 동안 텔로미어 FISH는 53BP1 면역형광 염색(IF)과 결합되어 기능 장애, 제한되지 않은 텔로미어의 마커인 텔로미어 기능 장애 유발 병소(TIF)를 식별해 왔습니다 ^5,6. 유사하게, 텔로미어 유지를 위해 텔로미어의 대체 연장(ALT)을 사용하는 종양의 특징은 텔로미어와 핵 PML 소체의 연관성으로 ALT 관련 PML 소체 또는 APB를 형성하는 것입니다⁷. APB는 텔로미어 FISH와 PML IF 염색을 결합하여 분석할 수 있습니다. 따라서 IF-FISH는 텔로미어 생물학에서 잘 확립된 도구입니다.

여기서 IF-FISH의 사용은 두 가지 방식으로 확장되었습니다. 먼저, IF-FISH는 발현된 형광 단백질(FP)이 있는 세포에서 수행됩니다. 형광 태그가 지정된 단백질의 발현은 세포 생물학에서 유비쿼터스 도구가 되었습니다. 태그가 지정된 단백질을 발현하는 것은 좋은 항체가 존재하지 않는 단백질을 시각화하는 유일한 옵션일 수 있습니다. 예를 들어, 발현된 GFP 태그 핵 액틴 염색체(nAC-GFP)는 핵 액틴 역학을 나타냅니다⁸. 이 시약은 한때 논란의 여지가 있는 주제로 여겨졌던 핵 f-액틴 탐사에 새로운 기회를 열었습니다. GFP 및 mCherry와 같은 FP는 일반적으로 고정 후 형광 활성을 유지하지만 FISH 혼성화 완충액의 포름아미드는 이를 어둡게 만듭니다⁹. 이 문제를 피하기 위해 이 프로토콜은 IF 염색의 2차 단계에서 형광단 태그가 지정된 항-FP "부스터"의 혁신을 제공합니다. 형광단의 밝기는 포름아미드의 영향을 받지 않으므로 IF-FP-FISH를 허용합니다.

둘째, IF는 ALT 상태에 대한 중요한 진단인 nTelFISH(Native Telomere FISH)와 함께 수행됩니다. FISH를 변성시키면, DNA 가닥⁽¹⁰)을 녹이기 위해 어떤 방법(예를 들어, 열 또는 알칼리)을 사용해야 하며, 이는 일반적으로 이중 가닥인 DNA에 대한 프로브 접근을 허용한다. 대조적으로, 천연 FISH에는 변성 단계가 포함되어 있지 않으므로 프로브는 이미 단일 가닥인 DNA에만 접근할 수 있습니다. 천연 텔로미어 FISH는 종양 세포에서 ALT의 또 다른 특징인 단일 가닥 C-가닥 텔로미어 반복을 특이적으로 검출합니다^11,12. 이 분석을 IF-FP 염색과 결합하면 현재 표적 종양 치료의 강력한 후보로 간주되는 ALT의 메커니즘을 이해하는 데 있어 새로운 질문을 해결할 수 있습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 IF, FP 및 천연 또는 변성 텔로미어 FISH의 모든 조합을 염색하기 위해 "자신만의 모험 선택" 스타일로 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 고도로 구성 가능하기 때문에 타이밍이 크게 달라질 수 있습니다. 일반적으로 실습 시간은 4일 동안 필요하지만 이 날은 순차적이지 않을 수 있습니다. 일반적인 변성 FISH 워크플로우를 완료하는 데 필요한 예상 시간은 그림 1에 나와 있습니다. 토종 FISH는 하룻밤 사이에 교배할 필요가 없으므로 벤치에서 긴 하루를 보낼 수 있는 경우 잠재적으로 하룻밤 단계(2일차와 3일 결합)를 제거할 수 있습니다.

일반적인 공초점 현미경은 대략적으로 파란색, 녹색, 빨간색 및 원적색의 4가지 색상 채널을 이미징합니다. 잠재적인 4색 조합의 네 가지 예가 시연되지만 잠재적인 순열은 끝이 없습니다. 두 개의 IF 항체 또는 두 개의 발현된 FP를 동일한 성공으로 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 간단하고 강력합니다. 자체적으로 좋은 IF 결과를 생성하는 모든 항체가 적합합니다. 여기에는 FISH에 대한 텔로미어 프로브만 포함되지만 중심체 프로브로 FISH를 변성시키는 것도 좋은 결과를 생성합니다. 따라서 이 프로토콜은 핵 생물학의 중요한 질문에 답할 수 있는 광범위한 유연성을 제공합니다.

프로토콜

시작하기 전에 현미경, FP 발현 세포주, 사용 가능한 프로브 및 항체를 고려하십시오. 파란색은 일반적으로 파란색 형광단이 밝지 않기 때문에 DAPI와 같은 DNA 염색에 사용됩니다. 필요한 경우 파란색 2차 항체를 사용할 수 있습니다. 세포가 GFP를 발현하는 경우, 적색 형광단으로 태그된 FISH 프로브를 AF-647로 태그된 IF에 대한 2차 항체와 함께 사용할 수 있습니다. 대안적으로, mCherry를 발현하는 이미징 세포를 위해, AF-488로 표지된 IF 2차 항체 및 AF-647로 표지된 FISH 프로브를 선택할 수 있다. 4가지 가능한 IF-FP-FISH 조합의 예가 그림 2에 나와 있으며 실험 설계 유연성을 장려하기 위한 지침으로 사용됩니다. 이러한 방법은 결합할 수 없으므로 천연 FISH 또는 변성 FISH를 선택하는 것이 중요합니다. 세포 부착을 허용하기 위해 산성 세척 커버슬립에 대한 신뢰할 수 있는 방법이 여기에 포함되어 있습니다. 이는 사용 전 언제든지 완료할 수 있으며 멸균 커버슬립은 무기한 보관할 수 있습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 커버슬립의 산성 세척

참고: 유리 커버슬립은 배양된 세포가 부착될 수 있도록 세척하고 산성 세척해야 합니다. 12웰 플레이트의 성장에는 18mm 원형 커버슬립이 이상적입니다. 현미경 코어 시설에 문의하여 #1 또는 #1.5 커버슬립이 선호되는지 결정하십시오. 커버슬립을 청소하는 데 명시된 시간은 중요하지 않지만 산성 세척을 아끼지 마십시오.

1. 커버슬립 집게(그림 3A)를 사용하여 표면이 닿지 않도록 커버슬립을 랙에 배치하십시오. 필요한 경우 용량을 늘리기 위해 추가 커버슬립을 대각선으로 배치합니다(그림 3B). 여러 랙을 염색 접시에 편안하게 끼웁니다(그림 3C).
2. 염색 접시에 물과 소량의 세제를 채웁니다. 커버슬립이 있는 랙을 접시에 부드럽게 내립니다.
3. 로커나 장동기를 사용하여 비눗물에 커버슬립을 30분 동안 휘젓습니다.
4. 염색 접시에서 커버슬립 랙을 들어 올립니다. 비눗물을 버리십시오.
5. 염색 접시를 헹구고 탈이온수를 채웁니다. 커버슬립 랙을 깨끗한 물에 다시 넣고 로커 위에 올려 5분 동안 부드럽게 교반합니다.
6. 깨끗한 탈이온수를 두 번 더 갈아주어 헹굼을 반복하여 총 세 번 헹굽니다.
7. 염색 접시에서 커버슬립 랙을 들어 올립니다. 접시에 1N HCl을 첨가하십시오.
   주의: HCl은 부식성입니다. 연기통에서 다루고 개인 보호 장비를 사용하십시오. 랙에 있는 커버슬립을 산성 용액 속으로 조심스럽게 내립니다. 1N HCl이 커버슬립을 완전히 덮고 있는지 확인하십시오. 염색 접시에 뚜껑을 덮습니다.
8. 커버슬립과 산성 용액이 들어 있는 염색 접시를 목욕 초음파 발생기의 탱크에 넣습니다. 55 °C에서 15 분 동안 초음파 처리합니다.
9. 커버슬립을 산성 욕조에 밤새 두십시오.
10. 다음날 염색 접시에서 커버슬립 선반을 조심스럽게 제거합니다. 기관 안전 프로토콜에 따라 1N HCl을 폐기하십시오.
11. 염색 접시를 헹구고 탈이온수로 채웁니다. 커버슬립 랙을 깨끗한 물에 다시 넣고 로커 위에 올려 5분 동안 부드럽게 교반합니다.
12. 깨끗한 탈이온수를 두 번 더 갈아주어 헹굼을 반복하여 총 세 번 헹굽니다.
13. 염색 접시에서 커버슬립 랙을 들어 올립니다. 접시를 비우고 70% 에탄올로 채웁니다. 커버슬립 랙을 접시에 다시 넣고 5분 동안 부드럽게 저어줍니다.
14. 염색 접시에서 커버슬립 랙을 들어 올립니다. 접시를 비우고 100% 에탄올로 채웁니다. 커버슬립 랙을 접시에 다시 넣고 5분 동안 부드럽게 저어줍니다.
15. 100% 에탄올과 커버슬립이 담긴 접시를 조직 배양 후드로 가져갑니다. 후드에서 접시에서 커버슬립 랙을 제거하고 자연 건조시킵니다.
16. 접시를 비우고 커버슬립 선반을 다시 넣으십시오. 멸균 상태를 유지하기 위해 뚜껑을 덮고 보관하십시오. 염색 접시는 밀폐되지 않습니다. 커버슬립이 에탄올에 남아 있으면 결국 증발합니다. 커버슬립은 계속 사용할 수 있습니다.

2. 커버슬립에 도금 셀

알림: 커버슬립을 다루려면 연습이 필요합니다. 확신이 있을 때까지 6웰 플레이트로 시작하는 것이 더 쉽습니다. 6웰 플레이트를 사용할 때 12웰 플레이트에 제공된 세척량을 두 배로 늘립니다.

1. GFP 또는 mCherry로 태그된 관심 단백질을 발현하는 건강하고 성장하는 세포를 배양합니다(여러 빨간색 또는 녹색 FP가 적합함, 재료 표의 주석 참조). 텔로미어 유지를 위해 ALT를 사용하는 U2OS 골육종 세포가 표시된 예에서 사용됩니다.
   1. 일시적으로 형질감염된 세포 또는 안정적인 FP 발현을 가진 세포주를 사용합니다. 실험에 약물 처리 또는 형질감염이 필요한 경우, 고정 시 원하는 컨플루언스(일반적으로 70%-80%), 처리 기간 및 세포 성장 속도를 고려하여 커버슬립당 플레이트할 적절한 세포 수를 계산합니다.
2. 무균 상태를 유지하기 위해 조직 배양 후드에 커버슬립을 준비합니다. 12웰 플레이트의 각 웰에 멸균 PBS 1mL를 첨가합니다. 커버슬립 집게를 사용하여 각 웰에 깨끗하고 산으로 세척된 커버슬립 하나를 놓습니다. 몇 초 동안 손으로 부드럽게 저어줍니다.
3. PBS를 흡인합니다. 웰당 1mL의 신선한 멸균 PBS를 추가합니다. 접시를 따로 보관하십시오.
4. (선택 사항) 커버슬립을 피브로넥틴으로 코팅하여 세포 접착력을 향상시킵니다. 많은 부착 세포주는 고정 전 최소 18시간 동안 도금할 때 산성 세척 커버슬립에 잘 부착됩니다. 세포가 잘 접착되지 않거나 도금 직후 고정이 필요한 경우 커버슬립을 코팅하여 접착력을 촉진합니다.
   1. 멸균 PBS에 5μg/mL의 피브로넥틴 용액을 준비합니다.
   2. 커버슬립에서 PBS를 흡인합니다. 약 300μL의 피브로넥틴 용액을 각 커버슬립에 부드럽게 도포하여 표면 장력에 의해 유지되는 물방울을 형성합니다.
   3. 37°C에서 몇 시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   4. PBS로 여러 번 헹구고 PBS의 최종 교체에서 커버슬립을 잡습니다. 세포를 준비하는 동안 플레이트를 따로 보관하십시오.
   5. 피브로넥틴이 적합하지 않은 경우 폴리-L-라이신, 콜라겐 또는 젤라틴을 대안으로 고려하십시오.
5. 세포를 트립신화하고 실험 설계 및 고정 시 원하는 세포 밀도에 따라 12mL의 배양 배지에서 적절한 수를 희석합니다.
6. 커버슬립에서 PBS를 흡인하고 웰당 1mL의 세포 현탁액을 첨가합니다.
7. 세포를 인큐베이터에 넣습니다.
8. 실험 설계에 따라 필요에 따라 약물, siRNA 또는 기타 시약으로 세포를 처리합니다. 원하는 합류로 성장합니다.

3. IF-FP 염색

알림: 프로토콜 전반에 걸쳐 커버슬립이 마르지 않도록 하십시오. 한 손으로 피펫을 넣고 다른 손으로 용액을 흡인하여 커버슬립이 가능한 한 짧은 시간 동안 용액에서 벗어나도록 하는 것이 좋습니다. 커버슬립에 직접 닿지 않고 우물 벽에 부드럽게 용액을 피펫팅합니다. 집게로 커버슬립을 단단하지만 부드럽게 다루십시오. 커버슬립을 너무 세게 잡으면 깨지기 쉽습니다. 처음에는 파손된 경우를 대비하여 중복 커버슬립을 계획하십시오. 경험을 통해 깨진 커버슬립은 드물게 발생합니다. 커버슬립은 마른 우물에서 꺼낼 수 없습니다. 커버슬립은 집어 들기 위해 완충액으로 덮여 있어야 합니다.

1. 선택한 고정액을 사용하여 배지를 제거하고 세포를 고정합니다. 고정 전에 세포를 헹굴 필요가 없습니다. 12웰 플레이트에서 웰당 1mL를 사용하거나 6웰 플레이트에서 웰당 2mL를 사용합니다.
   1. 옵션 1: PBS에 4% 포름알데히드를 사용합니다.
      주의: 포름알데히드는 독성이 있습니다. 장갑을 끼고 다루고 적절하게 폐기하십시오. 16% 메탄올 프리 포름알데히드와 10x PBS 스톡을 사용하여 신선하게 준비합니다. 실온에서 15분 동안 고정합니다.
   2. 옵션 2: 자당(CBS)이 함유된 세포골격 완충액에 4% 포름알데히드를 사용합니다.
      참고: 이 완충액은 세포골격 구조를 보존하는 데 바람직합니다¹³. CBS의 최종 농도는 10mM MES pH 6.1, 138mM KCl, 3mM MgCl₂, 2mM EGTA 및 0.32M 자당입니다. 고정액을 준비하려면 20mM MES pH 6.1, 276mM KCl, 6mM MgCl₂, 4mM EGTA로 2x CBS 스톡을 만듭니다. 별도의 1.28M 자당 재고를 준비합니다. 두 스톡을 모두 4°C에서 보관하십시오. 신선한 작동 고정제의 경우 16% 메탄올 프리 포름알데히드 1부피, 자당 스톡 1부피, CBS 스톡 2개를 혼합합니다. 실온에서 15분 동안 고정합니다.
   3. 옵션 3: -20°C 메탄올로 고정합니다. 핵산 항체 표적(예: ssDNA, G-quadruplexes, RNA-DNA 하이브리드)에 권장됩니다. -20°C에서 5분 동안 고정합니다.
2. 고정액을 흡인하고 제도적 정책에 따라 폐기하십시오.
3. 커버슬립을 PBS로 여러 번 헹굽니다.
   1. 중지 지점: 고정 커버슬립은 신호 손실을 최소화하면서 며칠 동안 4°C에서 PBS에 보관할 수 있습니다. 장기간 보관하려면 100% 에탄올로 탈수(70% 에탄올에서 2분, 90% 에탄올에서 2분, 100% 에탄올에 보관)하고 플레이트를 실험실 필름으로 밀봉하고 -20°C에서 보관합니다. 커버슬립은 이러한 방식으로 몇 주에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 염색할 준비가 되면 커버슬립을 재수화하고(90% 에탄올에서 2분, 70% 에탄올에서 2분, PBS에서 15분) 다음 단계로 진행합니다.
4. 커버슬립을 PBS의 0.5% Triton X-100에서 4°C에서 5분 동안 투과화합니다. 플레이트에서 이 단계를 수행합니다.
5. 커버슬립을 PBS로 여러 번 헹굽니다.
6. 가습 챔버를 준비합니다(그림 3D). 젖은 종이 타월을 챔버 바닥에 놓습니다. 염색을 위한 지지체를 만들려면 12웰 플레이트의 뚜껑 상단에 커버슬립과 일치하도록 라벨을 붙입니다.
   1. 라벨이 계속 보이도록 뚜껑을 실험실 필름으로 덮습니다. 밀착 뚜껑으로 챔버가 차광이 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 호일로 덮습니다(그림 3E).
7. PBS에 담긴 100μg/mL RNase A 75μL 방울을 표지된 지지체에 피펫팅합니다. 각 커버슬립을 부드럽게 집어 들고 실험실 티슈의 가장자리를 두드려 과도한 완충액을 제거합니다. 커버슬립을 RNase A 방울(세포 쪽이 아래로)에 반전시킵니다. 가습 챔버에 지지대를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 37°C에서 45분 동안 배양합니다.
8. 신선한 PBS를 12웰 플레이트에 추가합니다. 커버슬립을 셀 쪽이 위로 향하게 하여 플레이트에 되돌립니다. PBS로 여러 번 헹굽니다.
9. 실온에서 30분 이상 차단합니다. 필름으로 덮인 지지대에서 RNase 용액을 닦아냅니다. PBS에 담긴 20% 당나귀 혈청 75μL를 필름에 피펫팅합니다. 커버슬립을 차단 완충액 위로 뒤집습니다(세포 쪽이 아래로).
10. 1차 항체를 준비합니다.
    1. 커버슬립당 75μL를 사용합니다. 피펫팅 오류를 허용하기 위해 10%를 추가로 준비하십시오.
    2. 항체를 5% 당나귀 혈청에 희석합니다. 경험적으로 항체 희석액을 결정합니다. 1:100 희석이 합리적인 출발점입니다.
    3. 차단하는 동안 1차 항체 배양을 위한 두 번째 표지 지지체를 준비합니다. 뚜껑을 필름으로 덮고 희석된 항체 75μL 방울을 지정된 지점에 도포합니다.
11. 차단 단계가 끝나면 커버슬립을 항체 액적(세포 쪽이 아래로)으로 옮깁니다. 지지대를 가습 챔버에 놓고 뚜껑을 닫은 다음 실온에서 최소 2시간 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
12. 신선한 PBS를 12웰 플레이트에 추가합니다. 커버슬립을 셀 쪽이 위로 향하게 하여 플레이트에 되돌립니다. PBS에서 실온에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
13. 최종 세척 중에 2차 항체를 준비합니다.
    1. 커버슬립당 75μL를 사용합니다. 피펫팅 오류를 허용하기 위해 10%를 추가로 준비하십시오.
    2. 형광 2차 항체 및 GFP/RFP 부스터 항체에는 1:400 희석이 권장됩니다. 대상에 대한 경험을 바탕으로 필요에 따라 조정합니다.
    3. 5% 당나귀 혈청에 2차 항체를 희석합니다. 라벨이 붙은 지지체의 적절한 지점에 75μL 방울을 떨어뜨립니다.
14. 세척 후 커버슬립을 2차 항체 액적(세포 쪽이 아래로)으로 옮깁니다. 밀봉된 가습 챔버에서 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다.
15. 신선한 PBS를 12웰 플레이트에 추가합니다. 커버슬립을 셀 쪽이 위로 향하게 하여 플레이트에 되돌립니다. PBS에서 실온에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.

4. 재고정 및 탈수

1. 재고정을 위해 실온에서 PBS에 4% 포름알데히드를 준비합니다. 초기 고정에 메탄올을 사용하더라도 이 단계에는 포름알데히드를 사용하십시오. 최종 PBS 세척을 제거하고 부드럽게 흔들면서 15분 동안 세포를 다시 고정합니다.
2. 고정액을 흡인하여 제도적 정책에 따라 폐기하십시오.
3. 커버슬립을 PBS로 여러 번 헹굽니다.
4. 커버슬립을 탈수하고 자연 건조하여 혼성화를 준비합니다.
   1. 70% 에탄올에서 2분 동안 배양합니다.
   2. 90% 에탄올에서 2분 동안 배양합니다.
   3. 100% 에탄올에서 2분 동안 배양합니다.
   4. 100% 에탄올 후 표지가 부착된 여과지 위에 커버슬립을 셀 쪽이 위로 향하게 하여 방향을 유지합니다. FISH 프로브를 준비하는 동안 완전히 자연 건조시키십시오.

5. 물고기(옵션 1): 물고기 변성

1. 두 개의 호일 지지대를 준비합니다( 그림 3F 참조).
   1. 알루미늄 호일 조각을 4등분하여 4층으로 만듭니다. 무딘 면이 바깥쪽을 향하고 있는지 확인하십시오.
   2. 접힌 호일을 12웰 플레이트의 뚜껑 안에 맞도록 다듬습니다. 실험실 물티슈를 사용하여 호일을 뚜껑 안쪽에 문질러 뚜껑의 능선이 호일에 패턴을 양각으로 표시하도록 합니다. 이렇게 하면 후속 단계에서 커버슬립이 서로 미끄러지는 것을 방지하는 능선이 생성됩니다.
   3. 그러한 지지대를 두 개 준비하십시오. 이후 실험에서 지워서 재사용할 수 있습니다.
2. 혼성화 완충액(70% 탈이온화 포름아미드, 10mM Tris, pH 7.4, 0.5% 10× Roche 차단 용액)에서 10μM 프로브를 1:50으로 희석합니다. 커버슬립당 75μL의 희석된 프로브를 사용하고 피펫팅 손실을 보상하기 위해 10%를 추가로 준비합니다. 최종 프로브 농도는 200nM이어야 합니다.
3. 히트 블록을 90°C로 예열하고 열순환기를 85°C로 예열합니다.
4. 커버슬립 변성: 공기 건조된 커버슬립을 준비된 호일 지지대 중 하나에 셀 면이 위로 향하도록 놓습니다. 호일을 열순환기 블록에 부드럽게 놓고 뚜껑을 닫습니다. 변성시키기 위해 5분 동안 배양합니다.
5. 동시에 히트 블록에서 희석된 프로브를 90°C에서 5분 동안 가열합니다.
6. 변성 프로브의 75μL 방울을 두 번째 준비된 호일 지지체에 피펫팅합니다. 호일의 칙칙한 면이 위를 향하도록 하여 물방울이 잘 형성될 수 있도록 합니다. 반짝이는 면이 위로 향하면 프로브가 퍼지고 표면 장력이 손실됩니다.
7. 변성된 커버슬립을 프로브 방울에 반전시켜 세포 쪽이 아래로 향하도록 놓습니다.
8. 프로브와 커버슬립이 있는 호일 지지체를 85°C로 설정된 열순환기 블록으로 옮기고 5분 동안 배양합니다. 주걱을 사용하여 이동을 돕습니다. 커버슬립이 부딪히거나 움직이지 않도록 주의해서 이동하십시오.
9. 커버슬립이 있는 호일을 옮기고 가습된 챔버로 조사합니다. 뚜껑을 덮고 실온에서 밤새 배양합니다.

6. 생선(옵션 2): 토종 생선

1. 하이브리드화 완충액(70% 탈이온화 포름아미드, 10mM Tris, pH 7.4, 0.5% 10× Roche 차단 용액)에서 10μM 프로브를 1:200으로 희석합니다. 최종 프로브 농도는 50 nM입니다. 커버슬립당 75μL를 사용하고 피펫팅 오류를 허용하기 위해 10%를 추가로 준비합니다.
2. 희석된 프로브 75μL 방울을 필름으로 덮인 지지대의 지정된 지점에 도포합니다.
3. 변성된 커버슬립을 75μL 프로브 방울 위에 뒤집어 세포 쪽이 아래로 향하도록 놓습니다.
4. 지지대를 가습실에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 실온에서 최소 45분 동안 배양합니다. 원하는 경우 배양을 하룻밤으로 연장할 수 있습니다.

7. 세척 및 장착

참고: 최적의 장착 매체는 현미경 대물렌즈의 개구수에 따라 다릅니다. 권장 사항은 지역 현미경 핵심 시설에 문의하십시오. 한 가지 적합한 선택은 굴절률이 1.52인 NucBlue가 포함된 ProLong Glass일 수 있습니다. 그러나 현재 사용 중인 현미경에 따라 대체 마운팅 매체가 더 적합할 수 있습니다.

1. 세척을 위해 커버슬립을 12웰 플레이트로 되돌립니다. 셀 쪽이 위로 향하도록 반전시킵니다.
2. 70% 포름아미드/10mM Tris, pH 7.5에서 3× 10분 세척합니다.
   주의: 포름아미드는 독성이 있습니다. 제도적 정책에 따라 폐기하십시오.
3. TNT(0.05 M Tris/0.15 M NaCl/0.05% Tween-20, pH 7.5)에서 3× 5분 동안 세척합니다.
4. PBS에서 여러 번 헹굽니다. DNA 염색제가 마운팅 매체에 포함되어 있지 않은 경우 최종 세척에 DAPI를 추가하는 것이 좋습니다. DAPI로 염색하려면 PBS에 300nM DAPI를 첨가하고 커버슬립에 적용한 다음 5분 동안 배양합니다. 기관 지침에 따라 DAPI 솔루션을 폐기합니다.
5. 마운팅 매체 한 방울을 사용하여 유리 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 커버슬립을 방울에 반전시킵니다: 셀 쪽이 아래로 향하도록 합니다.
6. 이미징하기 전에 마운팅 매체가 밤새 경화되도록 하십시오.

결과

이 프로토콜의 일반적인 결과는 그림 4에 나와 있습니다. 제대로 실행되면 세포 형태가 잘 유지되고 형광 신호가 밝아집니다. 변성 텔로미어 FISH는 각 텔로미어를 나타내는 각 핵에서 수십 개의 점점 패턴을 드러내야 합니다( 그림 4, 실시예 1 및 2 참조). 텔로미어 병소는 거의 독점적으로 핵에 존재해야 하지만 세포질 텔로미어 염색은 특히 ALT 세포주에서 때때로 발생합니다. 결과 텔로미어 신호는 매우 밝은 경향이 있으므로 텔로미어 신호가 다른 검출 채널로 흘러드는 것을 방지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. ALT 세포주에서 텔로미어는 종종 PML 소체¹⁴에 모여 일반적으로 예상되는 것보다 더 적은 병소를 초래합니다. 이 클러스터링은 그림 4, 예제 2에서 관찰할 수 있습니다.

텔로미어 유지를 위해 ALT를 사용하는 세포주에서 천연 텔로미어 FISH는 ALT^11,12의 특징인 텔로미어 ssDNA를 검출합니다. 모든 핵이 텔로미어 ssDNA를 가질 것으로 예상되지도 않으며, 소수의 점점이 단일 핵에 존재할 것으로 예상되지도 않습니다(그림 4, 실시예 3 및 4 참조). 네이티브 텔로미어 FISH 신호는 변성 텔로미어 FISH만큼 밝지 않습니다. 골육종 세포주 U2OS는 천연 FISH에 대한 좋은 양성 대조군입니다. 텔로미어 ssDNA는 텔로머라제에 의해 유지되는 텔로미어를 가진 세포주에서 관찰되지 않을 것으로 예상됩니다.

변성 FISH 및 천연 FISH 모두에 대해 강한 핵소체 형광은 인공적입니다. 과도한 핵소체 신호가 관찰되면 RNase A의 새로운 용액을 사용하거나 RNase A 처리¹⁵ 를 연장해 보십시오(프로토콜 단계 3.8). ALT 상태를 알 수 없는 세포를 사용한 천연 텔로미어 FISH 실험의 경우 U2OS와 같은 양성 ALT 세포주를 사용하여 검출 설정을 보정합니다.

IF-FP-FISH 실험에서 FP의 관찰은 검증을 위해 살아있는 세포 이미징 실험과 쉽게 비교할 수 있습니다. 불일치가 관찰되면 다양한 고정 조건을 시도하십시오. CSB 완충액(프로토콜 단계 3.1.2)에 고정하면 세포 구조를 보존하는 데 도움이 될 수 있으며, 보다 정확한 FP 국소화가 나타날 수 있습니다¹³.

면역형광 염색은 관심 있는 단백질에 따라 크게 다릅니다. IF 결과는 FISH 프로토콜이 관심 단백질의 국소화 및 강도에 미치는 영향을 평가하기 위해 FISH 없이 준비된 샘플과 비교해야 합니다. 일반적으로 IF-FP-FISH 실험은 초점 계산에 적합하지만 강도는 정량적이지 않을 수 있습니다⁶.

그림 1: 예상 기간이 있는 예제 워크플로. 1차 항체 배양이 밤새 수행되는 경우 추가로 하루가 필요할 수 있습니다. 네이티브 FISH의 경우 2일차와 3일이 결합되는 경우가 있지만 이로 인해 벤치 시간이 연장됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 4색 이미징에 사용된 성공적인 실험 조합의 예. 실시예 1 및 2는 변성 텔로미어 FISH를 보여주는 반면, 3 및 4는 천연 FISH를 사용합니다. 이 프로토콜은 2개의 표적 단백질을 면역염색하는 경우(실시예 1), 1개의 FP 및 1개의 IF 염색(실시예 2 및 4), 또는 2개의 FP(실시예 3)를 결합하는 경우에 유용하다는 점에 유의한다. 이러한 실험의 대표적인 결과는 그림 4에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 이 프로토콜에 사용되는 장비. (A) 커버슬립 집게. 직선 집게를 사용하여 커버슬립을 처리할 수 있지만 각진 커버슬립 집게를 사용하면 작업이 훨씬 쉬워집니다. (B) 세탁을 위해 랙에 있는 커버슬립. 직선으로 랙을 세우는 것 외에도 커버슬립은 용량을 늘리기 위해 인접한 홈 사이에 각도가 지정되어 있습니다. (C) 염색 접시에 커버슬립 4개 랙. 유리 염색 접시에는 수십 개의 랙 커버슬립이 들어 있으며 HCl 산 세척에 영향을 받지 않습니다. (D) 준비된 가습실. 외부는 호일로 덮여 어두운 환경을 조성하여 형광단을 보존합니다. 바닥에 있는 젖은 종이 타월은 습도를 제공합니다. (E) 밀봉된 가습실. 건조를 방지하려면 꼭 맞는 뚜껑이 필수적입니다. (F) 알루미늄 호일 지지대 만들기. 트리밍된 호일에 능선을 엠보싱하면 변성 단계에서 커버슬립이 서로 미끄러지는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: IF, FISH 및 발현된 FP를 포함한 4채널 이미징 실험의 대표적인 결과. 패널은 그림 2에 설명된 실험의 실제 결과를 보여줍니다. DAPI는 DNA를 염색하고, nAC-GFP는 핵 f-액틴, TelFISH 및 TRF2-mCherry 마크 텔로미어, PML 면역염색은 핵 PML 신체를 표시하고, nTelFISH는 텔로미체 ssDNA를 나타냅니다. 모든 세포는 U2OS 골육종 세포입니다. 이미지는 초고해상도 기능을 갖춘 공초점 현미경에서 획득되었습니다. 실시예 1 이미지는 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 획득되었습니다. 다른 모든 이미지는 구조화 조명 현미경으로 획득되었습니다. 모든 스케일 바는 5μM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

IF-FISH를 사용한 실험은 텔로미어 스트레스 또는 ALT ^5,6,16 검출을 위한 분석으로 오랫동안 텔로미어 분야의 주류였습니다. 여기서, 프로토콜은 형광 단백질을 포함하도록 확장된다. 또한, 천연 텔로미어 FISH의 옵션은 직교 ALT 분석으로 제공됩니다¹¹. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 안정적으로 만족스러운 결과를 생성합니다.

항체 또는 PNA 프로브 방울이 있는 커버슬립에서 작동함으로써 이 프로토콜은 절약되도록 설계되었습니다. 물방울을 사용하면 귀중한 시약을 절약할 수 있습니다. 대조적으로, 챔버 슬라이드와 같은 대안은 가격이 비싸고 유연성이 떨어집니다. 커버슬립을 다루려면 숙련도를 개발하기 위해 연습이 필요하지만 비용 절감으로 인해 시간 투자가 가치가 있습니다. 75μL보다 큰 시약 방울은 권장되지 않습니다. 더 큰 물방울은 커버슬립이 미끄러지게 하고 결과를 개선하지 않습니다.

nAC-GFP의 발현은 그림 4에서 볼 수 있듯이 핵 f-액틴⁸의 시각화를 위한 필수 도구입니다. 중요한 생물학적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있는 다른 많은 태그 시약이 존재합니다. 예를 들어, FUCCI 플라스미드 시스템은 세포 주기를 시각화하는 데 사용될 수 있으며, 이 프로토콜을 사용하여 텔로미어 FISH¹⁷과 결합될 수 있습니다. 세포 주기를 분석하는 다른 접근 방식은 PCNA 염색체를 사용하여 세포 주기 정보를 얻을 수 있습니다¹⁸. 질문에 따라 많은 FP 태그 시약이 상업적으로 이용 가능합니다.

여기서, 이 프로토콜은 텔로미어 FISH로 시연되지만, 동일한 농도의 PNA 프로브를 사용하여 중심체 FISH로도 성공적인 결과를 얻었다. 예를 들어, FAM 표지 중심체 프로브를 Cy3 표지 텔로미어 프로브와 다중화할 수 있습니다. 프로토콜이 단일 유전자좌 DNA FISH에서 작동하지 않을 가능성이 높다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 단일 유전자좌를 프로빙하기 위해서는 샘플의 프로테아제 분해가 필요하며, 이 분해는 IF 또는 FP 검출과 분명히 양립할 수 없습니다¹⁹. 그러나 IF와 mRNA FISH를 유사한 접근 방식으로 결합하는 데 성공했습니다. 분명히 이 시나리오에서는 RNase 처리 단계를 생략해야 합니다.

마지막으로, 천연 텔로미어 FISH가 ALT 상태^20,21에 대한 필수 분석이 빠르게 되고 있음이 분명합니다. 모집단 기반인 ALT에 대한 C-서클 분석과 달리²², 천연 텔로미어 FISH는 세포 수준에서 ALT 판독값을 제공하여 ALT 역학의 변화를 민감하게 감지할 수 있습니다. 천연 텔로미어 FISH를 IF 및 FP 발현과 결합함으로써 ALT 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 밝힐 수 있습니다. 시간이 지나면 이러한 통찰력이 텔로미어 유지를 위해 ALT에 의존하는 종양에 대한 표적 치료법으로 이어지기를 바랍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 % 트윈-20	바이오 래드	1610781	용액이 흐리면 버리십시오.
PBS 10배	깁코	70011044	고정제 및 기타 완충액을 준비하려면 고정 후
12웰 세포 배양 플레이트	눈	150628
16% 메탄올 프리 포름알데히드	써모 사이언티프	28908
5M 염화나트륨	밀리포어 시그마	S6546
부착 세포, 예. U2OS 골육종 세포	ATCC	HTB-96
가습실용 밀폐 상자	메팔	106415032500	적절한 밀폐 상자라면 작동하지만 바닥이 고르지 않은 상자를 조심하십시오.
알코녹스	밀리포어 시그마	Z742914
알루미늄 호일	피셔 사이언티픽	01-213-100
적절한 세포 배양 배지(예: McCoy's 5A)	깁코	16600082	U2OS의 경우 FBS 15% 추가
중심체 프로브(FAM)	PNA 바이오	F3001	여러 형광단을 사용할 수 있습니다.
ChromoTek 핵 액틴-염색체 플라스미드(TagGFP)	프로틴테크	ACG-N
커버슬립 포서	정밀 과학 도구	11251-33
커버슬립 랙	밀리포어 시그마	Z688568
DAPI	인비트로젠	디21490	마운팅 매체에 DNA 염색이 포함되어 있지 않은 경우 선택 사항
당나귀 세럼	잭슨 면역 연구	017-000-121
에그타	바이오월드	40520008	0.5 M 용액 pH 8.0
에탄올	워너-그레이엄	200 프루프
태아 소 세럼	깁코	A5670801
피브로넥틴	밀리포어 시그마	F0635	커버슬립의 선택적 코팅용
포름아미드	밀리포어 시그마	47671-250ML-F
독일 유리 커버슬립	워너 인슈루먼트	64-0714	CS-18R15 (#1.5 두께, 현미경에 적합한지 확인)
GFP 부스터	프로틴테크	gb2AF488	GFP/mClover/YFP/Venus 등을 인식합니다.  전체 목록은 제품 정보를 참조하십시오.
뚜껑이 있는 유리 염색 접시	밀리포어 시그마	900203
디지털 타이머가 있는 가열식 초음파 세척기	브 랜 슨	CPX-952-218R	이 목욕 초음파 발생기 모델에는 열이 포함되지만 구성 가능한 전력이나 강도는 없습니다.
염산	밀리포어 시그마	258148	농축 HCl은 12 N. 입니다. 1N HCl에 대해 220mL의 탈이온수에 20mL의 농축 HCl 첨가
염화마그네슘 용액	밀리포어 시그마	63069	1M 용액
MES	밀리포어 시그마	475893
메탄올	밀리포어 시그마	179337
파라필름	미국 사이언티픽	3023-4526
염화칼륨	밀리포어 시그마	피9541
1차 항체  마우스 안티 PML	산타크루즈	SC-377390
1차 항체  토끼 안티 53BP1	노부스	NB100-904
1차 항체  토끼 안티 PML	비클론	A1184
NucBlue로 유리 연장	인비트로젠	P36981
RFP 부스터	프로틴테크	RB2AF568	mRFP/mCherry/mKate2/mPlum을 인식합니다.  전체 목록은 제품 정보를 참조하십시오.
RNA아제 A	밀리포어 시그마	RNASEA-RO
Roche 차단 솔루션	밀리포어 시그마	11096176001
2차 항체 예. AF488 항마우스	인비트로젠	A-11001	또는 유사
2차 항체 예. AF594 항토끼	인비트로젠	A-11012	또는 유사
2차 항체 예. AF647 항마우스	인비트로젠	A-21235	또는 유사
주걱	피셔 사이언티픽	10257402
멸균 PBS	깁코	14190144	커버슬립 준비용
자당	밀리포어 시그마	에스0389
TelC 프로브(Cy3)	PNA 바이오	에프1002	여러 형광단을 사용할 수 있습니다.
TelG 프로브(AF647)	PNA 바이오	F1014 시리즈	여러 형광단을 사용할 수 있습니다.
트리스 베이스	밀리포어 시그마	648311	물에 1M 용액을 준비하고 HCl을 사용하여 pH를 조정합니다.
트리톤 X-100	밀리포어 시그마	배100
트립신-EDTA(0.25%), 페놀 레드	깁코	25200072
Zeiss Elyra 현미경	자이스		또는 유사