질병 관련 인트론 변이체로 인한 스플라이싱 오류를 조사하기 위한 대규모 병렬 스플라이싱 분석

Summary

여기에서는 인트론 변이를 대량으로 체계적으로 평가하기 위해 미니유전자 구조를 사용하는 대규모 병렬 스플라이싱 분석(MaPSy)을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 앰플리콘 시퀀싱을 통해 세포의 변이체 유도 스플라이싱 변화를 고처리량 분석할 수 있으며, 사전 mRNA 스플라이싱에 미치는 영향에 대한 기능적 평가를 제공합니다.

Abstract

스플라이싱 오류는 희귀 유전 질환을 담당하는 병원성 돌연변이의 10-30%를 나타냅니다. RNA 스플라이싱은 엑손을 선택적으로 결합하고 인트론을 제거하여 적절한 유전자 발현을 보장하며, 주요 조절 서열은 인트론 내에 위치합니다. 5' 스플라이스 부위와 분지 부위는 작은 핵 RNA와 상호 작용하여 스플라이소좀의 인식 복합체를 형성하는 반면, 폴리피리미딘 관 및 스플라이싱 인핸서/소음기와 같은 요소는 단백질을 모집하여 스플라이소좀 조립을 조절합니다. 인트론 변이체의 스플라이싱 중단을 예측하는 것은 이러한 상호 작용의 복잡성으로 인해 어렵습니다.

자연적인 인간 유전자 변이의 90%를 구성하는 인트론 변이는 표준 스플라이싱을 방해하고 질병을 유발할 수 있습니다. 이러한 가능성을 조사하기 위해 우리는 환자가 식별한 인트론 변이를 평가하기 위한 대규모 병렬 접합 분석(MaPSy)을 개발했습니다. 참조 또는 변이 서열을 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드를 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 스플라이싱 미니유전자에 결찰했습니다. 각 구조물은 관심 있는 가변 인트론-엑손 접합 서열을 포함하는 중간 엑손 옆에 있는 두 개의 상수 엑손을 포함했습니다. 변이 서열의 세포 스플라이싱 효율을 참조 서열과 비교하여 스플라이싱 변이체로서 중요한 중단을 식별할 수 있었습니다.

MaPSy의 결과는 생 체 내에서 미니유전자 분석 또는 CRISPR 매개 게놈 편집과 같은 추가 접근 방식을 통해 검증할 수 있습니다. 또한, 중단된 접합부에 대한 집계 분석은 접합 메커니즘 및 접합 오류와 관련된 질병의 분자적 기초에 대한 더 깊은 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Introduction

RNA 스플라이싱은 번역을 위해 엑손을 결합하고 인트론을 제거하여 RNA 수출을 촉진하고 핵산 항상성을 유지하는 중요한 과정입니다. 이 엄격하게 조절된 메커니즘은 시간적, 공간적 방식으로 작동하여 전사체 다양성과 복잡성에 기여합니다¹. 스플라이싱은 5' 스플라이스 부위(5'ss), 분지 부위 및 3' 스플라이스 부위(3'ss)를 포함한 주요 신호와 분지 부위의 하류에 있는 폴리피리미딘 관 및 AG 디뉴클레오티드 배제 구역과 같은 추가 조절 요소에 의해 안내됩니다.^2. 기계적으로 U1 작은 핵 RNA(snRNA)는 5'ss와 짝을 이루는 반면 분지 부위는 U2 snRNA³과 상호 작용합니다. 분지 부위, 폴리피리미딘 간로 및 3'ss의 조화로운 활성은 U2 소핵단백질(snRNP)과 U2 보조 인자의 결합을 촉진하여 스플라이소좀을 안정화하고 5'ss에 대한 친핵 공격을 위한 분지를 배치하여 스플라이싱을 시작합니다.

시퀀싱 기술의 급속한 발전으로 전체 게놈 시퀀싱 비용은 계속 감소하고 있으며, 이로 인해 인간 유전적 변이의 카탈로그가 계속 확장되고 있습니다. 희귀 유전 질환에서 질병 관련 돌연변이의 10-30%가 RNA 스플라^이싱에 영향을 미치는 것으로 추정되며^{4,5,6, 종종} 치료 표적 역할을 할 수 있는 비정상적인 유전자 산물을 생성합니다. 그러나 인트론 변이체의 기능적 영향을 평가하는 것은 종종 중복되고 퇴화되는 접합 신호의 복잡성으로 인해 여전히 어려운 일입니다. 5' 및 3' 스플라이스 부위는 비교적 잘 특성화되어 있지만, 분지 부위, 폴리피리미딘 관 및 기타 스플라이싱 조절 요소는 고등 진핵생물에서 상당한 서열 및 위치 가변성을 나타냅니다. 대규모 매핑 연구는 단일 인트론 ^7,8,9,10 내에 여러 분기 부위가 존재할 수 있음을 추가로 입증하여 인트론-엑손 경계 변이의 해석을 복잡하게 만들었습니다.

딥 러닝은 1차 서열이 스플라이스^{부위 인식에} 어떻게 기여하는지 평가하기 위해 사용되었으며^4,11,12, ^스플라이싱 변이체가 표준 스플라이스 부위에 클러스터링되는 동시에 인트론의 엑손 및 3' 영역으로 드물게 확장된다는 것을 밝혔습니다. 이 패턴은 5' 스플라이스 부위 선택이 주로 합의 서열에 의해 결정되는 반면, 3' 스플라이스 부위 인식은 분지 부위 및 폴리피리미딘 관과 같은 추가 인트론 요소에 의존한다는 확립된 이해와 일치합니다. 그러나 기존 모델은 특히 인트론 변이체에 초점을 맞추기보다는 구성 스플라이스 부위를 대체 또는 인공 부위와 구별하도록 훈련되었습니다. 결과적으로, 이러한 계산 도구는 주로 스플라이스 부위와 엑엑닉 스플라이싱 변이체 13,14,15,16을 식별하는 중간 정도의 예측 정확도만 보여줍니다. 예측 모델 외에도 스플라이싱 변이를 대량으로 검증할 수 있는 실험 시스템은 스플라이싱 결함의 식별 및 특성화를 크게 향상시킬 것입니다.

질병 관련 인트론 변이를 스플라이싱 표현형에 연결하는 포괄적인 RNA 시퀀싱 데이터는 빈도가 낮고 기존 데이터 세트에서 스플라이싱 결과를 예측하기 어렵기 때문에 여전히 부족합니다. 이러한 격차를 해소하기 위해 접합 변이를 체계적으로 분석하기 위해 고처리량 접합 분석 및 계산 모델이 개발되었습니다. MaPSy(Massively Parallel Splicing Reporter Assay)는 스플라이스 부위 선택에 대한 가변 서열의 영향을 평가하도록 설계되었습니다. 5' 및 3' 스플라이스 부위 근처에 서열 변이를 통합하거나 고정된 미니유전자 백본 내에서 전체 인트론-엑손 영역에 걸쳐 MaPSy를 사용하면 스플라이싱 변경의 기능적 평가가 가능합니다. 그러나 대량 올리고뉴클레오티드 합성의 한계로 인해 이 접근법에서는 심층 인트론 변이체 및 유사 엑손 활성화가 포착되지 않습니다.

MaPSy의 견고성은 70개의 독립적인 스플라이싱 미니유전자를 사용하여 검증되었으며, Pearson의 상관관계는 0.89¹⁷입니다. 특히, 스플라이싱 기증자 변이체(+1 및 +2)의 약 90%가 스플라이싱 결함을 나타내 분석의 정확성을 강조했습니다. 또한, 무작위 분지 부위 서열을 갖는 MaPSy는 분지 부위 인식의 퇴행적 특성과 U2 코어 단백질에 대한 의존도를 밝혀냈습니다¹⁸. 또한, 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 결합된 분할 GFP MaPSy 설계는 유전적 변이로 인한 엑손 건너뛰기 사건을 조사하는 데 사용되었습니다. 이 접근법은 스플라이싱 파괴 변이체의 54%가 표준 스플라이스 부위¹³을 포함한 인트론 영역에 상주한다는 것을 밝혀냈으며, 이는 스플라이싱 조절에서 인트론 요소의 중요한 역할을 강조합니다. 종합적으로, 이러한 발견은 스플라이싱 제어에서 인트론 서열의 중요성을 강화하고 질병 관련 스플라이싱 결함을 식별하는 데 있어 MaPSy의 유용성을 보여줍니다(그림 1).

그림 1: 엑손 인트론 돌연변이의 대규모 병렬 스플라이싱 분석(MaPSy)의 실험 설계. 인간 질병 데이터베이스에 기록된 변이체를 수집하여 5,307쌍의 올리고로 합성했습니다. 각 올리고 쌍은 78-뉴클레오티드(nt) 인트론 및 35-nt 엑손 영역에 걸쳐 참조 및 변이 대립유전자를 포함합니다. 올리고는 3-엑손 스플라이싱 미니유전자로의 증폭 및 결찰을 위한 공통 프라이밍 부위로 옆에 있습니다. 따라서, 합성된 영역은 미니유전자의 두 번째 엑손의 3's를 포함한다. 미니유전자 조립 후, 풀링된 미니유전자를 인간 배아 신장(HEK293T) 세포에 접합했습니다. 생성된 스플라이스 이소형을 수확하고 앰플리콘 시퀀싱에 의해 분해했습니다. 이 수치는 Chiang et ^al.17의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

1. MaPSy 올리고뉴클레오티드(올리고) 라이브러리의 합성

1. 기본 올리고 구조: 155-nuncleotide(nt) 풀의 각 올리고를 35-nt 엑손 서열과 80-nt 인트론 서열을 포함하도록 설계하여 각 끝에 20-nt 공통 프라이밍 서열이 옆에 있는 115-nt 유전자 특이적 영역을 형성합니다(그림 2A).
2. 변이체 수집: 모티프 무결성을 유지하고 스플라이싱에 영향을 미치는 조절 영역에 초점을 맞추려면 다음과 같은 인트론 변이체를 수집합니다.
   78에서 +10 nt에서 3 nt
   -3에서 +30 nt 5
   참고: 임상 변이는 ClinVar¹⁹, dbSNP²⁰의 저빈도 항목, 관련 간행물 및 추가 임상 데이터베이스에서 얻을 수 있습니다. 게놈 좌표는 변이를 원하는 게놈 영역과 교차시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, BEDTools²¹ 사용). 대량 합성을 위해 올리고 풀 내의 크기 변동성을 최소화하기 위해 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 및 15nt 미만의 작은 삽입/결실(indel)만 선택해야 합니다.
3. 기본 미니유전자 구조: 스플라이싱 접합 구조를 보존하기 위해 각 미니유전자 백본에는 EGFP의 단편을 암호화하는 2개의 상수 외부 엑손(pGint, Addgene Plasmid #24217에서)과 인간 CAMTA2의 엑손 15에서 파생된 중간 엑손(그림 2B)의 3개의 엑손이 포함됩니다. BamHI 및 SalI 제한 효소로 CAMTA2 단편과 pGint를 모두 분해하고 CAMTA2 단편을 EGFP 엑손 사이의 pGint에 연결하여 pGint-CAMTA2 3-엑손 미니유전자를 생성합니다(보충 파일 1).
   참고: 중간 엑손, 즉 CAMTA2 엑손 15는 표적 세포에서 발현될 때 중간 스플라이싱 효율을 나타내야 합니다. 이 특성은 균형 잡힌 기준선을 제공하여 변형 효과로 인한 접합 효율의 증가 및 감소를 모두 감지할 수 있으므로 필수적입니다.
4. 프라이밍 부위 설계: 각 올리고가 중간 엑손/인트론 내에서 의도한 삽입 부위와 겹치는 ~20-nt 측면 서열을 포함하도록 라이브러리의 양쪽 끝에 삽입 부위 서열을 추가합니다(그림 2A).
   참고: 올리고 풀이 여러 미니유전자 구조체를 위해 설계된 경우, 여러 프라이밍 부위를 통합할 수 있습니다.
5. 바코드 디자인: 인트론 변이체의 경우 인트론 서열이 접합 후 손실되기 때문에 엑손 바코드는 유전자형과 접합된 제품을 구별하는 데 필수적입니다. 바코드 서열(즉, 바코드 효과)으로 인한 스플라이싱 변경을 방지하려면 바코드를 스플라이스 부위에서 멀리 떨어진 엑손 내에서 말단부(즉, 엑손 프라이밍 부위 바로 옆)에 배치합니다.
   참고: 가능하면 변형당 여러 개의 바코드를 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 바코드 길이는 라이브러리 복잡성에 따라 다릅니다. 예를 들어:
   참조 대립유전자가 하나의 변이체와만 쌍을 이루는 경우 1-nt 바코드로 충분합니다.
   참조 대립유전자가 6개의 서로 다른 변이체와 쌍을 이루는 경우 2-nt 바코드가 바람직합니다.
   단일 참조 대립유전자와 밀접하게 관련된 여러 변이체(예: 하나의 뉴클레오티드만 다름)를 갖는 라이브러리는 분석의 복잡성을 증가시킬 수 있습니다.
6. 올리고 주문: FASTA 파일 형식으로 올리고를 주문하고 각 변이체 접합부는 참조 대립유전자와 함께 쌍을 이룹니다.
   참고: 여러 변이체가 있는 접합의 경우 접합부당 하나의 참조 대립유전자만 필요합니다. 풀링된 서열 합성 서비스는 GeneScript(https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience(https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT(https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) 및 Agilent(https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis)와 같은 회사에서 사용할 수 있습니다. 합성 길이, 라이브러리 용량 및 비용은 공급자 및 지역에 따라 다를 수 있습니다.

그림 2: MaPSy를 위한 올리고 및 스플라이싱 미니유전자 설계. (A) 인트론의 3' 또는 5' 말단의 풀링된 올리고 합성을 위한 설계. 다이어그램은 155-nt 올리고의 기본 구조를 보여줍니다. 올리고 합성의 실제 용량은 생산을 위해 선택한 회사에 따라 다릅니다. (B) MaPSy 미니유전자의 설계. 3-엑손 미니유전자(ii)는 pGint 플라스미드(i)에서 변형되었고, 스플라이스 부위는 스플라이싱 신호 변이를 도입하기 위해 풀링된 올리고로 대체되었습니다(iii). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. MaPSy 라이브러리 DNA 주형 구성

1. 올리고 풀을 받을 때의 초기 증폭
   1. 올리고 풀을 받으면 고충실도 DNA 중합효소를 사용하여 100μL 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 설계된 측면 프라이밍 부위로 올리고 라이브러리 10-50ng를 증폭하여 올리고를 이중 가닥으로 전환합니다( 표 1의 LibF 및 LibR 프라이머, 표 2의 열순환기 설정).
   2. 정제 컬럼을 사용하여 PCR 산물을 세척합니다. 세부적으로, PCR 산물을 컬럼 멤브레인에 결합한 다음 70% 에탄올을 함유한 완충액으로 세척하여 잔류 프라이머, 염 및 중합효소를 제거합니다. 마지막으로, 저염 완충액 또는 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 정제된 PCR 산물을 용리합니다.
   3. 겔 전기영동으로 증폭된 올리고 크기를 확인합니다. 정제된 PCR 산물 5μL를 1× TAE 완충액(40mM Tris 염기, 20mM 아세트산, 1mM EDTA, pH 8.0)에서 제조된 1.5% 아가로스 겔에 로드합니다.
      참고: 과증폭 및 PCR 편향을 방지하기 위해 PCR 증폭 주기를 15회로 제한하십시오. 일반적으로 표적 생성물보다 큰 2차 퍼지 밴드는 올리고 풀 내에서 과증폭 및 불완전한 어닐링을 나타낼 수 있습니다. PCR 산물의 일부를 저장하고 올리고 풀을 시퀀싱하여 진행하기 전에 품질 및 오류율을 평가합니다(중지 지점).
2. MaPSy 스플라이싱 미니유전자의 구성 - 초기 PCR.
   1. 백본 단편: 0.5ng의 pGint-CAMTA2 플라스미드 백본을 두 개의 주요 PCR 단편의 소스로 사용합니다.
      1. PCR 산물 1: CMV 프로모터, 첫 번째 엑손(N-말단 EGFP) 및 첫 번째 인트론의 일부를 증폭합니다(표 1 및 표 2).
      2. PCR 산물 3: 중간 엑손(CAMTA2 엑손 15), 두 번째 인트론, 세 번째 엑손(C-말단 EGFP) 및 SV40 폴리아데닐화 신호의 일부를 증폭합니다(그림 3, 표 1 및 표 2).
   2. 라이브러리 앰플리콘: PCR 산물 2: 3'ss 라이브러리의 경우, PCR 산물 1 및 PCR 산물 3의 내부 말단과 일치하도록 양쪽 끝에 중첩된 서열이 있는 라이브러리 앰플리콘을 증폭하여 CAMTA2 엑손 15의 3에서 효율적으로 통합할 수 있습니다(그림 3, 표 1 및 표 2).
      참고: 5'ss 라이브러리의 경우 중간 엑손 접합의 5' 끝을 라이브러리 서열로 바꿉니다.
3. PCR 후 2.1.2단계와 같이 정제 컬럼을 사용하여 모든 제품을 세척합니다. 템플릿 벡터의 오염을 방지하려면 아가로스 겔 추출을 통해 PCR1 및 PCR3에서 원하는 산물을 정제합니다. 구체적으로, 전기영동 후, 표적 PCR 산물을 함유하는 아가로스 겔 ~100 mg을 절제하여 결합 완충액에 용해시킨다. 용해된 겔 용액을 컬럼 멤브레인에 결합한 다음 표준 PCR 정제 프로토콜을 진행합니다.
4. MaPSy 스플라이싱 미니유전자의 구성 - 오버랩 확장 PCR: 3개의 주요 단편(PCR 산물 1, 라이브러리 앰플리콘 및 PCR 산물 3; 각각 ~20ng를 주형으로 사용)을 전체 길이 스플라이싱 미니유전자로 연결하기 위해 1회 또는 순차적인 오버랩 PCR을 수행합니다( 표 1에서 가장 외부 프라이머 CAMGFPF 및 CMVGFPR 사용, 표 2에서 열순환기 설정 사용).
   참고: 최종 산물에는 CMV 프로모터와 올리고뉴클레오티드 라이브러리에서 파생된 처음 3's가 있는 3개의 엑손이 포함되어 있으며 세포 기반 실험을 위해 형질감염이 가능합니다.
5. 조립 후 PCR 정제 컬럼을 사용하여 전장 DNA 템플릿을 세척합니다. 겔에서 비특이적 밴드가 관찰되면 겔 추출을 수행하여 2.3단계와 같이 원하는 전장 생성물을 정확하게 분리합니다.
   참고: 라이브러리에서 매우 유사한 서열은 불완전한 조립으로 이어질 수 있습니다. 단일 PCR 반응에서 전체 조립이 어려운 경우 순차적 중첩 PCR(두 개의 단편으로 시작한 다음 세 번째 단편 추가)을 시도할 수 있습니다. PCR 특이성을 향상시키려면 어닐링 온도를 조정하거나 터치다운 PCR을 구현하여 복잡한 템플릿에 대한 결합 특이성을 향상시키는 것이 좋습니다. 최소 4개의 독립적인 실험을 수행하기에 충분한 MaPSy 구조를 준비합니다. 일부 올리고뉴클레오티드는 효율적으로 증폭되지 않고 불완전한 조립(정지점)을 초래할 수 있으므로 서열 무결성을 확인하기 위해 차세대 시퀀싱을 위해 각 구조물의 작은 분취량을 저장하십시오.

그림 3: 라이브러리 구축 워크플로. (A) 중첩 PCR에 사용되는 프라이머( 표 1 참조). (B) 중첩 PCR 절차. 간단히 말해서, 올리고 풀과 스플라이싱 미니유전자의 다른 부분은 25 PCR 주기에 의해 증폭되었습니다. 프로모터와 제1 엑손(PCR 산물 1)을 포함하는 단편을 20회 증폭 주기를 사용하여 PCR을 겹쳐 올리고 풀(PCR 산물 2)에 꿰매었습니다. 그런 다음, 스티칭된 생성물(PCR 산물 1+2)을 20회 증폭 주기를 사용하여 3^{번째 엑손} 및 폴리아데닐화 신호(PCR 산물 3)를 포함하는 단편에 추가로 스티칭하여 최종 구축물(PCR 산물 1+2+3)을 얻었다. 이 수치는 Chiang et ^al.17의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MaPSy 라이브러리 입문서 구성		메모
CMVGFPF	CCGCCATGCATTAGTTATTAATAG	PCR 산물 1
LibR2	CAGGTCTTCAGGCCCCAGCC	PCR 산물 1
LibF	GGCTGGGGCCTGAAGACCTG	PCR 산물 2
리브R	AAGGCGCACATGACCCCGGG	PCR 산물 2
LibF2	CCCGGGGTCATGTGCGCCTT	PCR 산물 3
CMVGFPR	GGACAAACCACACAACTAGAATGC	PCR 산물 3
앰플리콘 시퀀싱을 위한 MaPSy 라이브러리 PCR 프라이머
P7-lib0F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib2F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib3F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-lib0RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib1RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-lib2RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib3RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
검증 입문서
Lib0F(라이브러리 유효성 검사)	AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R(라이브러리 유효성 검사)	CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

표 1: 이 프로토콜에 사용되는 프라이머.

PCR 반응 믹스
구성 요소	음량
ddH2O	13.4 μL
5x HF 버퍼	4 μL
10 mM dNTP	0.4 μL
포워드 프라이머 10 μM	0.5 μL
리버스 프라이머 10 μM	0.5 μL
씨DNA	1 μL
충실도가 높은 DNA 중합효소	0.2 μL

PCR 프로그램 실행(20 μL 반응)
	임시 직원	시간	사이클
초기 변성	98°C	1 분	1
변성	98°C	30초	10–20
어 닐 링	65°C	30초
확장	72°C	30초	변성으로 돌아가기
최종 연장	72°C	5 분	1
들다	4°C	들다	들다

표 2: 열순환기 설정.

3. 포유류 세포에서 스플라이싱 미니유전자의 발현 및 회수

1. 세포 배양: 10% 태아 소 혈청(FBS), 100단위/mL 페니실린 및 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민을 37°C에서 5% CO₂ 로 보충한 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)에서 HEK293T 세포를 유지합니다.
2. 스플라이싱 미니유전자의 형질감염:
   1. 형질감염 24시간 전에 6웰 플레이트의 배지 2mL에 5 × 10⁵ HEK293T 세포를 플레이트합니다.
   2. 제조업체의 프로토콜에 따라 3.75μL 형질감염 시약으로 5분 동안 사전 배양한 1-2μg의 MaPSy 구조물로 세포를 형질감염시킵니다. 성공적인 형질감염은 스플라이싱된 라이브러리에서 EGFP 신호의 존재로 표시됩니다.
   3. 형질감염 후 24시간 후에 250μL Trizol(또는 등가물)을 사용하여 세포를 용해합니다.
3. RNA 추출: 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 미니프렙 키트를 사용하여 총 RNA를 추출합니다. 구체적으로, Trizol의 RNA를 컬럼 멤브레인에 결합하고, 70% 에탄올을 함유한 완충액으로 세척하여 염, 단백질 및 기타 불순물을 제거하고, 저염 완충액 또는 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 정제된 RNA를 용리합니다.
   주의 : Trizol(또는 이에 상응하는 제품)은 부식성이 강하고 독성이 강합니다. 노출되면 심각한 화학적 화상, 영구적인 흉터 및 신부전이 발생할 수 있습니다.
   참고: RNA는 Trizol(또는 TOOLS의 TOOLSmart RNA 추출기와 같은 동등한 Trizol 기반 시약)에 최대 1년(중단점) 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 정제된 RNA는 동결-해동 주기가 최소화되는 경우 최대 2년 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다(정지 지점).
4. 역전사: 제조업체의 프로토콜에 따라 무작위 육량질체와 함께 역전사 효소를 사용하여 총 RNA 2μg에서 cDNA를 준비합니다. 구체적으로, RNA를 실온에서 50μM 랜덤 육사질체와 함께 10분 동안 배양하여 어닐링을 허용한 후 55°C에서 10분 동안 역전사를 수행합니다.
   참고: cDNA는 -20°C에서 최대 1년(정지점) 동안 보관할 수 있습니다.
5. 스플라이싱된 미니유전자의 증폭: 스플라이스된 미니유전자에 대한 특정 프라이밍 서열을 사용하여 PCR을 수행합니다(표 2). 아가로스 겔에서 제품을 시각화하는 데 필요한 최소한의 사이클 수를 사용하십시오.
   참고: 접합되지 않은 제품과 접합된 제품의 혼합 밴드가 젤에 표시되어야 합니다. 밴드는 DNA 종의 혼합 집단으로 인해 확산된 것처럼 보일 수 있습니다(그림 4A).
6. 2.1.2단계와 같이 정제 컬럼을 사용하여 PCR 산물을 세척합니다.
7. 시퀀싱 어댑터 부착: PCR의 마지막 라운드를 수행하여 시퀀싱 어댑터 서열을 앰플리콘 말단에 부착합니다. NextSeq 플랫폼에서 균형 잡힌 형광 검출을 보장하기 위해 앰플리콘 끝에 0-3개의 무작위 뉴클레오티드를 포함합니다(표 1).
8. 2.1.2단계와 같이 정제 컬럼을 사용하여 PCR 산물을 세척합니다.

4. 앰플리콘 시퀀싱 및 분석

1. 숏 리드 시퀀싱: 핵심 시설 또는 상용 서비스를 통해 Illumina Miseq, Novaseq 또는 이에 상응하는 제품을 사용하여 PCR 앰플리콘을 150개의 쌍 말단 시퀀싱에 노출시킵니다.
2. 맞춤:
   1. 참조 게놈 만들기: 각각의 고유한 유전자형을 별도의 염색체로 라벨링하여 합성 "참조 게놈"을 만듭니다. 참조 게놈에는 앰플리콘 내에 포함된 합성 엑손과 인트론이 포함됩니다.
   2. 시퀀싱 판독 정렬: HISAT2 ^22,23을 사용하여 쌍단 판독을 참조 게놈에 정렬하고 스플라이싱 특정 요소를 제어하도록 매개변수를 조정합니다(명령줄 세부 정보는 보충 파일 2 참조).
   3. 고품질 읽기 선택: SAM을 BAM 형식으로 변환하고, 고품질 읽기를 필터링한 다음(매핑 품질≥60) BAM^{파일을 정렬} 하고 인덱싱합니다(명령줄 세부 정보는 보조 파일 2 참조).
   4. 스플라이스 접합 식별 및 접합 판독 계산: 정렬된 BAM 파일의 CIGAR 문자열에서 엑손 건너뛰기 이벤트를 추출하여 스플라이스 접합 사용량을 정량화합니다. "N" 연산을 기반으로 접합 스패닝 읽기를 식별하고 접합 좌표 및 가닥당 읽기 수를 집계하여 접합 패턴을 평가합니다(명령줄 세부 정보는 보충 파일 2 참조).
   5. 표준 스플라이스 사이트 분류: 주석이 달린 GT-AG 접합과 일치하는 경우 스플라이스 사이트를 표준 사이트로 분류합니다.
      참고: 드문 경우지만 MaPSy의 참조 대립유전자는 비표준 스플라이스 부위를 활용할 수 있습니다. 지정된 스플라이스 사이트 위치에 걸쳐 접합이 없는 판독은 접합되지 않은 판독으로 유지됩니다.
3. 스플라이싱 변이를 식별하기 위한 통계 분석: 판독을 세 그룹으로 분류합니다.
   (1) 접합된 읽기와 접합되지 않은 읽기;
   (2) 모든 접합된 읽기 중 표준 대 비표준 읽기;
   (3) 표준 대 비표준 및 접합되지 않은 읽기.
   양측 피셔의 정확 검정을 수행한 다음 FDR(False Discovery Rate) 보정(표 3)을 수행하여 변이체가 접합 효율성과 정확도에 미치는 영향을 평가합니다.
4. 신뢰도가 높은 스플라이싱 변이체에 대한 필터링: 4개의 반복에서 q-값이 0.05 미만인 100개의 읽기 횟수를 초과하는 참조/변이체 쌍을 모두 유의한 것으로 분류합니다. 그런 다음 참조 또는 변이 대립유전자가 >5%의 비접합 및 비표준 판독, 신뢰도가 높은 접합 변이체를 갖는 2배 승산비 변화가 있는 후보를 고려합니다(그림 4B).

읽습니다	접합	접합되지 않은 및/또는 비표준
참조	a	b
변체	c	d

표 3: 피셔의 정확 검정에 대한 2x2 표.

5. 검증

1. 검증을 위한 Minigene 스플라이싱:
   1. 올리고 합성 및 증폭: 선택된 MaPSy 후보 서열의 DNA 올리고를 개별적으로 합성합니다(예: 통합 DNA 기술에 의해). 그런 다음 고충실도 DNA 중합효소를 사용하여 PCR에 의해 설계된 측면 서열을 사용하여 올리고를 이중 가닥으로 증폭합니다(표 2).
   2. 미니유전자 클로닝: 생성된 PCR 산물과 pGint-CAMTA2를 BbsI 및 SmaI 에 의해 모두 분해하고 분해된 산물을 DNA 리가아제에 의해 연결합니다.
   3. 형질감염: 3.2.2단계와 같이 형질감염 시약을 사용하여 생성된 구조물을 HEK293T 세포에 형질감염합니다.
   4. RNA 추출: 3.3단계에 설명된 대로 형질감염된 세포에서 RNA를 추출합니다.
   5. 역전사: 무작위 육사질체를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행합니다.
   6. 스플라이싱 이소형 증폭: 미니유전자의 처음 두 엑손을 표적으로 하는 프라이머로 스플라이싱 이소형을 증폭합니다(Lib0F 및 Lib0Rl, 표 1, 표 2의 열순환기 설정). 전기영동으로 증폭된 생성물을 분리하고 Gel Doc System을 사용하여 시각화합니다.
   7. 정량화: ImageJ(National Institutes of Health, USA)^25,26을 사용하여 각 스플라이싱 이소형의 신호 강도를 정량화합니다. 또는 eGENE HDA-GT12 고성능 핵산 분석기를 사용하여 DNA 스크리닝 키트를 사용하여 PCR 산물의 강도와 분자량을 정량화합니다.
   8. 이소형 추출 및 확인: 2.3단계로 아가로스 겔 추출로 각 이소형 분리하고, 핵심 시설 또는 상용 서비스를 통해 PCR 산물의 Sanger 시퀀싱으로 스플라이싱 결과를 확인하고, 정상 스플라이싱, 인트론 포함 및 엑손 건너뛰기를 평가합니다.
2. 다중 엑손 스플라이싱 미니유전자:
   1. MaPSy 결과를 검증한 후 관심 있는 변이를 선택하고 게놈 DNA(gDNA)에서 3-5개의 엑손을 복제하여 관찰된 스플라이싱 결함에 대한 보다 게놈 컨텍스트를 제공합니다.
   2. 돌연변이 유발 프라이머 및 중첩 PCR을 사용하여 부위 특이적 돌연변이 유발을 수행하여 표적 부위에 원하는 서열 변경을 포함하는 미니유전자 구조물을 조립합니다.
      참고: 측면 인트론이 클로닝하기에 너무 긴 경우, 적절한 스플라이싱 컨텍스트를 보장하기 위해 각 스플라이스 부위에 대해 약 300nt의 인트론 서열을 유지합니다.
   3. 위의 5.1에서 설명한 대로 세포 기반 스플라이싱 분석을 수행합니다.
3. 세포 검증: 세포의 스플라이싱 효과를 검증하려면 템플릿 기반 CRISPR 편집을 사용하여 적절한 세포 모델에서 선택한 변이체의 서열을 변경합니다.
   참고: 가능하면 특정 변이를 포함하는 인간 샘플을 사용하여 접합 패턴을 직접 평가하십시오.

Results

MaPSy 구조체의 세포 접합 후, 접합된 산물과 접합되지 않은 산물이 모두 혼합물로 존재합니다. 라이브러리의 크기 다양성과 비표준 스플라이싱 가능성으로 인해 두 가지 유형의 제품 모두 젤에서 다소 확산된 것처럼 보일 수 있습니다. 3' 말단을 표적으로 하는 구조에서 부분 아데노바이러스 서열을 포함하는 두 번째 인트론은 매우 강력하게 접합되는 경향이 있습니다(그림 4A).

MaPSy 실험에서 질병 관련 변이체의 약 10-30%는 변경된 접합을 나타내며, 대부분의 중요한 사례는 표준 접합 효율이 감소한 것으로 나타났습니다(그림 4B). 비표준 스플라이싱은 스플라이싱 변이체 풀을 약간 이동할 수 있지만, 스플라이스 부위 경쟁 프레임워크 내에서 비표준 스플라이스 부위를 촉진하는 변이체를 식별하려면 분석에 이러한 이벤트를 포함하는 것이 필수적입니다(

Discussion

MaPSy 구조의 고유 EGFP 신호는 엑손 건너뛰기의 형광 기반 검출을 가능하게 합니다. 중간 엑손 또는 인트론의 서열이 엑손 건너뛰기를 촉진하는 경우, 첫 번째 및 세 번째 엑손의 결찰은 FACS에 의해 검출 가능한 EGFP 신호를 생성하므로 이는 엑손 건너뛰기에 영향을 미치는 변이체를 식별하고 스플라이싱 변이체의 현미경 기반 시각화를 용이하게 하는 귀중한 방법입니다¹³. 그러나, 본원에 기술된 앰플리콘-시퀀싱 접근법은 엑손-건너뛰기 산물을 포착하지 못하는데, 이는 이들이 라이브러리 정보를 결여하지 않기 때문에, 따라서 시퀀싱되지 않는다. 결과적으로, 우리의 방법은 엑손 건너뛰기를 유도하는 변이를 직접 식별하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 이전 분석에 따르면 표준 스플라이싱을 줄이는 변이체는 종종 비표준 스플라이스 부위 사용 및 엑손 건너뛰기^17,27

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Direct-zol RNA MiniPrep Plus 키트	자이모 리서치	R2072
덜베코' s 수정된 독수리' s 중간(DMEM)	써모 피셔 사이언티픽	11965084
태아 소 혈청(FBS)	써모 피셔 사이언티픽	26140079
L-글루타민	써모 피셔 사이언티픽	A2916801
리포펙타민 3000	써모 피셔 사이언티픽	L3000015
페니실린-스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽	15140122
pGint 플라스미드	아드진	24217
Phusion 고충실도 DNA 중합효소	써모 피셔 사이언티픽	F530L
QIAquick 젤 추출 키트	키아겐	28706
QIAquick PCR 정제 키트	키아겐	28106
QIAxcel DNA 스크리닝 키트 (2400)	키아겐	929004
SuperScript IV 역전사 효소	써모 피셔 사이언티픽	18090010