방법 논문

연구 및 치료를 위한 조작된 바이러스 벡터의 재조합 기반 제조

DOI:

10.3791/68988

⸱

2025년 9월 26일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

이 논문에서

요약

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재조합 매개 유전 공학 방법인 재조합은 효소 소화에 의존하지 않고 정확한 바이러스 게놈 변형을 가능하게 합니다. 이러한 접근 방식은 표적 결실과 같은 기초 연구와 종양 용해 요법, 유전자 치료 및 유전자 백신에 사용되는 조작 바이러스 개발에 매우 중요하며 연구 및 임상 응용 모두에서 가능성을 확장합니다.

초록

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기초 연구와 중개 연구 모두에서 조작된 바이러스 벡터에 대한 수요가 증가함에 따라 재조합 DNA 바이러스를 생성하기 위한 유연하고 신속하며 확장 가능한 방법의 필요성이 강조되었습니다. 제한 효소 분해 및 결찰에 의존하는 전략은 서열 의존적 제한과 시간이 많이 걸리는 클로닝 단계에 의해 제약을 받습니다. 여기에서는 박테리아 인공 염색체(BAC)에서 바이러스 게놈의 정확하고 원활한 변형을 가능하게 하여 이러한 한계를 우회하는 재조합 매개 유전 공학 방법(재조합)에 대해 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 코딩 또는 비코딩 유전 요소의 효율적인 삭제, 삽입 또는 대체가 가능하여 처리량이 많은 바이러스 벡터 개발을 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 재조합은 바이러스 유전자의 기능을 조사하기 위한 결실 또는 돌연변이와 같은 기초 연구 응용 분야에서 특히 유용합니다. 더 중요한 것은 이 방법론을 통해 고유한 면역자극 또는 치료 페이로드를 병렬로 암호화하는 수십 개의 재조합 바이러스를 생성할 수 있어 새로운 구조의 신속한 전임상 평가에 매우 적합하다는 것입니다. 이 기술은 잠재적으로 모든 과학적 목적으로 구현될 수 있지만, 이 기사에서는 단순 포진 바이러스를 기반으로 한 종양 용해성 바이러스 생성과 유전자 전달을 위한 비복제 아데노바이러스 벡터 개발이라는 두 가지 특정 영역에서 재조합의 적용에 중점을 둡니다. 결론적으로, 재조합은 바이러스 게놈 공학에 대한 다양한 접근 방식을 제공하여 설계부터 기능 테스트까지 파이프라인을 크게 가속화합니다. 그 관련성은 진화하는 연구 및 임상 요구 사항을 충족하기 위해 기초 바이러스학에서 중개 의학에 이르기까지 다양합니다.

서론

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바이러스 벡터는 유전 물질을 숙주 세포에 전달하는 자연적인 능력으로 인해 유전자 치료, 종양 용해성 바이러스 요법 및 유전자 백신 개발의 강력한 도구로 부상했습니다. 그들은 바이러스의 자연적인 향성 및 형질도입 메커니즘을 활용하여 일시적이고 장기적인 유전자 발현을 모두 촉진합니다. 그들은 세포외 환경에서 생존할 수 있고, 특정 세포 수용체(바이러스 친화성을 정의함)에 부착하고 내재화를 촉진하고, 숙주 세포 유전자 발현 기계를 가로채고 자체 유전자의 발현을 유도하고, 선천성 면역군의 막 결합 및 세포내 센서를 피할 수 있습니다 1,2. 이런 식으로 생산적인 바이러스 감염 후 바이러스는 세포를 바이러스 자손 공장으로 변형시켜 새로운 바이러스를 유기체에 퍼뜨려 결국 질병을 일으킵니다.

야생형 바이러스는 유전 공학을 통해 생명공학 도구로 변형될 수 있으며, 게놈을 쉽게 조작하여 형질도입 능력을 유지하고 임상 결과를 얻을 수 있습니다. 이들의 임상 적용에 기초하여, 바이러스 벡터는 복제 능력에서 (적어도 부분적으로) 유지하거나 절제되도록 조작되어 복제 능력 또는 복제 무능력 벡터를 생성할 수 있다 3,4.

복제 능력 바이러스는 주로 종양 용해 바이러스 목적으로 사용됩니다. 종종 항바이러스 방어력이 결핍된 암세포1는 독성 유전자의 결실을 통해 조작된 약독화된 재조합 바이러스의 복제를 허용합니다. 이 바이러스는 정상 조직을 보존하면서 종양에서 선택적으로 복제합니다. 바이러스학에 대한 이해가 발전함에 따라 약독화 바이러스는 안전성과 치료 효능을 모두 향상시키기 위해 고안된 보다 정확한 게놈 변형으로 대체되었습니다.

바이러스 게놈의 외과적 분자 공학을 필요로 하는 관심 분야 중에는 다음과 같은 것들이 있다: i) 바이러스 프로모터가 종양 관련 프로모터(종양 세포에서 과전사된 세포 프로모터)로 대체되어 바이러스 유전자 발현을 병든 세포로 제한하는 복제 조건부 종양 용해성 바이러스5. ii) 변질된 향성을 갖는 바이러스 6,7, 여기서 감염을 결정하는 외피 당단백질은 종양 세포에서 과발현된 단백질을 표적으로 하는 항체 단편 또는 리간드로 변형되거나 대체될 수 있습니다 8,9. iii) 무장 종양 용해성 바이러스. 종양 용해성 바이러스에 의해 유도된 종양 세포 사멸은 염증 매개체 1,10 및 종양 항원11의 방출을 특징으로 하는 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유발합니다. 이러한 신호는 면역 체계에 의한 종양 항원의 효율적인 인식을 촉진하여 감시12를 회복하고 면역 체크포인트 억제제13,14,15 및 RNA 기반 치료제 및 백신과 같은 다른 면역 치료제와의 병용을 가능하게 합니다16.

이러한 면역 치료 효과를 지원하기 위해, 관심 있는 이식유전자는 바이러스 게놈 내에서 암호화될 수 있으며, 이에 따라 바이러스의 종양 용해 활성뿐만 아니라 관련 페이로드 3,7,17,18,19의 현장 생산을 통해 면역 치료 잠재력을 향상시킬 수 있다. 이러한 페이로드는 사이토카인, 케모카인, 항체, 자살 유전자 및 항원을 포함할 수 있습니다 3,20. 삽입에는 정확성이 필요하며, 바이러스 유전자의 파괴를 최소화하고 복제 및 효능을 보존하기 위해 바이러스 게놈의 유전자간 영역이 선호됩니다7. 따라서 최적의 삽입 부위와 관심 있는 이식유전자를 모두 스크리닝할 수 있는 기술이 필수적입니다.

한편, 유전자 치료에 사용되거나 유전자 백신의 매개체로 사용되는 비복제 바이러스의 맥락에서 바이러스 벡터는 독성을 피하기 위해 숙주 세포로 복제하지 않고 이식유전자(일시적 또는 오래 지속됨)를 전달하는 것이 중요합니다21. 아데노바이러스 벡터는 높은 형질도입 효율, 전이유전자의 강력한 발현, 분열 및 비분열 세포 모두를 감염시키는 능력을 특징으로 합니다3. 이러한 특성으로 인해 COVID-19와 같은 신종 전염병과 유전자 대체 요법을 포함한 유전자 백신 개발에 있어 동급 최초가 되었습니다22. 시장에 출시된 아데노바이러스 벡터의 가장 유명한 예는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 암호화하는 변형된 침팬지 아데노바이러스인 ChAdOx1을 기반으로 하는 Covishield 또는 Vaxzevria의 상업적 이름으로 알려진 옥스퍼드-아스트라제네카 COVID-19 백신입니다. 근육 내 경로로 주사하면 Covishield는 세포 내부에 침투하여 스파이크 단백질의 발현을 유도하여 면역 체계가 이에 대한 면역 반응을 일으키도록 프라이밍할 수 있습니다3.

제한 효소 인식 부위의 제약 없이 바이러스 게놈을 변형해야 할 필요성이 분명합니다. 종양 용해성 바이러스 중에서, 단순 포진 바이러스-1 (HSV-1) 기반 벡터는 용해 능력, 안전성 및 큰 게놈 크기를 포함한 고유한 이점을 제공하여 상당한 형질전환유전자 또는 여러 유전 요소를 삽입할 수 있습니다23,24. HSV 외에도 다른 많은 바이러스가 최근 Sasso et al.3에서 검토한 바와 같이 치료 가능성을 보여줍니다. 보편적인 "동급 최고" 벡터가 아니라 다양한 바이러스 플랫폼이 서로 다른 치료 요구에 적합합니다3. 현재 박테리아 또는 하이브리드 효모-박테리아 복제의 상동 재조합 시스템은 제한 효소에 대한 가장 일반적인 대안으로 남아 있지만 이는 힘들고 다단계적이며 비효율적입니다25.

새로운 대안은 최근 백시니아 바이러스(VV), 단순 포진 바이러스 및 아데노바이러스 벡터를 포함한 바이러스의 게놈 조작에 적용된 CRISPR/Cas9의 사용입니다. Cas9는 인델 돌연변이를 통한 유전자 비활성화에 호소하지만 게놈 세그먼트를 삭제하거나 기증자 DNA를 통해 이식유전자를 삽입하기 위해 여러 절단이 필요한 경우 실용성이 떨어집니다. 또한, 편집은 gRNA 설계, 바이러스 및 숙주 게놈 모두에서 표적 이탈 효과, 관심 영역의 PAM 서열에 대한 의존성에 의해 제한됩니다25.

이를 염두에 두고 HSV와 아데노바이러스를 기반으로 한 두 가지 예를 통해 이 기사에서는 바이러스에서 박테리오파지, 복잡한 플라스미드 및 다양한 실험 시스템에 이르기까지 광범위하게 적용할 수 있는 재조합 방법을 설명합니다. 재조합(상동 RECOMBInation 매개 유전 공학)은 주로 대장균에 사용되는 생체 내 유전 공학 기술로, 온도 의존성 박테리오파지 재조합 단백질을 이용하여 30bp의 상동성으로 DNA 요소 간의 상동 재조합을 촉매합니다26. 이 접근 방식을 사용하면 제한 부위나 DNA 크기에 의존하지 않고 서열을 정확하게 삽입, 삭제 또는 수정할 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 열 유도성 대장균 균주 SW102를 기반으로 한 버전을 설명하지만 특정 유도성 시스템을 가진 대체 균주도 사용할 수 있습니다27.

재조합은 파지 재조합 기계를 활성화하기 위해 제어된 온도 충격을 통해 전기 적격 박테리아 세포를 준비하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 적절한 상동성 팔을 운반하는 DNA 분자를 전기천공합니다. 이들은 제한 분해 또는 PCR에 의해 생성된 이중 가닥 DNA(dsDNA) 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA)일 수 있습니다. 활성 재조합 단백질과 함께 상동 서열이 존재하면 원하는 변형을 가진 새로운 DNA 분자를 생성할 수 있습니다.

재조합 분자 복제 기술은 정밀한 유전 공학을 가능하게 하며 플라스미드, 박테리아 염색체 DNA, 박테리아 인공 염색체(BAC)에 선택 가능 또는 선택 불가능한 마커 삽입 등 다양한 맥락에 적용됩니다. BAC는 아데노바이러스 및 HSV DNA를 포함한 큰 게놈 단편을 복제하는 데 특히 유용하여 바이러스 벡터의 신속한 생산을 가능하게 합니다. 중개 응용 외에도 재조합은 바이러스 유전자 또는 단백질 도메인의 표적 결실, 변형 또는 대체를 허용하여 기초 연구를 지원합니다. 재조합에는 몇 가지 한계가 있습니다: 짧은 상동성 팔은 반복 영역에서 재조합을 방해합니다. PCR 증폭 기질은 때때로 돌연변이를 도입할 수 있습니다. 그리고 표적 영역의 순서를 알아야 합니다.

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프로토콜

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재조합의 전제 조건으로, 관심 있는 BAC-게놈을 가진 능숙한 박테리아 균주(예: SW102)를 사용할 수 있어야 합니다. 재조합은 원하는 변형을 거친 콜로니를 농축하는 매우 효율적인 방법이지만, 여기서는 첫 번째 단계와 두 번째 단계라고 하는 2단계 재조합 전략을 설명합니다(그림 1). 첫 번째 단계에서, 양성 및 음성 선택 마커를 모두 포함하는 발현 카세트가 관심 유전자좌에 삽입됩니다. 두 번째 단계에서, 이 카세트는 최종 게놈을 위한 실제 유전자 변형으로 대체된다. 이 연구에 사용된 선택 마커에는 암피실린 내성(AmpR), 베타-갈락토시다제 활성(β-gal) 및 sacB 유전자가 포함됩니다. 그러나 연구 그룹의 특정 요구에 따라 양성 및 음성 선택 마커의 조합을 사용할 수 있습니다.

1. 대상 영역에 선택 카세트를 삽입합니다.

  1. 0일
    1. LB 한천 + 항생제(내성 유전자가 BAC에 있음(예: 클로람페니콜 12.5 μg/mL)에 원하는 BAC를 포함하는 줄무늬 SW102 세포. 32°C의 인큐베이터에서 밤새 키웁니다.
      참고: 이 단계에서 재조합 유전자의 유도를 방지하기 위해 32°C> 온도를 피하십시오.
  2. 1일
    1. PCR을 수행하여 AmpR/LacZ/SacB 선택 카세트를 증폭합니다. 3' 말단에 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 선택 카세트를 어닐링 및 증폭하고 5' 말단에 30-80bp를 포함하는 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 변형할 바이러스 게놈 영역에 대한 상동성 암을 나타냅니다(표 1).
      참고: 선택 카세트와 인서트는 전문 공급업체로부터 합성 구조로 쉽게 주문할 수 있습니다. 그러나 원치 않는 재조합 사건을 방지하기 위해 BAC(BAC 유전자 제어) 또는 바이러스 게놈에 중복된 프로모터, 종결자 또는 기타 유전적 요소가 존재하지 않도록 주의해야 합니다.
    2. 아가로스 겔 전기영동(AmpR/LacZ/SacB 카세트가 3,400bp이므로 1% 아가로스 겔 실행)을 통해 PCR 단편의 동일성 및 순도를 확인하고 260/230 및 260/280 값이 순수 핵산과 일치하는지 확인합니다.
    3. 오후에는 단일 SW102 콜로니를 LB 5mL에 접종하고 32°C에서 하룻밤 배양합니다.
  3. 2일
    1. 하룻밤 배양액 1-2mL를 신선한 LB 100mL에 접종합니다. 박테리아를 0.55-0.7의 OD600 으로 성장시키고 OD600 을 정기적으로 측정하여 지수 단계를 놓치지 않습니다.
    2. 유도를 위해 수조를 42°C로 준비하고 세척을 위해 멸균 ddH 2 O의 멸균 ddH2O를 4°C ~250mL로 냉각합니다.
    3. 배양액이 원하는 OD에 도달하면 50mL를 깨끗한 원추형 튜브로 옮기고 수조에서 42°C에서 15분 동안 배양합니다. 유도되지 않은 음성 대조군을 포함합니다.
      참고: 이 단계는 람다 적색 단백질을 유도합니다.
    4. 튜브를 얼음에 10분 동안 그대로 둔 다음 4° C에서 3,200×g에서 5분 동안 원심분리합니다(42°C 유도 및 비유도 모두).
    5. 상청액을 버리고 얼음처럼 차갑고 멸균된 ddH2O 40mL를 첨가한 다음 펠릿을 재현탁합니다(42°C 유도 및 비유도 모두).
    6. 다시 8분 동안 원심분리하고(단계 1.3.4 참조) 세척 단계(단계 1.3.5)와 원심분리를 반복합니다. 상층액이 물처럼 맑아질 때까지(탁도 및 현탁액 없음) 세척 단계를 반복합니다(2-4회 세척).
    7. 마지막 원심분리 후, 상청액을 버리고 펠릿을 200μL의 얼음처럼 차갑고 멸균된 ddH2O(42°C 유도 및 비유도 모두)에 재현탁합니다.
    8. 재현탁된 펠릿(HSV-1 50μL 및 아데노 25μL)의 분취량을 예냉된 1.5mL 튜브(42°C 유도 및 비유도 모두)에 옮깁니다. 정제된 PCR 산물 50-400ng를 추가합니다(5μL를 초과하지 마십시오). 튜브를 소용돌이치고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
    9. 이전 단계의 혼합물을 예냉된 큐벳으로 옮기고 2.50kV(2,500V, 0.2cm 큐벳)(42°C 유도 및 비유도 큐벳 모두)에서 전기천공합니다.
    10. 전기천공 후, 박테리아가 32°C에서 1.5시간 동안 1mL의 LB에서 회수되도록 합니다. 큐벳에 LB 1mL를 추가하여 세척하고 모든 것을 수집합니다.
    11. LB 한천 + 암피실린(100μg/mL), X-Gal(20μg/mL) 및 IPTG(0.5mM)에 다양한 양의 박테리아(10, 50, 200μL)를 퍼뜨리고 32°C에서 하룻밤(ON)에서 성장시킵니다.
    12. AMP/X-Gal(단계 1.3.11과 동일한 농도)으로 플레이트를 준비하고 자당5로 플레이트를 준비합니다.
  4. 3일
    참고: 이 시점에서 콜로니가 성장하고 파란색으로 나타날 것으로 예상되지만, 박테리아가 42°C에서 유도되고 선택 카세트가 포함된 인서트로 전기천공된 플레이트에서만 도금되었습니다. 이것이 확립되면 일부 콜로니에서 선택 카세트의 무결성을 확인해야 합니다.
    1. 두 개 이상의 콜로니를 피하기 위해 콜로니가 <50인 ON에서 플레이트를 식별합니다. 여러 콜로니(일반적으로 8-10개면 적어도 하나의 적합한 콜로니를 식별하기에 충분함)를 선택하고 약 50μL의 H2O로 희석합니다. 50μL의 H2O에 단일 파란색 콜로니를 접종하고 음성(LB 한천/자당/클로람페니콜) 및 양성(LB 한천/암피실린/클로람페니콜/X-Gal/IPTG) 선택적 플레이트(1.1.2 및 1.3.11단계와 동일한 농도)에 줄무늬를 만듭니다(그림 2).
      참고: 50μL가 퍼진 플레이트에서 20-100개의 콜로니를 찾을 것으로 예상됩니다. 그러나 콜로니의 수가 적다고 해서 반드시 재조합이 손상되는 것은 아닙니다.
    2. 1.4.1단계의 물을 LB 5mL에 접종하고 플레이트와 LB 배양액을 32°C에서 밤새 배양합니다(그림 2).
  5. 4일
    1. Amp/X-Gal 플레이트에서 성장하고 자당 플레이트에서 성장하지 않은 파란색 콜로니만 선택합니다(그림 3). 이러한 양성 클론(표 2)의 경우, 하룻밤 배양의 500μL 분취량을 50mL의 신선한 LB로 옮깁니다.
  6. 5일
    1. 각 양성 클론에 대해 글리세롤 찌르기를 준비하고 BAC 플라스미드(midiprep)를 추출 및 분리합니다.
    2. BAC 추출 후 품질 관리를 수행하여 재조합이 올바르게 발생했는지 확인합니다. 삽입 부위의 Sanger 시퀀싱을 수행합니다. 모든 것이 올바르면 두 번째 섹션을 진행하십시오.

2. 선택 카세트를 원하는 수정 사항으로 교체합니다.

  1. 0일
    1. LB 한천에 양성 클론을 줄무늬로 줄지어 놓습니다. 32°C에서 밤새 배양합니다.
  2. 1일
    1. PCR을 수행하여 삽입/변형을 증폭합니다. 3' 말단에 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 선택 카세트를 어닐링 및 증폭하고 5' 말단에 1.3.1단계에서 사용된 것과 동일한 30-80bp 상동성 암을 사용합니다(표 1).
    2. 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 단편의 동일성과 순도를 확인하고 260/230 및 260/280 값이 순수 핵산과 일치하는지 확인합니다.
    3. 단일 콜로니를 5mL의 LB에 접종하고 32°C에서 밤새 배양합니다.
  3. 2일
    1. 하룻밤 배양액 2mL를 LB 100mL로 옮기고 OD600 이 0.55-0.7에 도달할 때까지 32°C에서 성장시킵니다(~2.5-3시간 내). 유도를 위해 수조를 42°C로 준비하고 세척을 위해 멸균 ddH 2 O의 멸균 ddH2O를 4°C ~250mL로 냉각합니다.
    2. 원하는 OD에 도달하면 배양액 50mL를 원추형 튜브로 옮기고 42°C 수조에서 15분 동안 배양하여 λ-파지 재조합 단백질을 유도합니다. 유도되지 않은 대조군으로 32°C에서 또 다른 50mL 튜브를 보관합니다.
    3. 열 유도 후 튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다.
    4. 4°C에서 3,200 × g 에서 8분 동안 원심분리합니다(42°C 유도 및 비유도 모두).
      참고: 이 시점부터 SW102 세포 역량을 유지하기 위해 얼음 위에서 작업하십시오.
    5. 상청액을 제거하고 펠릿을 40mL의 미리 냉각된 물로 부드럽게 소용돌이치면서 재현탁합니다.
    6. 0-4°C에서 3,200 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    7. 세척 단계(2.3.5단계)를 한 번 반복합니다.
    8. 상청액을 제거하고 펠릿을 물 100μL에 부드럽게 재현탁합니다.
    9. 재현탁된 펠릿(HSV-1 50μL 및 아데노 25μL)의 분취량을 예냉된 1.5mL 튜브(42°C 유도 및 비유도 튜브 모두)로 옮깁니다. 정제된 PCR 산물 50-400ng를 추가합니다(5μL를 초과하지 마십시오). 튜브를 소용돌이치고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
    10. 이전 단계의 혼합물을 예냉된 큐벳으로 옮기고 2.50kV(42°C 유도 및 비유도 모두)에서 전기천공합니다.
    11. 세포가 5mL의 LB 배지에서 32°C에서 4-5시간 동안 회수되도록 합니다.
      참고: 카세트 교체 후 잔류 SacB 단백질의 분해를 허용하기 위해 회복 시간은 첫 번째 재조합 단계보다 깁니다.
    12. 자당, X-Gal 및 IPTG(1.1.2단계 및 1.3.11단계와 동일한 농도)를 포함하는 LB 한천 페트리 접시에 다양한 양(50, 200, 500μL)의 배양물을 플레이트합니다. 32°C에서 밤새 배양합니다.
  4. 3일
    1. 상당한 수의 콜로니(20-100)를 스크리닝하여 원하는 변형을 운반하는 단편 및 선택 카세트와 성공적으로 재조합된 양성 클론을 식별할 가능성을 높입니다. 콜로니 PCR을 사용하여 1단계 스크리닝을 수행합니다. 그리드가 있는 페트리 접시를 사용하십시오. 주어진 사분면에서 콜로니를 선택하고 레이블을 지정합니다(그림 4).
      참고: 특히 효과적인 접근법은 한 쌍의 프라이머를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 프라이머는 표적 영역(바이러스 게놈) 외부에서, 다른 프라이머는 재결합된 단편 내에서 어닐링됩니다(그림 5).
    2. 아가로스 겔(1.5%)에 의한 PCR 앰플리콘의 존재와 크기를 확인합니다.
    3. 올바른 사분면에서 양성 클론을 선택하고 100mL의 LB에 접종합니다. 32°C에서 밤새 배양합니다.
  5. 4일차:
    1. 박테리아 배양에서 플라스미드를 추출하기 위해 midiprep을 수행합니다.
    2. 제한 효소로 플라스미드를 소화하고 아가로스 겔을 실행하여 소화 패턴을 분석합니다.
    3. 소화 패턴이 정확하면 바이러스 게놈의 변형된 영역에 대한 시퀀싱을 진행합니다.
    4. 재조합 클론의 분자 동일성을 확인한 후 바이러스 입자의 형질감염 및 구조를 진행합니다.

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결과

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IL12 코딩 종양 용해성 헤르페스 바이러스의 생성
이 연구의 소개 섹션에서 설명한 바와 같이, 재조합의 잠재적인 응용 분야 중 하나는 면역 치료 잠재력을 향상시키는 것을 목표로 종양 용해성 바이러스의 게놈에 면역 자극 이식 유전자를 삽입하는 것입니다. 아래에서는 HSV-1에 기초한 종양용해 벡터를 이용한 이러한 응용의 예를 제시한다. 구체적으로, 이 연구는 HSV-1 게놈의 Us1-Us2 영역 내의 유전자간 유전자좌에 이식된 유전자의 영향을 조사합니다. 실제로, 바이러스 게놈 내 삽입은 바이러스 기능에 해로운 것으로 판명될 수 있으며, 잠재적으로 생체 내 항종양 효능과 제조 수율을 모두 손상시킬 수 있는 복제 결함으로 이어질 수 있습니다. 이러한 문제로 인해 궁극적으로 생산 공정이 임상 개발 요구 사항과 양립할 수 없게 될 수 있습니다. 본 연구에서는 구성적 진핵생물 프로모터(강화된 CMV)와 짧은 5' 비번역 영역(UTR), 쥐 IL-12의 코딩 서열 및 폴리아데닐화 신호(BGH)를 포함하...

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토론

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이 "RECOMBINEERING"(상동 RECOMBInation 매개 유전 공학) 프로토콜은 2단계 전략을 사용합니다: 첫째, 선택 카세트를 관심 유전자좌에 통합하고, 둘째, 이 카세트를 원하는 변형으로 교체합니다(그림 1).

사용되는 선택 마커에는 암피실린 내성(AmpR), 베타-갈락토시다아제(β-gal) 및 sacB가 포함됩니다. AmpR은 항생제 내성 기반 선택을 가능하게 하고, β-gal은 청색/백색 스크리닝을 가능하게 하며, sacB는 반대 선택을 위한 자당 민감도를 부여합니다. 카세트를 통합하는 콜로니는 유도 플레이트에서 파란색으로 나타납니다. 유도되지 않은 대조군의 성장은 품질이 좋지 않은 재료를 시사합니다. 계속하기 전에 모든 마커의 기능을 확인해야 합니다.

두 번째 단계에서 sacB 발현은 자당 플레이...

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공개 사항

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저자는 공개할 관련 재정적 또는 비금전적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 PRIN 2022-MUR Italy, Grant 20224NCSN5(PreMeRetHOn)의 지원을 받았습니다. POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 RNA 기술 기반 국립 유전자 치료 및 약물 센터. PNRR PE13 One Health 신종 전염병에 대한 미충족 수요를 해결하기 위한 기본 및 중개 연구 활동. 저자는 맞춤형 DNA를 제공한 Geneart 합성 서비스에 감사를 표합니다. 저자들은 또한 이 연구를 성공적으로 완료하는 데 기여한 Michele Veneruso에게 진심으로 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
암피실린어떤어떤분자 등급
올리고가 증폭하는 경우 Il-12: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		어떤어떤HPLC 정제
올리고에서 Amplofy AmpR/LacZ/SacB 로; 카세트: CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTGTTTTTTTTTC		어떤어떤HPLC 정제
IPTG어떤어떤분자 등급
LB 한천
LB 미디엄
Phusion 핫 스타트 II 고충실도 DNA 중합효소 써모 사이언티픽F549S
Il12를 증폭하는 올리고: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		어떤어떤HPLC 정제
Rev oligo에서 amplofy AmpR/LacZ/SacB 로; 카세트: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		어떤어떤HPLC 정제
SacB/AmpR/LacZ 선택 카세트이 원고--
자당어떤어떤분자 등급
SW102(BAC-HSV-1 또는 BAC-Adv 포함)이 원고--
트립톤어떤어떤분자 등급
마법사 SV 젤프로메가A9281
엑스걸어떤어떤분자 등급
효모 추출물어떤어떤분자 등급

참고문헌

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