MALDI 접근법 을 통한 박테리아 단백질체학 프로파일링을 이용한 낙농장의 미생물 안전성 평가

요약

이 프로토콜은 배양체학과 MALDI-TOF MS를 결합하여 유제품의 미생물 구성을 신속하고 비용 효율적으로 평가할 수 있습니다. 기존 배양 방법보다 짧은 처리 시간으로 16S rRNA 시퀀싱에 필적하는 분류 결과를 제공합니다.

초록

우리는 단백질체학 접근법, 현대 컬추로믹스 및 식품 안전 품질 관리 실험실에 통합될 수 있는 다양한 샘플 준비 절차를 사용하여 다양한 유제품(버터, 모짜렐라 치즈, 우유, 크림)에서 미생물의 존재를 모니터링하기 위한 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS, 이하 "MS"라고 함) 식별 방법을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 미생물 안전성을 모니터링하기 위한 신뢰할 수 있고 강력한 도구입니다. 여기에는 미생물 분리 단계, 성장한 콜로니 선택, 샘플 준비 절차(온전한 세포, 현장 및 튜브 내 추출), MS 분석 매개변수 설정, MS 스펙트럼(단백질 지문) 생성 및 수집, 마지막으로 MS 플랫폼을 사용하여 분류 수집, 데이터 해석 및 시각화가 포함됩니다. 수많은 연구를 통해 검증된 이 방법은 상업용 생화학적 테스트 시스템에 비해 우유에서 미생물을 보다 안정적이고 비용 효율적으로 식별할 수 있습니다. 이는 간단한 프로토콜과 분석 시간을 크게 단축하여 실험실의 다양한 요구 사항을 충족하는 식품 미생물학 분야의 유망한 발전으로 두각을 나타내고 있습니다. 제시된 프로토콜은 제조 공정에 적합한 적절한 처리 시간(TAT)에 신뢰할 수 있는 미생물 식별을 제공함으로써 식품 산업의 요구 사항을 해결합니다.

서론

이 프로토콜의 전반적인 목표는 박테리아 단백질체 프로파일링을 위해 MS를 사용하여 버터, 치즈, 우유 및 크림을 포함한 다양한 유제품의 미생물 안전성을 모니터링하기 위한 포괄적인 방법론을 제공하는 것입니다. 현대 문화체학과 최적화된 시료 준비 절차를 결합한 이 접근 방식은 식품 안전 및 품질 관리 실험실을 위한 빠르고 안정적이며 강력한 도구가 되기 위한 것입니다. 이 방법론을 만들고 적용하는 근거는 표준 미생물 식별 방법의 한계에서 비롯됩니다. 수년 동안 수의학 및 식품 진단 실험실은 차등 배양 배지에서 박테리아 성장과 대사를 검사한 후 다양한 효소 분석1을 수행하는 기존의 생화학적 테스트에 의존해^{왔습니다.} Bergey의 결정적 세균학 매뉴얼과 같은 표준 지침을 기반으로 하는 이러한 방법은 상대적으로 저렴하고 정량적 및 정성적 데이터를 모두 생성할 수 있지만 힘들고 시간이 많이 소요되며 광범위한 배지 준비, 샘플 희석, 도금, 배양, 콜로니 계수, 분리 및 상세한 특성화 단계 ^2,3이 필요합니다.

API(Analytical Profile Index), BBL Crystal, Vitek 및 Biolog MicroPlates와 같은 상용 반자동 및 자동화 시스템의 도입으로 생화학적 분석을 사용한 미생물 식별이 간소화되어 비용과 처리 시간이 단축되었습니다. 그러나 이러한 시스템에는 재현성이 낮고, 해당 데이터베이스에 항목이 부족하며, 특히 비발효성 박테리아 또는 미미한 생화학적 차이가 있는 종 내의 균주의 경우 균주 간의 표현형 변이를 결정하는 데 어려움이 있어 잘못된 시험관 내 결과를 초래할 수 있는 몇 가지 단점이 있습니다⁴. 이를 감안할 때 MS는 현재 임상 미생물학에서 흔히 볼 수 있고 수의학 진단 및 우유 품질 실험실에서 주목을 받고 있는 강력한 대안으로 발전했습니다. 이 접근 방식은 여러 미생물을 검출하는 속도, 정확성 및 비용 효율성으로 보완되었습니다¹. 수많은 연구에서 MS가 우유에서 미생물을 더 안정적으로 식별하여 상업용 생화학 테스트 시스템보다 빠르고 저렴한 결과를 제공한다는 것이 입증되었습니다 ^5,6,7. 속 수준 또는 그룹 수준 식별에는 생화학적 검사로 충분할 수 있지만 종 수준 진단에는 MS 또는 16S rRNA 시퀀싱과 같은 고급 방법이 필요한 경우가 많습니다⁸. 실제로 MS는 식품 미생물 분리주의 유연하고 신뢰할 수 있는 식별을 위한 유망한 플랫폼으로 간주되며, 간단한 프로토콜을 통해 식품 미생물학 실험실의 다양한 요구 사항을 충족하고 분석 시간을 크게 단축하여 식품 안전을 향상시킵니다 ^4,5. 시약 소비량이 적기 때문에 운영 비용이 최소화되며, 시료 처리를 통해 자동화가 향상되고 처리량이 높아집니다⁸. 그러나 이 방법의 유용성은 본질적으로 선택된 미생물 성장 조건(배양 배지 유형 포함)과 참조 데이터베이스 종 범위에 따라 달라지며, 이는 유용성을 제한하는 핵심 요소로 인식됩니다.

MS는 식품 매개 병원성, 유산균(LAB) 및 기타 발효 박테리아를 식별하고 구별함으로써 식품 미생물학에서 중요한 역할을 합니다⁹. 그 유용성은 현대 배양체학으로 확장되어 배양 배지에서 성장한 모든 미생물 콜로니를 식별하고 콜로니 형성 단위(CFU) 정보의 획득을 용이하게 합니다⁷. 이 접근법은 이미 인간의 장에 나타나거나, 당뇨병성 족부 감염에 관여하거나, 요로와 연결된 것과 같은 복잡한 미생물 군집을 발견하는 데 성공적으로 적용되어 미생물학적 관행에서 배양 의존적 방법을 활성화했습니다^10,11.

이 프로토콜은 실험실이 유제품의 미생물 안전성에 대한 일상적인 평가를 위해 MS를 효과적으로 구현하도록 안내하고 제조 공정에 적합한 실제 처리 시간(TAT) 내에서 신뢰할 수 있는 미생물 식별에 대한 업계의 요구를 해결하기 위해 제시되었습니다. 프로토콜은 (1) 적절한 배양 배지(de Man, Rogosa 및 Sharpe 한천 - MRS 한천, M-17 한천, 다목적 트윈 80 한천 - APT 한천, 중국 블루 유당 한천 - CBL 한천, 우유 플레이트 수 한천 - MPCA, 트립산 대두 한천 - TSA) 및 맞춤형 배양 조건; (2) 다양한 박테리아 유형 및 실험실 워크플로를 수용하기 위해 직접 콜로니 전달, 표적 포름산 추출 및 튜브 내 에탄올/포름산 단백질 추출과 같은 옵션을 제공하는 MS 분석을 위한 표준화된 샘플 준비 절차; (3) 기기 교정, 최적의 스펙트럼 획득 매개변수 정의, 신뢰할 수 있는 분류학적 할당을 위한 점수 평가 및 일관성 검사를 포함한 데이터 해석 지침을 포함한 체계적인 MS 분석. 구조화되고 검증된 접근 방식을 제공함으로써 이 프로토콜은 낙농 산업에서 미생물 모니터링의 정확성과 효율성을 향상시켜 궁극적으로 식품 품질과 공중 보건 개선에 기여하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 유제품 관련 박테리아의 분리

1. 액체 또는 고체 유제품에서 박테리아 배양 획득
   1. 배양 배지 선택
      1. 유제품 샘플에서 박테리아를 분리하려면 일반 성장 배지, 그람 음성 박테리아, 유산균(LAB), 포자 형성 박테리아, 성장 속도가 느리거나 까다로운 미생물을 포함한 예상되는 미생물 그룹에 따라 배양 배지를 선택합니다.
         참고: 우세종과 희귀종 모두의 회수를 극대화하려면 여러 배지를 병렬로 접종해야 합니다. 유제품 샘플의 마이크로바이옴 분석을 위한 일련의 예제 배지는 표 1에 나와 있습니다.
   2. 접종 및 도금
      1. 유제품의 대표적인 샘플을 채취하여 잘 섞습니다.
      2. 샘플 1mL(액체 샘플: 우유, 크림, 버터밀크) 또는 1g(고체 샘플: 치즈, 버터)을 멸균 액체 배지 9mL(펩톤 물/0.85% NaCl 용액)가 들어 있는 15mL 원추형 원심분리기 튜브로 무균 이송합니다. 고체 샘플의 경우 샘플을 추가하기 전에 액체 배지를 40-42°C로 예열하십시오.
      3. 30-60초 동안 격렬하게 소용돌이를 일으켜 샘플을 균질화합니다. 지방이 많거나 단단한 샘플의 경우 균일한 현탁액이 얻을 때까지 균질화를 계속합니다.
      4. 현탁액 1mL를 취하여 멸균 용액 9mL가 들어 있는 연속 튜브로 옮겨 일련의 10배 희석액을 준비합니다. 각 희석액을 잘 섞습니다.
         참고: 샘플 유형 및 예상되는 미생물 오염 수준에 따라 ^10-1 에서 ^10-6 범위의 희석액을 준비합니다. 대부분의 샘플의 경우 최대 ^10-3 의 희석으로 충분합니다. 그러나 신선한 우유나 블루 치즈를 분석할 때는 추가 희석액을 준비해야 합니다. 정확한 분리와 콜로니 선택의 용이성을 보장하기 위해 최적의 접종 희석액은 플레이트당 30-300개의 콜로니를 제공해야 합니다. 이 범위는 개별 콜로니의 명확한 구별을 허용하고 중복 성장의 위험을 최소화하여 나중에 분석할 수 있도록 오염되지 않고 균질한 박테리아 배양을 쉽게 얻을 수 있습니다. 일부 가공 유제품(예: 버터밀크)의 경우 희석되지 않은 신선한 샘플(예: 0.1mL)을 직접 도금하는 데 사용할 수 있습니다.
      5. 0.1mL의 샘플 또는 그 희석액을 취하여 적절한 한천 배지가 포함된 이전에 준비된 페트리 접시의 표면으로 옮깁니다.
      6. 멸균 스프레더를 사용하여 한천 표면에 접종물을 고르게 펴 바릅니다. 접종물이 배지에 15분 동안 흡수되도록 한 다음 플레이트를 뒤집습니다.
   3. 잠복
      1. 호기성 배양: 조사된 모든 샘플에 대해 APT, M-17, CBL, MPCA 및 TSA 한천 플레이트를 접종하고 37°C 및 30°C의 호기성 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 온도는 유제품의 위생 품질(일반 중온균의 경우 30°C)과 공중 보건 안전(인간 관련 병원체 및 지표 유기체의 경우 37°C)을 모두 평가하는 데 중요한 다양한 미생물 그룹의 최적 성장 요구 사항을 기반으로 결정되었습니다.
         참고: 포자 형성 박테리아의 집중적인 성장이 예상되는 경우, TSA의 경우 더 짧은(~12시간) 배양 시간이 바람직합니다.
      2. 혐기성 배양: 조사된 모든 샘플에 대해 MRS 한천 플레이트를 접종하고 37°C 및 30°C의 혐기성 조건에서 24-72시간 동안 배양하여 매일 미생물 성장을 확인합니다. 배양 온도는 3.1단계에서 언급한 대로 결정되었습니다.
         참고: 혐기성 배양 조건은 산소를 제거하고 혐기성 박테리아의 성장에 적합한 분위기를 제공하는 혐기성 대기 생성 향 주머니가 있는 밀폐 용기에 플레이트를 넣어 달성할 수 있습니다.
   4. 순수한 배양 얻기
      1. 배양 후, 플레이트를 검사하고 형태학적 특성(예: 크기, 모양, 색상, 질감)에 따라 성장한 단일 콜로니를 선택합니다.
      2. 1 μL 미생물 루프와 동일한 배양 조건을 사용하여 동일한 한천 배지에 계대배양(줄무늬)하여 선택된 콜로니를 정제합니다.

배양 배지	신청	배양 조건
트립스 대두 한천(TSA)	광범위한 박테리아 배양을 위한 일반 배지	30–37 °C, 24–48시간, 호기성
혈액 한천(BLA, 양피 5% 함유)	풍부하고 용혈의 분화, 연쇄상 구균, 리스테리아균, 바실러스에 유용합니다.	30–37 °C, 24–48시간, 호기성
MRS 한천(de Man, Rogosa 및 Sharpe 한천)	락토바실러스 및 기타 LAB에 대한 선택적 L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus 또는 L. acidophilus의 성장을 지원하기 위해 1% Tween-80을 첨가하십시오.	30 °C, 48–72 시간, 혐기성 또는 미호기성
M17 한천	락토코커스, 스트렙토코커스 써모필러스에 대한 선택적	30 °C, 48–72 시간, 혐기성 또는 미호기성
APT 한천 (다목적 트윈 80 한천)	LAB 및 일부 비피더스박테리아에 대한 선택적	30 °C, 48–72 시간, 혐기성 또는 미호기성
Scheadler 한천	비피도박테리움, 클로스트리디움을 포함한 혐기성 균의 선택적 및 농축, 분리	30–37 °C, 48–72 시간, 혐기성
CBL 한천 (중국 블루 유당 한천)	대장균군 및 기타 유당 발효 박테리아용 차등 배지	37 °C, 24–48 시간, 호기성
우유 플레이트 카운트 한천(MPCA)	호기성 중온성 박테리아의 총 수에 대한 보편적	30–37 °C, 24–48시간, 호기성

표 1: 지정된 배양 조건에서 유제품 샘플의 마이크로바이옴 분석을 위해 제안된 배지 목록.

2. MS 분석을 위한 박테리아 시료 준비

1. 시작하기 전에 MALDI 매트릭스 용액을 준비하십시오.
   참고: 가장 일반적으로 사용되는 매트릭스 화합물은 HCCA, α-시아노-4-하이드록시신남산입니다. 이 화합물은 감광성이므로 매트릭스를 준비하여 어두운 용기에 보관하거나 빛을 피하십시오.
   1. 50% 아세토니트릴(HPLC 등급), 47.5% 물(HPLC 등급) 및 2.5% 트리플루오로아세트산(TFA) 비율을 사용하여 용매 혼합물을 준비합니다.
   2. 용매 혼합물에 매트릭스를 약 10mg/mL의 최종 농도로 용해시킵니다(또는 포화될 때까지 - 용해되지 않은 결정이 계속 보일 때까지).
   3. 용액이 투명하지 않으면(결정이 남아 있는 경우) 용액을 원심분리하거나 여과(예: 0.22μm 주사기 필터를 통해)하여 투명한 액체를 얻습니다.
      알림: 제상 주기가 적은 경우 냉장고에 단기간 보관할 수 있습니다.
2. MS를 사용하여 박테리아를 식별하려면 3가지 시료 전처리 절차 중 하나를 사용하십시오.
   1. 직접 콜로니 이식 - 대부분의 그람 음성 박테리아와 같이 잘 자라는 비용해 저항성 박테리아를 다룰 때 이 가장 간단하고 빠른 방법을 사용하십시오.
      1. 멸균 루프 또는 이쑤시개를 사용하여 소량(~1μL)의 성장한 콜로니를 MALDI 플레이트의 한 지점으로 옮깁니다.
      2. 박테리아 물질을 MALDI 타겟 플레이트의 지정된 지점에 직접 바르면 얇고 균일한 층이 형성됩니다.
      3. 건조되면 1μL의 HCCA 매트릭스 용액으로 스팟을 오버레이하고 실온에서 자연 건조시킵니다.
   2. On Target Formic Acid Extraction - 세포벽으로 인해 추가 처리 없이는 단백질을 방출하기 어려운 식별하기 어려운 박테리아(예: 그람 양성, 효모)에 사용합니다.
      1. 일회용 미생물 루프 또는 멸균 이쑤시개를 사용하여 단일 박테리아 콜로니에서 소량의 박테리아 바이오매스를 채취합니다.
      2. 박테리아 물질을 MALDI 타겟 플레이트의 지정된 지점에 직접 바르면 얇고 균일한 층이 형성됩니다.
      3. 번진 박테리아 물질에 1μL의 70% 포름산 용액을 겹쳐 놓고 실온에서 자연 건조시킵니다.
      4. 건조되면 1μL의 HCCA 매트릭스 용액으로 스팟을 오버레이하고 실온에서 자연 건조시킵니다.
   3. 튜브 내 단백질 추출(에탄올/포름산 방법) - 일부 그람 양성균, 효모 및 마이코박테리아를 포함하여 식별하기 어려운 미생물에 이 방법을 사용합니다.
      1. 멸균 루프 또는 면봉을 사용하여 한천 배양 플레이트에서 300μL의 멸균수가 들어 있는 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 1-3개의 완전한 콜로니를 옮깁니다.
      2. 900μL의 무수 에탄올을 첨가하여 최종 에탄올 농도를 약 75%로 조정합니다. 몇 초 동안 혼합하거나 소용돌이치십시오.
      3. 샘플을 15,000 x g (실온)에서 2분 동안 원심분리합니다.
      4. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 버립니다.
         참고: 점액 균주의 경우 4°C에서 추가 원심분리를 권장합니다.
      5. 모든 잔류 에탄올이 증발할 때까지 펠릿 튜브를 열어 둡니다(5-10분, 실온).
      6. 건조된 세포 펠릿에 20-50μL 70% 포름산(FA)을 첨가합니다. 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 피펫팅 또는 소용돌이로 혼합합니다.
         알림: 부피는 생물학적 물질의 양에 비례해야 합니다.
      7. 포름산 현탁액에 같은 부피의 아세토니트릴(ACN)을 첨가합니다. 조심스럽게 섞는다.
      8. 15,000 x g 에서 2분(실온) 동안 원심분리합니다.
      9. 상청액 1μL를 MALDI 표적 플레이트의 지정된 지점에 옮깁니다.
      10. 스팟을 실온에서 완전히 자연 건조시키십시오.
      11. 건조된 샘플 스폿에 1μL의 α-시아노-4-하이드록시신남산(HCCA) 매트릭스 용액을 오버레이합니다.
      12. MS 분석 전에 매트릭스를 실온에서 완전히 자연 건조시킵니다(그림 1).
          참고: 70% 포름산: 부식성; 화상을 입습니다. 연기 후드에 넣어 취급하십시오. 아세토니트릴: 가연성 및 독성. 화기에 가까이 두지 말고 흡입/접촉을 피하십시오. 트리플루오로아세트산(TFA): 강하고 부식성이 있으며 휘발성입니다. 피부/눈 접촉 및 흡입을 피하십시오. 항상 실험실 가운, 내화학성 장갑, 보안경을 착용하십시오. 흡입을 방지하기 위해 모든 시약을 연기만에서 취급하십시오. 피부와 눈의 접촉을 피하십시오. 화염에서 멀리 떨어져 작업하십시오. 적절한 폐기를 위해 산성 및 유기 용매 폐기물을 명확하게 라벨이 붙은 호환 용기에 수거하십시오.

그림 1: MS 기술을 통해 박테리아 분리주 식별을 위한 적절한 시료 전처리 절차를 선택하는 프로세스를 시각화하는 의사 결정 트리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. MS 기술을 이용한 스펙트럼 획득 및 미생물 식별

1. 교정
   참고: MS에서 정확한 질량 측정을 위해 미지의 샘플을 분석하기 전에 적절한 표준을 사용하여 기기를 교정하십시오. 신뢰할 수 있는 식별을 위해서는 적절한 기기 교정이 중요합니다.
   1. 1 μL를 포함하는 MALDI 표적 플레이트에 교정기 스팟을 준비합니다: (a) 3.6-17 kDa의 질량 범위를 포괄하는 대 장균 DH5 알파 추출물을 포함하는 박테리아 테스트 표준(BTS); (b) 대 장균 ATCC 25922 단백질 추출물, 리보뉴클레아제 및 미오글로빈을 함유한 미생물학 교정기로, 3.6-17kDa의 질량 범위(EXS2600 시스템용). 시료 전처리와 유사하게 건조된 교정기 스팟을 1μL의 HCCA 매트릭스 용액으로 자연 건조시킵니다.
   2. 준비된 샘플과 교정 스팟이 포함된 MALDI 타겟 플레이트를 기기에 로드합니다. 보정 모드(자동)를 사용하여 보정 지점에 대한 분석을 실행합니다.
   3. 보정을 확인하여 질량 정확도가 지정된 질량 범위(100-20kDa)에 걸쳐 허용 가능한 한계 내에 있는지 확인합니다.
2. 스펙트럼 획득
   참고: 기기가 보정되면 준비된 각 샘플 스팟에서 질량 스펙트럼이 수집됩니다.
   1. 일반 획득 매개변수
      1. 선형 양이온 모드에서 질량 분석기를 작동하십시오.
      2. 질량 검출 범위를 2,000-20,000 m/z(2-20 kDa)로 설정합니다.
   2. 다음 기기별 설정을 사용하십시오.
      1. 이온 소스 전압: 20kV에서 이온 소스 1(IS1), 18kV에서 이온 소스 2(IS2), 9kV에서 렌즈 전압. 가속 전압은 최대 25kV가 될 수 있습니다.
      2. 감지기 전압: 약 2.65kV로 설정합니다.
      3. 펄스 이온 추출 설정: 100ns, 지연 추출 시간은 230ns로 고정됩니다.
      4. 레이저 출력 설정: 일반적으로 최소 요구 전력의 40%-65% 범위의 최상의 스펙트럼 품질(신호 수 및 신호 강도 고려)을 얻기 위해 수동으로 조정합니다.
      5. 스펙트럼당 샷 수: 각 스팟의 서로 다른 영역에서 충분한 수의 레이저 샷을 획득하여 신호 대 잡음비(S/N)가 양호한 합계 스펙트럼을 생성합니다→ (a) 각 스팟의 4개 다른 영역에서 50샷 단계로 촬영한 평균 200샷 또는 (b) AutoXecute 모드를 사용하여 대상 스팟의 10개 다른 위치에서 50샷 50샷 획득.
   3. 샘플 측정 전략
      1. 분리물당 여러 지점을 측정합니다(분리물당 최소 2개 지점).
      2. 각 지점에 대해 반복 스펙트럼을 획득하여 결과의 일관성과 정확성을 보장→ 중복으로 측정하여 샘플당 특정 수의 총 스펙트럼(샘플당 최소 → 스펙트럼)을 목표로 합니다.
         참고: 생물학적 복제를 얻기 위해 생물학적 샘플(최소 3개)을 대상으로 합니다.

4. 미생물 식별 및 데이터 분석

참고: 유기체 식별은 얻은 단백질 프로파일(미생물의 특정 단백질 "지문")을 참조 데이터베이스와 비교하여 발생하며, 신호 위치와 강도의 결과 상관 관계는 연구 대상 유기체가 해당 참조 미생물과 일치하는 신뢰 수준을 설명하는 일치 값을 생성하는 데 사용됩니다. 처리된 스펙트럼을 참조 데이터베이스와 비교하여 미생물을 식별합니다.

1. 스펙트럼 처리
   1. 스펙트럼 처리에 적합한 소프트웨어를 사용하십시오: (a) MALDI Biotyper 시스템의 경우 flexAnalysis 또는 (b) EXS2600 시스템의 경우 EX-Accuspec.
   2. Savitzky-Golay 방법을 평활화 알고리즘으로 적용합니다(너비 2m/z, 10주기).
   3. TopHat 알고리즘(S/N 임계값 = 2, TopHat 필터 너비 0.2 Da)을 사용하여 배경 노이즈를 제거하기 위해 기준선 보정을 수행합니다.
   4. 중심 모드를 피크 감지 알고리즘으로 사용합니다(S/N 임계값 = 2).
2. 데이터베이스 비교 및 점수 해석
   1. 알려지지 않은 분리주의 처리된 질량 스펙트럼을 미생물 식별의 MALDI 플랫폼에 업로드합니다. 그런 다음 식별을 실행합니다.
      참고: 이 연구에는 Biotyper 버전 4.1.100, Ex-Accuspec 버전 V1 소프트웨어가 사용되었습니다. MALDI Biotyper 소프트웨어의 경우 최상의 매칭 신뢰성을 보장하기 위해 원시 스펙트럼에서 메인 스펙트럼(MSP) 생성을 권장합니다.
   2. 제조업체 표준 임계값에 따라 식별 결과를 평가합니다.
      참고: MALDI Biotyper 및 EXS2600의 경우 점수 값은 다음과 같습니다.
      2.300-3.000: 가능성이 높은 종 식별;
      2.000-2.299: 안전한 속 식별, 가능한 종 식별;
      1.700-1.999: 가능한 속 식별;
      0.000-1.699: 신뢰할 수 있는 식별이 아닙니다.
      MALDI Biotyper 플랫폼에서 파생된 식별 결과를 평가하는 동안 일관성 범주를 사용하여 결과를 지원합니다: A- 종 일관성 → 가장 잘 일치하고 유사하게 높은 점수 값(>1.999)을 가진 다른 모든 일치는 동일한 종을 가리킵니다. B - 속 일관된 → 가장 일치하는 것과 유사한 점수 값(1.700 - 1.999)을 가진 다른 일치는 동일한 속을 가리키지만 종 수준에서 다를 수 있습니다. C- 일관성 없음 → 종 또는 속 수준의 일관성에 대한 요구 사항이 충족되지 않았습니다.

결과

문화학적 접근
배양학적 접근법은 무엇보다도 희귀하거나 재배하기 어렵거나 이전에 설명되지 않은 종을 분리할 가능성을 높이기 위해 미생물 배양 조건을 최대한 다양화하는 것을 목표로 하는 전략입니다¹². 이를 통해 다양한 샘플(예: 식품 샘플)에 존재하는 미생물총의 생물 다양성에 대한 훨씬 더 넓은 그림을 얻을 수 있습니다. 미생물의 다양성 증가는 형태, 색상, 크기 및 성장 속도가 다른 콜로니의 시각적 평가 단계에서 이미 관찰할 수 있으며, 이는 적용된 배양학적 접근법의 효과를 반영합니다(그림 2).

토론

유제품의 미생물 식별 전용 프로토콜은 속도, 신뢰성 및 비용 효율성에 대한 최적의 합의를 보장함으로써 기존 방법에 비해 중요한 발전을 제공합니다. 그럼에도 불구하고 프로토콜 내의 몇 가지 중요한 단계에는 세심한 주의가 필요합니다. 첫째, 격리 및 배양 단계가 기본입니다. 배양 배지 및 배양 조건은 예상되는 미생물 다양성 및 부하와 일치해야 합니다. 순수 배양을 얻는 것이 가장 중요하며, 이 단계에서 콜로니의 불충분한 분리 또는 오염으로 인해 모호하거나 잘못된 식별이 발생할 수 있으므로 MS 식별을 혼란스럽게 하는 혼합 프로파일을 피하기 위해 종종 계대 배양이 필요합니다⁴.

둘째, MS 분석을 위한 시료 전처리는 스펙트럼 품질을 결정하는 중요한 요소입니다. 이 프로토콜은 직접 콜로니 전달, 표적 추출 및 튜브 내 단백질 추출의 세 가지 표준 방법을 간략하게 설명합니다. 직접 이식...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
70% 개미산	체임푸르	115676307
아세토니트릴	머크 KGaA	1.00014.1011
APT 한천	머크 KGaA	1.10453.0500
박테리아 검사 표준	브루커 달토닉 GmbH	8255343
CBL 아가르(차이나 블루 락토스 아가)	머크 KGaA	1.02348.0500
콜롬비아 블러드 아가르	옥소이드	CM0331B
M17 한천
밀크 플레이트 백작 백수 농가 (MPCA)	옥소이드	CM0681
MRS 한천 (드 만, 로고사, 샤프 아가르)	머크 KGaA	1.10660.0500
MSP 96은 연마 강 BC를 목표로 합니다	브루커 달토닉 GmbH	8280800
펩톤 워터	시그마-올드리치	70179
스헤드러 한천	시그마-올드리치	91019
양 피	바이오맥시마	SL0160-100
트리플루오로아세트산	시그마-올드리치	T6508
트립틱 대두 아가르(TSA)	시그마-올드리치	22091
물	머크 KGaA	1.15333.2500
&알파;-시아노-4-하이드록시신나믹산	브루커 달토닉 GmbH	8201344