여기에서 우리는 커피 찌꺼기, 사용한 홉, 가문비나무 및 담배꽁초에서 발생하는 폐기물 유래 바이오 숯이 토양 건강에 미치는 영향을 평가하고 미생물 활동, 식물 성장 및 잠재적인 무척추 동물 생태 독성을 평가합니다.
이 논문에서
요약
초록
바이오 숯은 바이오매스를 고온에서 열분해하여 가열하여 얻은 제품으로, 수분 보유, pH 및 영양분 가용성과 같은 토양 특성을 개선할 수 있는 잠재력을 기반으로 일반적인 토양 개량제로 부상했습니다. 그러나 특정 폐기물로 제조된 바이오 숯은 토양 생물군에 부정적인 생태독성학적 영향을 미칠 수 있습니다. 이 연구의 전반적인 목적은 미생물 활동, 식물 성장 및 잠재적인 생태 독성에 초점을 맞춰 커피 찌꺼기, 사용한 홉, 가문비나무 및 담배꽁초에서 추출한 선택된 바이오 숯이 토양 건강에 미치는 영향을 평가하는 것이었습니다. 바이오 숯 개량된 토양을 총 15일 동안 배양하고 탈수소효소 활성, 박테리아 정량화, Sinapis alba 종자를 이용한 식물독성 생물분석, Enchytraeus albidus를 이용한 생태독성 시험 등 일련의 분석을 수행하였다. 바이오 숯 개량제는 토양 pH를 변화시키고 수분 보유에 영향을 미칠 수 있습니다. 담배꽁초 바이오 숯은 대조군 복제 전반에 걸쳐 8.47 × 104 CFU/mL에 비해 수가 최대 1.00 × 106 CFU/mL에 도달하여 박테리아 콜로니의 가장 높은 자극을 보였고, 커피 찌꺼기 바이오 숯은 탈수소효소 활성(3.53 × 10-3 mU/g)을 향상시켜 더 높은 미생물 대사 능력을 의미합니다. 식물독성 시험에 따르면 홉(162.96%)과 가문비나무 바이오숯(206.66%)에 의해 식물 성장이 향상되는 반면, 담배꽁초 바이오숯의 적용률이 높을수록 묘목 성장이 억제되었습니다(62.36% 억제). Enchytraeus albidus를 사용한 생태독성 시험에서는 담배꽁초 바이오숯(33% 자극)을 제외한 모든 바이오숯이 해로운 영향을 미친 것으로 나타났습니다. 이 연구 결과는 토양 건강에 대한 바이오 숯의 영향이 토양 관리에 중요한 영향을 미치는 출처에 따라 다르다는 점을 강조합니다. 이 연구는 토양 시스템에 대한 잠재적 위험을 최소화하면서 이점을 극대화하기 위해 농도와 유형에 따라 바이오 숯 적용 조정이 필요하다는 것을 보여줍니다.
서론
최근 몇 년 동안 바이오 숯은 농업에 적용되는 다기능적이고 친환경적인 토양 개량제로 부상하고 있으며1, 지구 온난화 완화 수단으로 부상하고 있습니다.2. 세계가 토지 황폐화, 작물 생산성 감소, 탄소 배출 증가로 어려움을 겪으면서 바이오 숯은 기존 비료3 및 탄 소 격리 접근 방식4에 대한 친환경 대안으로 부상했습니다. 합성 비료와 달리 바이오 숯은 본질적으로 토양 비옥도를 증가시키고5, 영양분 손실을 줄이고6, 수분 보유력을 증가시키며7 토양이 황폐화되거나 비옥도가 낮은 지역에서 매우 유용합니다. 또한 바이오 숯은 유기물 분해 및 영양분 순환에 중요한 유익한 토양 미생물에게 안정적인 서식지와 탄소원을 제공하여 미생물 기능을 향상시킵니다8.
농업 외에도 바이오 숯은 농업 잔류물, 산림 잔류물, 음식물 쓰레기와 같은 바이오매스 잔류물을 장기적인 탄소 물질로 전환하므로 폐기물 처리를 위한 친환경 솔루션 역할도 합니다9. 이는 폐기물 축적을 제한할 뿐만 아니라 이산화탄소(CO2) 또는 메탄(CH4)으로 빠져나가는 탄소 포집을 통해 온실 가스를 상쇄합니다. 탄소 격리를 위한 다른 메커니즘과 비교할 때 바이오 숯은 대기 중 CO2를 완화하고 건강한 토양과 높은 수확량을 지원하는 장기적이고 통합된 토양 전략을 제공합니다10.
토양 비옥도 향상, 수분 보유 능력 및 미생물 자극 특성과 같은 인식된 이점에도 불구하고 토양 생물군에 대한 잠재적인 생태독성학적 영향에 대한 우려가 계속되고 있습니다11. 바이오 숯은 일반적으로 미생물 활동과 다양성에 긍정적이지만, 특정 공급 원료 또는 가공 조건은 토양 미생물과 생태학적 기능에 해를 끼치는 독성 화합물을 생성할 수 있습니다12.
바이오 숯의 잠재적 위험을 평가하려면 생태독성학적 평가가 필요합니다. 박테리아(분해자), 식물(생산자), 무척추동물(소비자)은 토양 및 퇴적물 생태독성 연구에 사용되는 분류학적 그룹 중 하나입니다. 이 분류군은 육상 및 수생 환경을 모두 나타냅니다13.
토양 생태계 기능에서 지렁이와 Enchytraeids의 보완적인 기능은 이러한 유기체에 대한 생물학적 분석 개발의 기초입니다. 생물 분석에서 Enchytraeids는 살충제(예: 디메토에이트, 아트라진, 카벤다짐) 및 미량 금속(예: 납, 아연, 구리, 카드뮴)과 같은 화학 물질의 영향을 조사하기 위한 육상 생물학적 모델 역할을 합니다14.
유기체 기반 분석 외에도 미생물 효소 활성은 토양 건강을 평가하는 또 다른 방법입니다. 토양 탈수소효소 활성은 미생물 산화 활성의 지표입니다15. 토양-바이오 숯 혼합물의 탈수소효소 테스트는 미생물 활동과 전반적인 토양 건강을 정량화하는 데 효과적입니다. 탈수소효소 효소는 미생물 호흡에 관여하기 때문에 그 활성은 토양이 얼마나 생물학적으로 활성인지를 반영합니다. 이는 토양의 질, 비옥도 및 바이오 숯이 미생물에 미치는 영향을 평가하는 데 유용합니다. 이 분석은 분광 광도법으로 결정되는 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)의 트리페닐 포르마잔(TPF)으로의 환원을 측정합니다. TPF 생산량이 높을수록 미생물 활동이 더 높다는 지표입니다.
우리는 다양한 공급 원료에서 생산된 바이오 숯이 토양 건강에 독특한 영향을 미칠 것으로 예상합니다. 이러한 영향은 토양의 물리화학적 매개변수를 변경하여 미생물 활동, 식물 성장 및 토양 유기체 독성에 영향을 미칠 수 있는 화학적, 물리적 특성에 따라 달라집니다.
이 연구에서 우리는 폐기물 유래 바이오 숯이 pH, 미생물 활동, 식물 성장 및 무척추 동물 생존을 포함한 여러 토양 건강 지표에 미치는 영향을 평가합니다(그림 1). 4가지 폐기물 유래 바이오 숯의 세 가지 농도(1%, 5%, 10% w/w)를 정원 토양과 혼합하고 위에서 언급한 효과를 평가했습니다. 수분 함량, pH 및 테스트 유기체의 선택은 연구의 생태학적 관련성을 보장하기 위해 신중하게 제어되었습니다.
프로토콜
1. 바이오 숯 준비
참고: 여기에서 테스트 재료로 사용되는 바이오 숯에 대한 자세한 내용은 재료 표 를 참조하십시오. 열분해 조건, 원소 조성 및 근접 분석 데이터는 생산자가 제공했습니다(표 1).
주의 : 항상 적절한 배기 또는 흄 시스템으로 환기가 잘 되는 실험실에서 열분해를 수행하십시오. 내열 장갑, 실험실 가운, 보안경을 착용하고 필요한 경우 안면 보호대를 착용하십시오.
표 1: 테스트된 바이오 숯의 기본 특성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
2. 바이오 숯의 화학적 특성 분석
- 마이크로파 보조 분해 후 농도를 기준으로 모든 바이오 숯의 원소 조성을 분석합니다(유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법(ICP OES) 또는 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP MS)을 사용하여 수행됨(표 2).
3. 토양-바이오 숯 혼합물의 준비
- 토양 수집 및 실험 설정
- 실험 필드에서 표토를 수집하십시오.
- 표면 이물질을 수동으로 제거하십시오. 토양을 입자 크기가 5mm 미만으로 체로 쳐서 잔해물을 제거합니다.
- 체로 쳐진 토양 100g의 무게를 달아 테스트 용기에 넣습니다.
- Biochar 수정 및 배양
- 토양 100g당 각 바이오 숯 유형 1g, 5g 또는 10g을 첨가하여 1%, 5% 및 10%(w/w 기준) 토양-바이오 숯 개량제를 만듭니다.
- 증류수를 추가하여 최대 수분 보유 용량(WHC)의 60%에 도달합니다.
- 주걱을 사용하여 잘 섞습니다.
- 각 용기의 무게를 측정하고 파라필름으로 덮어 증발을 최소화합니다.
- 혼합물을 27°C에서 10일 동안 배양합니다.
참고: 이 혼합물은 수분 손실 측정, pH 변화, 식물 독성 및 박테리아 정량 분석에 사용됩니다.
사용한 토양은 현지 바이오고체 프로토콜에 따라 수집 및 폐기해야 합니다.
4. 토양-바이오 숯 혼합물의 pH 측정
- 각 토양-바이오 숯 혼합물 10g을 50mL 원뿔형 튜브에 담습니다.
- 튜브에 증류수 25mL를 추가합니다.
- 튜브를 수동으로 30초 동안 흔들거나 중간 속도로 와류 혼합기를 사용합니다. Whatman No. 1 여과지를 사용하여 혼합물을 깨끗한 100mL 비커에 걸러냅니다.
- 보정된 pH 측정기를 사용하여 실온(20-25°C)에서 여과액의 pH를 측정합니다.
5. Enchytraeus albidus 독성 시험
- 경제협력개발기구(OECD) 2016, 테스트 번호 22016에 따라 테스트를 수행합니다.
- 시험을 위한 토양 준비
- 이 테스트에는 OECD 인공 토양을 사용하십시오.
- 섹션 4에 언급된 단계에 따라 토양 pH를 측정합니다.
- 분석 등급의 탄산칼슘(CaCO3)을 토양에 점차적으로 첨가하여 pH 6.0 ± 0.5로 조정하고 완전히 혼합합니다.
- 증류수 또는 탈이온수를 추가하여 수분 함량을 최대 WHC의 40-60%로 조정합니다.
알림: 손으로 일관성을 확인하십시오. 토양은 촉촉해야 하지만 덩어리가 없어야 합니다.
- 웜 순응 및 선택
- 증류수로 벌레를 부드럽게 헹구어 운송 식염수를 제거합니다.
- 벌레를 준비된 OECD 토양에 놓고 6,000lux에서 16시간 빛/8시간 암순 주기 하에서 20°C에서 24시간 동안 순응시킵니다.
- clitellum의 존재에 따라 실체 현미경을 사용하여 설정당 15마리의 건강한 성충을 선택합니다.
- 테스트 설정 및 인큐베이션
- 깨끗한 용기에 준비된 OECD 토양 100g과 각 바이오 숯 유형 5g을 혼합합니다.
- 개량되지 않은 OECD 토양 100g을 사용하여 대조군을 준비합니다.
- pH 및 수분 함량이 필요한 범위(pH - 6.0 ± 0.5, 수분 함량 - 최대 WHC의 40-60%)에 있는지 확인합니다.
- 끝이 부드러운 집게를 사용하여 각 테스트 및 제어 용기에 15마리의 성충을 도입합니다.
- 잘게 갈아서 압연한 귀리 25mg을 토양 표면에 식량 공급원으로 첨가하십시오.
- 공기 교환이 가능하도록 천공된 알루미늄 호일로 용기를 덮습니다.
- 용기를 6,000lux에서 16시간 빛/8시간 암순 주기 하에서 5일 동안 20°C에서 배양합니다.
- 매일 용기의 무게를 측정하고 일정한 수분 함량을 유지하기 위해 적절한 양의 증류수 또는 탈이온수를 첨가하여 체중 감소를 보충하십시오.
- 웜 활동을 모니터링하고 테스트 중에 눈에 보이는 사망률을 기록합니다.
- 테스트가 끝난 후 다음 공식을 사용하여 치명적인 효과(%)를 계산합니다.
어디:
Wi - 테스트 시작 시 초기 웜 수
Wf - 테스트 종료 시 최종 웜 수
참고: 테스트가 유효하려면 대조군 설정의 성인 사망률이 테스트 종료 시 20%를 초과해서는 안 됩니다. - 테스트 후 테스트 토양을 105°C에서 건조시켜 비활성화하고 현지 바이오 고체 프로토콜에 따라 폐기합니다.
6. 식물독성 시험
- 국제표준화기구(ISO) 18763:201617에 따라 시험을 실시합니다.
- 페트리 접시 설정
- 배양된 토양-바이오 숯 혼합물 20g을 9cm 깨끗한 페트리 접시에 넣습니다. 깨끗한 주걱을 사용하여 표면을 부드럽게 평평하게 만듭니다.
- 각 바이오 숯 농도에 대해 3개의 반복실험을 준비하고 수정되지 않은 2개의 대조군을 포함합니다.
- 종자 심기 및 부화
- 각 접시에 10개의 Sinapis alba 씨앗을 토양 표면의 균일한 간격으로 놓습니다.
알림: 씨앗을 토양에 밀어 넣지 마십시오. 수분과 함께 자연스럽게 굳도록 하십시오. - 접시를 뚜껑으로 덮고 직사광선 없이 25°C ± 2°C의 인큐베이터에 5일 동안 넣습니다.
- 배양 후 플라스틱 자를 사용하여 종자 가장자리에서 뿌리 끝까지의 뿌리 길이를 측정합니다. cm 또는 mm로 보고하십시오. 씨앗이 방금 금이 간 경우 0.1cm 또는 1mm로 표시하십시오.
- 다음 공식을 사용하여 억제 효과(%)를 계산합니다.
어디:
RLc - 대조군 접시에서 종자의 평균 뿌리 길이
RLt - 테스트 접시에 있는 종자의 평균 뿌리 길이
참고: 테스트가 유효하려면 대조군의 종자 발아가 80% 이상(8개의 종자 중 10개가 발아됨)인지 확인하는 것이 중요합니다.
- 각 접시에 10개의 Sinapis alba 씨앗을 토양 표면의 균일한 간격으로 놓습니다.
7. 박테리아 콜로니 정량
- 토양 현탁액 및 희석
- 배양된 각 토양-바이오 숯 혼합물 5g을 50mL 멸균 원추형 튜브에 무게를 잰다.
- 멸균 증류수 25mL를 넣고 30초 동안 완전히 흔듭니다.
- 현탁액을 실온에서 2시간 동안 균질화하도록 합니다.
- 멸균 거즈 또는 메쉬를 사용하여 현탁액을 여과하고 이 원액을 사용하여 연속 희석액을 준비합니다.
- 각각 9mL의 멸균 증류수가 들어 있는 5개의 시험관을 준비합니다.
- 멸균 피펫을 사용하여 10배 연속 희석을 수행합니다(예: 스톡 용액에서 1mL를 첫 번째 튜브 = 10-1로 옮긴 다음 1mL를 다음 튜브 = 10-2로 옮기는 등)
- 도금에는 10-2 희석액을 사용하십시오.
- 식민지의 도금 및 계수
- 멸균 영양 한천 플레이트에 0.2mL의 10-2 희석액을 피펫팅합니다.
- 멸균된 스프레더를 사용하여 샘플을 고르게 펴 바릅니다.
- 플레이트를 27°C에서 거꾸로 된 위치에서 24시간 동안 배양합니다.
- 콜로니 카운터를 사용하여 콜로니를 계산합니다.
- 다음 공식을 사용하여 혼합물의 콜로니 형성 단위(CFU) mL-1 을 계산합니다.
알림: 가능한 경우 생물 안전 캐비닛 아래에서 작업하십시오. 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 도구를 화염 멸균합니다.
폐기하기 전에 모든 플레이트를 70% 에탄올 또는 오토클레이브로 소독하십시오.
8. 건조 물질(DM) 측정
알림: 뜨거운 그릇을 다룰 때는 내열 장갑을 사용하십시오.
- 내열 유리 또는 도자기 그릇에 흙 10g의 무게를 잰다.
- 그릇을 105°C로 예열된 건조 오븐에 넣고 2시간 동안 건조시킵니다.
- 건조 후 보울을 건조기에 옮기고 공기의 수분 흡수를 방지하기 위해 10분 동안 식힙니다.
- 분석 저울을 사용하여 냉각된 그릇의 무게를 다시 측정합니다.
- 정확성을 보장하기 위해 최소 3개의 샘플에 대해 절차를 반복합니다.
- 다음 공식을 사용하여 건조 물질(DM) 함량을 계산합니다.
어디:
DM - 건조 물질 함량(%)
Md - 건조 시료 중량(g)
Mw - 건조되지 않은(원본) 샘플 중량(g)
9. 탈수소효소 활성(DHA) 검사
- 표준 프로토콜(ISO 23753-1:2019)18에 따라 테스트를 수행합니다.
- 시약 준비
- TRIS 완충 용액(100mmol/L, pH 7.6).
- 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 12.12g을 증류수 800mL에 녹입니다.
- 1M 염산(HCl)을 사용하여 pH를 7.6으로 조정합니다.
- 증류수로 총 부피를 1L로 조절합니다.
- 4°C에서 보관하고 1주일 이내에 사용하십시오.
- TTC 기판 용액(300mmol/L)
- 제조된 Tris 완충액 10mL에 TTC 1g을 용해시킵니다.
- 4°C의 어두운 곳에 보관하고 1주일 이내에 사용하십시오.
- 검량선을 위한 TPF 표준 용액을 준비합니다.
- 100mg의 TPF를 10mL의 96% 에탄올에 넣고 완전히 용해될 때까지 저어주어 TPF 원액(33mmol/L)을 얻습니다.
- 준비된 TPF 원액 0.5mL를 에탄올 50mL로 희석하여 TPF 작업 용액(330nmol/mL)을 얻습니다.
- 작업 용액에서 0, 0.1, 0.2, 0.5 및 1.0mL의 작업 표준물질을 준비하고 에탄올로 희석하여 일정한 최종 부피 3mL로 만듭니다.
- 485nm에서 흡광도를 측정하여 검량선을 생성합니다.
- TRIS 완충 용액(100mmol/L, pH 7.6).
- 시료 준비
- 각 토양-바이오 숯 혼합물 5g을 50mL 원추형 튜브에 첨가합니다.
- 4mL의 Tris 완충액(100mmol/L, pH 7.6)과 1mL의 TTC 용액을 테스트 설정에 추가합니다.
- 대조군 설정에 4mL의 Tris 완충액만 추가합니다.
- 부드러운 반전으로 튜브를 수동으로 혼합하고 어두운 곳에서 25°C에서 6시간 동안 배양합니다.
- 포르마잔의 추출
- 배양 후 각 튜브에 25mL의 에탄올을 첨가합니다.
- 샘플을 어둠 속에서 1시간(250분-1, 25°C) 동안 궤도 교반 하에 놓습니다.
- 교반 후 TTC 1mL를 대조군 튜브에 첨가합니다.
- 모든 튜브를 2,000 × g 에서 25°C에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 분리합니다.
- 측정 및 계산
- 상청액을 깨끗한 큐벳으로 옮깁니다.
- 분광 광도계를 사용하여 485nm에서 흡광도를 읽습니다.
- 검량선을 사용하여 샘플에서 TPF의 농도(nmol/L)를 결정합니다.
- 다음 공식을 사용하여 탈수소효소 활성을 계산합니다.
어디:
A - 건조한 토양의 mU g-1 (또는 nmol min-1 g-1)의 효소 활성
Cs - nmol mL-1의 테스트 샘플에서 TPF 농도
Cb - 대조군 샘플의 TPF 농도(nmol mL-1)
V - 총 반응 부피(기질, 완충 용액 및 에탄올 부피의 합, mL)
RT - 반응 지속 시간(분)
M - 튜브당 토양 질량(g)
DM - 토양의 건조 물질 함량(%)
알림: TTC 및 TPF는 잠재적인 돌연변이 유발 물질이므로 장갑을 끼고 다루십시오. 에탄올 기반 시약을 준비할 때 흄 후드를 사용하십시오.
테스트 후 에탄올 및 TTC 함유 폐기물은 지정된 화학 폐기물 용기에 폐기하십시오.
그림 1: 실험 워크플로의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
결과
화학적 특성화
바이오 숯은 원소 조성에서 상당한 차이를 보였습니다(표 2). 칼슘(Ca)과 칼륨(K)은 담배꽁초와 사용한 홉 바이오 숯에서 가장 높았습니다. 가문비나무 바이오 숯은 알루미늄(Al)과 철(Fe)이 가장 많았습니다. 구리(Cu)와 마그네슘(Mg)은 사용한 홉 바이오 숯에 강하게 풍부했습니다. 납(Pb), 카드뮴(Cd) 및 기타 미량 금속은 모든 샘플에서 소량으로 존재했습니다.
표 2: 바이오 숯의 화학 성분. 연구에 사용된 다양한 바이오 숯의 주요 원소 함량. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
잠복기 동안의 pH 변화
모든 처리에서 토양-바이오 숯 혼합물의 pH는 시간이 지남에 따라 약간 증가하는 경향이 있었습니다(그림 2). 담배꽁초 바이오 숯과의 혼합물에 대해 10% w/w로 가장 높은 pH 값이 기록되어 15일째에 9.48에 도달했습니다. 이 치료는 시간이 지남에 따라 가장 큰 증가를 보였습니다. 커피 찌꺼기 바이오 숯도 점진적인 증가를 일으켜 15일째 10% w/w에서 최대 pH가 8.94입니다. 홉 바이오 숯은 pH를 16.57% 증가시켰으며, 10% w/w에서 최대 9.20까지 증가했습니다. 대조적으로, 가문비나무-목재 바이오 숯 혼합물은 10% w/w에서 8.56의 pH에 도달했습니다. 대조군은 시간이 지남에 따라 최소한의 변화로 6.57에서 7.66 범위의 가장 낮은 pH를 보여주었습니다.
그림 2: 토양-바이오 숯 혼합물의 시간 경과에 따른 pH 변화. 토양 pH는 각 바이오 숯 개량제에 대해 0일, 10일 및 15일에 1%, 5% 및 10% w/w로 측정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수분 보유 및 체중 감소
모든 바이오 숯 유형에 걸친 수분 보유 능력은 바이오 숯이 없는 대조군 토양보다 낮았습니다(그림 3). 대조군은 15일 동안 체중의 3.67%를 감량하여 수분 보유력이 가장 높았음을 나타냅니다. 바이오 숯 중에서 담배꽁초 처리는 배양 기간 동안 5.89% 감소하여 수분 손실이 가장 적었고 따라서 바이오 숯 중 가장 큰 보유력을 보였습니다. 홉 바이오 숯에서도 유사하지만 더 온건한 패턴이 관찰되었습니다(총 중량 감소 9.22%, 농도가 높을수록 손실이 더 큽니다). 커피 찌꺼기 바이오 숯은 가장 큰 체중 감소(최대 16.56%)를 보여 수분 보유력이 가장 낮음을 나타냅니다. 가문비나무-목재 혼합물은 평균 10.22%를 잃었습니다.
그림 3: 배양 중 토양-바이오 숯 혼합물의 중량 감소. 모든 바이오 숯 및 농도에 대해 15일 동안의 수분 보유 지표로서의 체중 변화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
E. 알비두스 독성 및 번식 시험
5% w/w 바이오 숯에서 E. albidus 의 번식은 현저한 공급 원료 의존성을 보여주었습니다. OECD 토양 통제에서 인구는 15명에서 24명으로 증가했습니다(60% 증가, 그림 4). 가문비나무 바이오 숯은 단 7명의 생존자만 낳았습니다(53% 억제, 그림 5). 홉과 커피 찌꺼기 바이오 숯은 각각 12명의 생존자를 낳았습니다(20% 억제, 그림 5). 담배꽁초 바이오 숯은 번식을 33% 촉진했으며 자손을 포함하여 총 20마리의 벌레가 발생했습니다.
그림 4: 바이오 숯 처리 토양에서 E. albidus 의 순 개체군 변화. 초기 및 최종 웜 수는 5일 후에 계산됩니다. 각 바이오 숯의 5% w/w 농도를 테스트했습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: E. albidus에 대한 독성 또는 자극 효과.대조군과 비교하여 벌레에 대한 순 효과. 양수 값은 억제를 나타냅니다. 음수 값은 자극을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
식물독성
S. alba의 뿌리 신장은 1%, 5% 및 10% w/w에서 10일 배양 후 측정되었습니다(그림 6). 수정되지 않은 토양에서 평균 뿌리 길이는 237mm였습니다. 1% w/w의 커피 찌꺼기 바이오 숯은 79.16%의 자극을 생성했습니다. 더 높은 농도는 5% w/w에서 최대 47.08%의 억제를 일으켰습니다. 가문비나무 바이오 숯은 모든 농도에서 성장을 촉진하여 10% w/w에서 206.66%로 정점을 찍었습니다. 담배꽁초 바이오 숯은 1% w/w에서 41.01%의 자극을 얻었지만 5% 및 10% w/w에서 성장을 억제하여 10% w/w에서 62.36% 억제에 도달했습니다. 홉 바이오 숯은 모든 속도에서 성장을 자극했습니다(각각 1%, 5% 및 10% w/w에서 38.97%, 31.75% 및 162.96%).
그림 6: Sinapis alba에 대한 식물 독성 효과.모든 바이오 숯 처리에서 10일 성장 후 대조군에 비해 뿌리 성장 억제 또는 자극. 양수 값은 억제를 나타냅니다. 음수 값은 자극을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
박테리아 콜로니 정량
박테리아 콜로니 수는 10일 후에 평가되었습니다(그림 7). 대조군은 평균 8.47 × 104 CFU/mL였습니다. 커피 바이오 숯은 1% w/w에서 7.33 × 104 CFU/mL를 산출했으며 5% 및 10% w/w에서 각각 1.18 × 105 및 1.50 × 105 CFU/mL로 증가했습니다. 가문비나무 바이오 숯은 1% w/w에서 1.97 × 105 CFU/mL를 제공했으며, 5% 및 10% w/w에서 9.73 × 104 및 4.93 × 104 CFU/mL로 감소했습니다. 담배꽁초 바이오 숯은 1% w/w에서 5.40 × 104 CFU/mL를 생성하고 10% w/w(1.00 × 106 CFU/mL)에서 가장 높은 자극을 생성했습니다. 홉 바이오 숯은 모든 농도에서 약간의 자극을 보였으며 5% w/w에서 1.07 × 105 CFU/mL로 정점을 찍었습니다.
그림 7: 바이오 숯으로 처리된 토양의 박테리아 성장. 모든 처리 및 농도에 대해 배양 10일 후 박테리아 CFU/mL. 비교를 위해 컨트롤이 포함되어 있습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
탈수소효소 활성
커피 찌꺼기 바이오 숯은 농도 전반에 걸쳐 가장 높은 탈수소효소 활성을 생성하여 1% w/w(3.53 × 10-3 mU/g)에서 정점을 찍고 5% 및 10% w/w(2.38 × 10-3 및 2.62 × 10-3 mU/g)에서 비슷한 상태를 유지했습니다( 그림 8 참조). 홉 바이오 숯은 1% w/w(2.39 × 10-3 mU/g)에서 활성을 향상시켰지만 5%(6.34 × 10-4 mU/g)에서 감소하고 10% w/w(-8.30 × 10-4 mU/g)에서 음수가 되었습니다. 담배꽁초 바이오 숯은 1% w/w(1.29 × 10-3 mU/g)에서 양성이었고 5% 및 10% w/w에서 -7.26 × 10-4 및 -8.53 × 10-4 mU/g로 감소했습니다. 가문비나무 바이오 숯은 모든 농도에서 음성이었습니다(1% 및 5% w/w에서 10-4 × -5.53 및 -5.19 × 10-4 mU/g, 10% w/w에서 -3.11 × 10-4 mU/g), 대조군보다 낮았습니다.
그림 8: 바이오 숯으로 개량된 토양의 탈수소효소 활성. 모든 바이오 숯 유형 및 농도에 대한 미생물 효소 활성. 값은 바이오 숯을 첨가하지 않은 대조 토양에 상대적입니다. 양수 값은 대조군에 비해 효소 활성이 높음을 나타내고, 음수 값은 대조군보다 효소 활성이 낮음을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
결과 요약은 표 3 및 표 4 를 참조하십시오.
표 3: 토양 pH 및 수분 보유에 대한 바이오 숯의 영향. 초기 및 최종 pH 값, ΔpH 및 배양 중 수분 손실 %를 보여줍니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 생물학적 효과 및 DHA 결과 요약. 모든 치료에 대한 벌레 번식, 식물 독성, 미생물 수 및 효소 활성에 대한 결합 데이터. 
자극을 나타내고 
억제를 나타냅니다. DHA 결과의 경우 양성 값은 대조군에 비해 더 높은 효소 활성을 나타내고 음수 값은 대조군보다 낮은 효소 활성을 나타냅니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
데이터 가용성:
데이터는 공개 저장소에 업로드됩니다: DOI/URL: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30128803.v1
토론
토양과 사용한 커피 찌꺼기 바이오 숯의 혼합물은 이전에 보고된 pH 9.4와 일치하는 pH 8.94로 높은 알칼리도를 보였습니다19. 바이오 숯은 또한 대조군 샘플에 비해 중량 손실이 가장 많이 증가했는데, 이는 낮은 수분 보유 능력을 나타내며, 이는 낮은 표면적으로 인해 수분 흡착 경향을 제한할 가능성이 높습니다20,21. 이러한 물리적 특성은 E. albidus에 불리한 조건을 만들어 벌레의 생존과 번식을 20% 억제했습니다.
식물독성 시험에서 S. alba는 1% w/w 농도에서 79.16%의 자극을 보인 반면, 더 높은 농도(예: 5% w/w)에서는 바이오 숯이 뿌리 신장을 47.08% 억제했습니다. 이는 Lactuca sativa에 대한 커피 찌꺼기 바이오 숯의 식물 독성 효과가 카르복실산에 의해 발생했다는 보고서22와 일치합니다. 더욱이 연구에 따르면 수용성 페놀과 카르복실산도 옥신 수송을 방해하여 식물 독성 역치를 초래하는 것으로 나타났습니다23.
박테리아 콜로니 수는 커피 바이오 숯 농도(10% w/w 농도에서 1.50 × 10-5 CFU/mL)가 증가함에 따라 증가했으며, 이는 이 바이오 숯이 배양 가능한 박테리아에 유리한 조건을 제공했음을 나타냅니다. 커피 바이오 숯은 또한 가장 높은 DHA 활성(3.53 × 10-3 mU/g)을 보였는데, 이는 재배 가능한 미생물 개체군과 재배 불가능한 미생물 개체군 모두를 자극했음을 시사합니다. 이는 토양 효소 활성에 대한 커피 바이오 숯의 유익한 영향을 관찰한 연구24 에 의해 더욱 뒷받침되었습니다.
홉 바이오 숯은 토양 알칼리도를 증가시키고 적당한 평균 체중 감소(10%)를 일으켰습니다. 식물 독성 시험에서 바이오 숯은 특히 고농도(162.96% 자극)에서 뿌리 신장 자극에 유익했습니다. 미생물 활동과 관련하여 홉 바이오 숯은 박테리아 수(최대 1.00 × 10-5 CFU/mL)에 현저한 변화를 보이지 않았으며, 이는 화학 성분의 균형 때문일 수 있습니다. 홉 바이오 숯은 박테리아 효소 시스템을 억제하여 미생물에 독성이 있을 수 있는 구리(Cu)를 가장 많이 함유하고 있지만25, 묘목의 엽록소 합성을 개선하여 미생물 성장을 지원해야 하는 칼륨(K) 및 인(P)과 같은 원소도 더 높은 수준으로 함유되어 있습니다26. DHA 활성도 이러한 중립 효과를 반영하여 생물학적 영향이 제한적인 안정적인 반응을 나타냅니다.
담배꽁초의 바이오 숯은 시간이 지남에 따라 토양 알칼리도를 증가시켰습니다(최대 pH 9.48). 더 높은 열분해 온도(700°C)에서 생산되어 박테리아 성장을 지원하는 알칼리성 바이오 숯이 생성되었습니다. 이 관찰은 바이오 숯이 토양 pH를 개선하여 서식지 조건을 개선한다고 보고한 이전 연구27과 일치합니다. 모든 처리 중에서 담배꽁초의 바이오 숯은 가장 높은 수분 함량(최대 94%)을 유지했으며, 이는 E. albidus 의 생존 및 번식에 대한 자극 효과도 설명할 수 있습니다. 높은 수분 보유는 700°C에서 미세 구조 변화와 연결될 수 있으며, 수막을 가두는 미세 기공을 생성할 수 있습니다28. 자극 효과의 또 다른 원인은 담배꽁초의 바이오 숯에 칼슘(Ca), P, K의 함량이 높기 때문일 수 있으며, 이는 벌레의 생존과 번식에 유익한 요소입니다.
미생물 평가에서 담배꽁초의 바이오 숯은 동일한 수준의 증가를 나타내지 않은 DHA 활성과 달리 약 1.00 × 10-6 CFU/mL에 도달하는 더 높은 농도에서 가장 높은 박테리아 자극을 나타냈습니다. 이 발견은 전체 미생물 군집이 아닌 배양 가능한 박테리아의 선택적 자극을 시사합니다.
토양과 가문비나무 바이오 숯의 혼합물은 침엽수 유래 바이오 숯의 pH 7.87을 보고한 연구29에서도 pH를 약간 증가시켰습니다. 생산 온도는 이 연구에 사용된 모든 바이오 숯 중 가장 낮았습니다(600°C). 바이오 숯의 수분 보유 능력은 극심한 체중 감소를 나타내지 않았기 때문에 다른 바이오 숯 유형에 비해 적당했습니다.
그러나 Eisenia foetida 의 생존 및 번식의 경우 가문비나무 바이오 숯이 가장 높은 독성(53% 치사 효과)을 보였습니다. 가능한 원인 중 하나는 장내 pH 조절을 방해하고 산화 스트레스를 유발하기 때문에 지렁이에 독성이 있는 것으로 알려진 알루미늄(Al), 철(Fe) 및 망간(Mn)과 같은 원소의 수치 상승일 수 있습니다30. Eisenia foetida 가 농약의 과도한 사용으로 인한 토양의 중금속 독성으로 인해 바이오매스가 상당히 감소한 연구에서도 유사한 결과가 보고되었습니다31.
가문비나무 바이오 숯은 식물 독성 분석에서 가장 큰 뿌리 신장 자극을 일으켰습니다(최대 206% 자극). 이는 벌레에 대한 민감성과 달리 고농도의 금속이 S. alba와 같은 식물 종에 필수적인 미량 영양소 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 이 바이오 숯의 저농도는 박테리아 콜로니를 자극했습니다. 그러나 군집 수는 집중도가 높아짐에 따라 감소했습니다. 이 효과는 낮은 수준의 K 및 P와 높은 독성 원소 함량(Al, Fe, Mn)에 대한 박테리아 민감성을 나타냅니다. 이 관찰은 측정된 DHA 활성과 일치하며, 아마도 수소 대 탄소(H/C) 비율이 낮아 탄소를 사용할 수 없게 되었기 때문에 대조군 토양보다 낮았을 것입니다32. 이러한 발견은 가문비나무 바이오 숯이 영양소 함량이 낮거나 억제 화합물로 인해 미생물 성장을 지원하지 않는다는 것을 시사합니다.
바이오 숯은 외부 실험실에서 테스트 재료로 얻었으며 서로 다른 열분해 온도를 포함하여 각 공급자가 일상적으로 적용하는 조건에서 생산되었습니다. 우리의 목표는 공급 원료 전반에 걸쳐 온도의 영향을 분리하기보다는 공급된 대표적인 폐기물 유래 바이오 숯을 평가하는 것이었습니다. 따라서 이 연구에서 온도 효과는 공급 원료 효과에서 완전히 분리될 수 없습니다. 가열 속도, 가스 분위기 및 체류 시간과 같은 자세한 생산 매개변수는 공급업체로부터 제공되지 않았습니다. 제공된 온도와 원소 특성만 보고되었습니다( 표 1 및 표 2 참조).
이 연구 결과를 고려할 때 홉 바이오 숯은 중간 정도의 환경 부작용과 함께 전반적으로 균형 잡힌 효과를 보였다는 결론을 내릴 수 있습니다. 모든 농도에서 식물의 성장을 지원하고, 적당한 pH 변화와 수분 보유 능력을 보였으며, 또한 테스트된 다른 바이오 숯에 비해 토양 미생물 및 벌레에 급격한 영향을 미치지 않았습니다.
이러한 결과는 부정적인 부작용을 일으키지 않고 토양 질과 식물 성장의 실제 개선을 보장하기 위해 토양 개량에 적합한 농도와 함께 적절한 바이오 숯 유형을 선택하는 것이 얼마나 중요한지 보여줍니다.
열분해 온도 및 바이오 숯 적용 속도를 포함한 프로토콜의 여러 단계가 이 연구 결과에 눈에 띄는 영향을 미쳤습니다. 열분해 온도가 높을수록 바이오 숯의 알칼리도가 높아지고 담배꽁초의 바이오 숯에서 볼 수 있듯이 벌레 번식 및 박테리아 성장 자극에 영향을 미쳤습니다. 대조적으로, 열분해 온도가 낮을수록 알칼리성 바이오 숯이 적었고 가문비나무 바이오 숯의 경우와 같이 벌레 독성이 가장 높고 미생물 활성이 감소했습니다. 적용률의 효과는 바이오 숯 유형과 테스트된 유기체에 따라 달라졌습니다. 커피 찌꺼기 바이오 숯의 농도가 낮을수록 뿌리 신장과 높은 DHA 활성에 대한 자극 효과가 있었고, 담배꽁초의 바이오 숯의 농도가 높을수록 배양 가능한 박테리아 성장이 가장 높았습니다.
일관되지 않은 군집 수와 같은 일반적인 문제를 해결하기 위해 연구 방법에 특정 조정이 이루어졌습니다. 여기에는 토양 현탁액의 2시간 균질화를 허용하고 10-2 연속 희석을 사용하여 최적이고 비교 가능한 콜로니 수를 얻는 것이 포함됩니다. 또한 OECD 가이드라인인 테스트 번호 220은 Enchytraeid 벌레에 대한 테스트 화학 물질의 효과를 평가하기 위해 고안되었습니다. 이는 범위 측정 테스트에서 테스트된 다양한 화학 농도에서 파생된 치사 농도 50(LC50)의 계산을 제안합니다. 이 연구의 목적은 벌레의 생존과 번식에 대한 폐기물 유래 바이오 숯의 전반적인 독성 효과를 평가하는 것이었습니다. 따라서 치사 효과는 테스트 시작부터 끝까지 벌레 수의 백분율 변화로 결정되었으며 치사 효과 %로 보고되었습니다.
이 프로토콜은 실험실 조건 및 소규모(예: 100g 샘플)에서 재현 가능합니다. 그러나 더 큰 토양 부피에 맞게 확장하면 결과에 차이가 발생할 수 있습니다. 이는 일정한 수분 수준을 유지하기 위해 제어된 관개 시스템과 함께 토양과 사용된 바이오 숯의 적절한 기계적 혼합을 통해 제어할 수 있습니다. 또한 바이오 숯 효과는 공급 원료 유형과 열분해 온도에 따라 크게 달라졌으며, 이는 적용 전에 각 재료를 개별적으로 특성화하기 위한 향후 연구를 제안합니다.
이 프로토콜은 pH 및 수분 유지와 같은 물리화학적 매개변수와 다양한 유형의 바이오 숯으로 토양을 개량하는 것에 대한 생물학적 반응의 조합을 제공한다는 점에서 다른 토양 건강 평가 기술과 다릅니다. 전통적인 미생물 콜로니 수와 함께 효소 활성 분석을 포함하면 배양할 수 없는 미생물 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한, 이 연구는 다양한 농도의 다양한 바이오 숯 공급 원료를 기반으로 하여 실제 토양 개량 전략에 실질적인 관련성을 더합니다.
향후 연구에는 분뇨, 왕겨 또는 하수 슬러지와 같은 추가 공급 원료를 테스트하여 토양 생태계에 미치는 영향을 비교하는 것이 포함될 수 있습니다. 장기 현장 시험은 계절적 효과와 작물 수확량 결과를 평가하기 위해 조정될 수도 있습니다. 이 연구는 폐기물 유래 바이오 숯이 토양 건강에 미치는 공급 원료 및 농도 의존적 효과를 보여줍니다. 특정 바이오 숯은 미생물 활동과 식물 성장을 자극하는 반면, 다른 바이오 숯은 토양 유기체에서 억제 또는 독성 반응을 일으켰습니다. 적절한 바이오 숯 유형과 적용 속도를 선택하는 것은 토양 관리의 위험을 최소화하면서 이점을 극대화하는 데 필수적입니다.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
제시된 작업은 BIOCIRKL 프로젝트(등록 번호. TN02000044), 2023-2028년 동안 국립 역량 센터 프로그램 내에서 체코 회복 계획과 체코 공화국 기술청의 지원을 받습니다.
재료
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| 2,3,5- 트리페닐테트라졸륨 염화물 | 시그마-알드리치, 체코 공화국 | T8877 | |
| 오토클레이브 체르토클라브 클래식 | 체르토클라프, 오스트리아 | 8510174 | |
| 탄산칼슘 | 시그마-알드리치, 체코 공화국 | 239216 | |
| 원심분리기 MPW-251 | MPW 의학 기기, 폴란드 | 10251 | |
| 담배꽁초와 바이오차가 | 독일 호엔하임 대학교 | 700 & deg; 참고; | |
| 식민지 카운터 CC-200 | 콜-파머 | 14212-04 | |
| Enchytraeus albidus | 인바이탈 아쿠아 S.R.O. | ||
| 에탄올 | 펜타, 체코 공화국 | 70390-11003 | |
| 홉 바이오매스 바이오차 | 체코 과학 아카데미 연구소 | 650 & dg; 참고; | |
| 인큐베이터 Q셀 | 폴-랩, 폴란드 | ||
| 전자 레인지 | 안톤 파르, 멀티웨이브 PRO | ||
| 노트북 PC DELL Latitude 3510 | 델 프로덕츠, 아일랜드 | ||
| 영양 아가르 매체 | OXOID, 체코 공화국 | CM0003B | |
| OECD 토양 및 nbsp; | 마이크로바이오테스트, 벨기에 | ||
| pH 계 WTW inoLab pH 7110 | 자일렘 애널리틱스, 독일 | 1AA112 | |
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| 입체 현미경 MSZ5000-T-IL-TL | A. 크루스 옵트로닉, 독일 | MSZ5000-티-일-TL | |
| 트리스 베이스와 nbsp; | 시그마-알드리치, 체코 공화국 | 252859 | |
| 비디오 아이피스 VOPC93 USB 2.0 | A. 크루스 옵트로닉, 독일 | 그리고 nbsp; VOPC93 | |
| 체중계 케른 EMB | 커른, 독일 |
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