방법 논문

단일 세포 질량 분석법 대사체학 연구를 위한 시료 전처리: 결합된 세포 세척, 담금질, 건조 및 보관

DOI:

10.3791/68995

⸱

2025년 9월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 휘발성 염 용액 세척, 급속 액체 질소 담금질, 동결 건조 및 -8°C 저장을 결합하여 단일 세포 질량 분석법(SCMS)을 위한 세포 대사 산물을 보존하는 것을 목표로 합니다. 이는 액체 질소 담금질이 대사 산물 프로필을 유지하는 데 필수적이며, 대사 변화를 방지하기 위해 장기간 냉장 보관을 최소화해야 함을 보여줍니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단세포 질량 분석법(SCMS)은 세포 대사를 연구하는 데 없어서는 안 될 도구가 되었습니다. 현대 질량 분석법(MS) 기술의 발전과 기초 생물 과학 및 인간 질병의 세포 이질성 연구에 대한 수요로 인해 다양한 SCMS 기술이 개발되어 실험실 연구에 적용되었습니다. 대사산물은 세포 상태를 정확하게 반영할 수 있기 때문에 살아있는 세포의 SCMS 대사체학 분석은 세포에 대한 분자 정보를 제공하는 강력한 도구로 간주됩니다. 그러나 살아있는 세포의 SCMS 분석에서 주요 과제는 샘플 준비, 수송 및 측정 중에 내인성 대사 산물 프로파일을 보존하는 것입니다. 세포 대사산물은 회전율이 빠르고 환경 변화에 매우 민감하여 분석 전에 분해되거나 변형되기 쉽습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 SCMS에 대한 세포 대사 산물 무결성을 보존하도록 설계된 강력하고 재현 가능한 세포 준비 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 휘발성 포름산암모늄(AF) 용액을 사용한 세포 세척, 액체 질소(LN2)로 급속 담금질, 진공 동결 건조 및 -80°C에서의 보관을 통합합니다. 이 접근법은 대사 활동을 효과적으로 중단하는 동시에 세포막 손상을 최소화합니다. 결과는 빠른 세포 담금질이 중요하다는 것을 나타냅니다. 그러나 세포 대사 산물을 보존하려면 -80°C에서 보관 시간을 제한하는 것이 필요합니다. 제안된 프로토콜은 광범위한 응용 분야를 위한 다른 기존 SCMS 기술에 잠재적으로 사용될 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 간 이질성은 특히 질병 진행, 약물 내성 및 세포 분화의 맥락에서 생물학적 시스템의 기본 원리로 등장했습니다 1,2. 다세포 유기체에서 동일한 미세 환경에 있는 유전적으로 동일한 세포조차도 전사체3, 프로테오믹4 및 결정적으로 대사체 수준5의 차이로 인해 발생하는 뚜렷한 표현형을 나타낼 수 있습니다. 단일 세포 유전체학 및 전사체학은 지난 10년 동안 상당한 견인력을 얻었지만 단일 세포 대사체학은 대사산물의 고유한 복잡성과 빠른 역학으로 인해 상대적으로 덜 발달되어 있습니다6. 대사산물은 환경 단서에 매우 민감하고 다양한 화학 구조와 극성을 가지며7 작은 세포 부피8에서 낮은 농도로 존재합니다. 이러한 특성으로 인해 개별 세포에서 신뢰할 수 있는 측정이 분석적 과제가 됩니다. 대사체학은 세포의 실시간 기능 상태에 대한 가장 가까운 스냅샷을 제공하므로 단일 세포 해상도에서 대사체를 강력하게 연구하는 방법을 발전시키는 것은 세포 생리학 및 병리학에 대한 더 깊은 이해에 필수적입니다7.

기존의 벌크 대사체학 기술은 대규모 세포 집단에 걸쳐 신호를 평균화하여 세포 이질성을 마스킹하고 희귀하지만 중요한 대사 시그니처를 잠재적으로 모호하게 만듭니다. 대조적으로, 단일 세포 대사체학은 개별 세포 수준에서 고유한 생화학적 프로필을 밝혀 줄기 세포 분화, 약물 반응 및 질병 메커니즘과 같은 과정을 연구하는 데 매우 중요합니다 6,9,10,11,12,13. 매트릭스 보조 레이저 탈착-이온화(MALDI) MS 및 2차 이온(SI) MS와 같은 질량 분석법(MS) 기반 방법은 이 분야를 발전시켰지만 살아있는세포 분석을 제한하는 복잡한 준비, 진공 요구 사항 및 파괴적인 이온화와 같은 문제에 직면해 있습니다9,14. 특히, 기기의 최근 개발로 레이저 유도 위치 이온화(t-MALDI-215) 및 Orbitrap 2차 이온 질량 분석법(OrbiSIMS)16,17과 결합된 투과 모드 MALDI를 포함한 최첨단 기술이 탄생하여 단일 세포 및 세포 내 수준에서 라벨이 없는 고해상도 3D 대사 이미징이 가능해져 탁월한 질량 정확도와 공간 분해능을 제공했습니다.

주변 이온화 MS는 이러한 문제를 해결합니다. 대표적인 주변 SCMS 기술에는 라이브 단일 셀 비디오 질량 분석법(Video-MS)18, DESI19 및 나노-DESI20이 포함됩니다. 그 중 단일 프로브 SCMS는 이중 모세관 시스템(21,22,23,24)을 사용하여 실시간으로 살아있는 세포를 직접 샘플링하고 이온화하는 능력이 두드러지는 기술 중 하나입니다. 이 기술은 고해상도, 현장 대사 프로파일링을 가능하게 하면서 샘플 교란을 최소화하고 약물 흡수 및 세포 대사에 미치는 영향 22,25,26,27,28,29,30, 환경 반응 31,32 및 대사 이질성33에 성공적으로 적용되었습니다. 개별 셀 중 34,35,36.

많은 주변 SCMS 분석법이 살아있는 세포 분석을 가능하게 하지만, 개별 세포 선택에 필요한 수동 처리로 인해 일반적으로 처리량이 낮습니다 23,37,38. 세포 대사는 매우 역동적이기 때문에 확장된 시료 전처리는 대사 산물 프로필을 변경할 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 연구자들은 세포를 분리한 직후 담금질 기술을 적용합니다39,40. 담금질은 급속 냉각 41,42,43,44 또는 효소 변성 43,45,46,47에 의해 대사 활동을 중단시켜 특정 순간에 세포의 생화학적 상태를 보존합니다. 이 단계는 정확하고 시간적으로 관련성이 높은 대사체 데이터를 보장하는 데 필수적입니다. 효과적인 담금질 프로토콜은 세포내 대사 활동을 신속하고 철저하게 중단해야 합니다. 저온 등장성 식염수48, 냉각 아세토니트릴46, 저온 메탄올 44,47,48,49, 얼음 저온 인산염 완충액(PBS)43,50, LN2 43,44,51 및 열풍 처리52를 포함한 다양한 방법이 평가되었습니다 . 이들 중 다수는 원래 벌크 세포 대사체학을 위해 개발되었지만 콜드 메탄올 및 아세토니트릴과 같은 일부는 Pico-ESI-MS39 및 MALDI-MS46과 같은 단일 세포 기술에 적용되었습니다. 효과에도 불구하고 각 방법에는 단점이 있습니다: 유기 용매는 대사산물 누출 및 세포막 손상을 유발할 수 있습니다48,53, 비휘발성 염 용액은 이온 억제54, 감도 감소 및 데이터 정확도 저하47,55를 유발하여 MS를 방해할 수 있습니다.

LN2 스냅 냉동은 비휘발성 염을 남기지 않고 세포 대사를 빠르게 중단시켜 SCMS에 적합하기 때문에 생물학 연구56에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나 세포막을 손상시킬 수 있으며 이는 SCMS57,58에 문제가 됩니다. 이러한 손상을 줄이기 위해 일부 연구에서는 빠른 여과, 저온 NaCl 세척 및 빠른 회전율 대사 산물을 유지하는 데 도움이 되는 LN2 동결을 포함하는 방법을 사용했습니다53,59. 그럼에도 불구하고 이 방법은 개별 세포를 분리하는 데 어려움이 있고 염분 잔류물에서 잠재적인 매트릭스 효과로 인해 SCMS에 적합하지 않습니다. -80°C에서 보관하는 것은 또 다른 일반적인 보존 방법이지만 단일 세포 대사산물 프로필에 미치는 영향은 불분명합니다. 우리는 이전에 여러 주요 단계를 결합하여 이러한 한계를 해결하기 위한 연구를 보고했습니다: 세포를 먼저 휘발성 MS 호환 AF 용액으로 세척한 다음 LN2로 담금질하고 진공 동결 건조 및 저온(-80°C)에서 보관합니다.60. 현재의 접근 방식은 세포 손상과 대사 산물 분해를 최소화하여 보다 정확한 SCMS 측정을 가능하게 합니다. 이 작업은 강력한 SCMS 기술을 위한 이 세포 준비 방법의 채택을 촉진하는 것을 목표로 실험 세부 사항에 중점을 두고 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인증된 Class II 생물안전 실험실 및 멸균 조건 내에서 모든 단계를 수행합니다. 본 연구에서는 HCT-116 세포주를 모델 시스템으로 사용하였고, 완전 배양 배지에서 세포를 배양하였다. 사용된 리젠트와 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 배양

  1. 완전한 배지를 준비합니다. McCoy's 5A 배지에 소 태아 혈청(FBS) 10% 및 페니실린-스트렙토마이신 1%를 보충하십시오. 37°C로 데우십시오.
  2. 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양합니다. 매일 컨플루언트를 모니터링하고 배양이 ~80% 컨플루트에 도달하면 계대를 모니터링합니다.
  3. 세포를 계대합니다(~2일마다).
    1. 배지를 흡인하고 5ml의 1x PBS로 한 번 헹굽니다.
    2. 배양 접시에 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 넣고 세포 분리를 용이하게 하기 위해 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
    3. 예열된 완전 배지 8mL를 첨가하고 세포를 분산시키기 위해 부드럽게 피펫팅하여 트립신을 중화합니다.
    4. 현탁액 1mL를 신선한 완전 배지 9mL에 옮깁니다.
    5. 세포를 세십시오.
      참고: 세포는 제조업체의 지침에 따라 TC20 자동 세포 계수기를 사용하여 계수되었습니다. 트리판 블루 또는 기타 염색제는 사용되지 않았습니다.
  4. 커버슬립의 종자 세포.
    1. 세포를 ~1 × 106 cells/mL의 최종 농도로 희석합니다.
    2. 개별 18mm 유리 커버슬립을 12웰 플레이트의 웰에 놓습니다.
      참고: 유리 커버슬립은 세포 배양에 사용하기 전에 고압멸균해야 합니다.
    3. 2mL의 완전 배지와 200μL의 세포 현탁액(~2 × 105 cells/well)을 첨가합니다.
    4. 세포 부착을 허용하기 위해 세포를 밤새 배양합니다.
      참고: 세포가 정상적인 성장 상태인지 확인하려면 세포의 형태와 성장 상태를 정기적으로 확인하고(현미경 사용) 잠재적인 마이코플라스마 오염을 검사합니다(마이코플라스마 검출 키트 사용).

2. 포름산암모늄(AF) 용액으로 세포 세척

알림: 매번 새로운 AF 용액을 준비하십시오.

  1. AF 세척 완충액을 준비합니다. 포름산암모늄 0.45g의 무게를 측정하고 LC/MS 등급 물 50mL에 녹입니다. 포름산암모늄의 최종 농도는 0.14M(0.9% w/w)입니다.
    참고: 사용할 때까지 용액을 얼음처럼 차갑게 유지하십시오(0-4°C).
  2. 12웰 플레이트의 각 웰에 2mL의 차가운 AF 용액을 추가합니다.
  3. 커버슬립을 헹굽니다. 한 쌍의 멸균 겸자를 사용하여 부착 세포가 포함된 각 커버슬립을 웰에서 부드럽게 들어 올린 다음 짧게(2-3초 동안) 차가운 0.9% 포름산암모늄(AF) 용액 2mL로 미리 채워진 별도의 웰에 넣습니다. 헹굼 과정을 반복합니다.
    참고: 세척 단계에서 세포가 방해받지 않도록 세포를 매우 부드럽게 헹구십시오.

3. 액체질소에 의한 셀 담금질(LN2)

  1. AF로 헹굼한 각 커버슬립(세포가 위를 향함)을 알루미늄 호일 용기 내부의 페트리 접시에 넣습니다.
    알림: 극저온 등급 장갑, 보안경, 실험실 가운을 착용하십시오. 환기가 잘 되는 곳에서 모든 LN2 취급을 수행하십시오. 알루미늄 호일은 LN2 담금질을 위해 용기를 접는 데 사용할 수 있습니다.
  2. 커버슬립 위에 10-20mL의 액체 질소를 천천히 부어 완전히 덮습니다.
  3. 핀셋으로 페트리 접시를 즉시 기울여 남아 있는 액체 질소를 디캔팅합니다.
    알림: 세척 수분의 잔류로 인해 큰 얼음 결정이 형성되는 것을 방지하기 위해 몇 초 내에 이 작업을 완료하십시오.

4. 진공 상태에서 세포 동결 건조

  1. 해동을 방지하기 위해 LN2 담금질 직후 동결 건조하십시오.
    알림: SpeedVac의 로터를 제거하여 100mm 페트리 접시를 수용할 수 있는 평평한 플랫폼을 만듭니다.
  2. 극저온 장갑과 절연 핀셋을 사용하여 LN2 냉각 커버슬립이 들어 있는 페트리 접시를 진공 농축기 챔버에 놓습니다.
  3. 표준 진공 설정을 사용하여 처리하고 눈에 보이는 LN2 가 증발하고 커버슬립이 건조해 보일 때까지 5-7분 동안 계속합니다. 건조된 커버슬립에는 잔류 LN2 및 얼음 결정이 포함되어서는 안 됩니다.

5. -80°C 냉동고에 세포 보관

  1. 용기를 종이 타월로 싸서 -80°C 냉동고에 48시간 동안 옮깁니다.
  2. 보관 후 페트리 접시가 들어 있는 커버슬립을 즉시 실온 건조기에 ~10분 동안 옮깁니다. 커버슬립을 데시케이터에서 꺼내기 전에 커버슬립의 응결된 서리나 물이 완전히 사라지는지 확인하십시오.
    알림: 커버슬립을 데시케이터로 빠르게 옮기면 결로가 최소화됩니다. 경미한 표면 습윤도 건조된 대사 산물을 용해시킬 수 있습니다.
  3. AF 세척 후 샘플을 두 그룹(그룹 1 및 그룹 2)으로 나눕니다. 다음 처리 프로토콜을 적용합니다.
    그룹 1: LN2 담금질 → 동결 건조 → SCMS 분석(보관 없음).
    그룹 2: LN2 담금질 → 동결 건조 → -80°C 보관 48→시간 SCMS 분석.
  4. 아래 설명에 따라 SCMS 분석을 진행합니다.
    참고: 다른 조건을 사용하여 더 많은 세포군을 준비할 수 있습니다. 그룹 1과 그룹 2는 일반 프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다.

6. 단일 프로브 제작 및 SCMS 설정

참고: 단일 프로브는 확립된 절차 21,24,60,61에 따라 제작되며 여기에는 간단한 프로토콜만 제공됩니다.

  1. 레이저 풀러를 사용하여 이중 보어 석영 바늘을 당기고 ~10μm 팁을 생성합니다. 용융 실리카 모세관과 나노-ESI 이미터를 이중 보어 석영 바늘에 삽입하여 단일 프로브를 조립합니다. 모든 구성 요소를 빠른 경화 에폭시로 유리 슬라이드에 고정합니다.
  2. XYZ 스테이지에 단일 프로브를 장착합니다. 단일 프로브를 디지털 현미경 아래에 위치한 전동 XYZ 매니퓰레이터에 부착합니다.
  3. SCMS 분석을 위해 설정을 질량 분석기에 결합합니다.
  4. 0.1% 포름산을 함유한 아세토니트릴(≥99.9%)을 주사기 펌프로 전달하는 150nL/min의 유속으로 추출 용매로 사용하십시오.
  5. MS 매개변수를 설정합니다.
    양이온 모드: m/z 200-1500, +2.9kV, 질량 분해능 120k(m/z 200에서).
    음이온 모드: m/z 70-900, -2.1kV, 질량 분해능 120k(m/z 200에서).
    참고: 음이온은 일반적으로 양이온보다 낮은 m/z 범위에서 검출되기 때문에 이 두 이온 모드에 대해 서로 다른 m/z 범위를 사용할 수 있습니다. 추가 MS 설정에는 최대 주입 시간 100ms, 마이크로스캔 1회, 표준 자동 이득 제어(AGC), 전체 스캔 모드(MS 분석용), 10-35 정규화된 충돌 에너지(NCE)를 사용한 고에너지 충돌 해리(HCD)(MS/MS 분석용) 및 이온 전달 튜브 온도의 경우 320°C가 포함됩니다. 신호 안정성 및 단일 세포 검출을 모니터링하기 위해 각 스캔/시점에서 총 이온 크로마토그램(TIC)을 생성했습니다.

7. 단일 프로브 SCMS 실험

  1. 두 개의 커버슬립(그룹 1 및 그룹 2)을 단일 프로브 SCMS 설정 21,24,61의 전동 XYZ 스테이지에 함께 배치합니다.
  2. 배치 효과를 최소화하려면 현미경 아래에서 무작위로 세포를 선택하십시오.
  3. 양이온 및 음이온 모드 질량 스펙트럼을 획득합니다. 동일한 단일 프로브, 용매 유량 및 이온화 전압으로 그룹당 다중(예: ~30개) 셀을 분석합니다.
    참고: 데이터 비교 가능성을 보장하기 위해 모든 실험에 대해 동일한 단일 프로브, 용매 유량 및 이온화 전압을 사용하십시오. 획득하기 전에 매일 Orbitrap을 보정하십시오. MS 및 MS/MS 분석은 모두 단일 세포 수준에서 수행할 수 있습니다. MS 데이터를 수집하여 비표적 분석에서 대사산물 프로파일 및 잠정 표지 연구를 위한 정확한 m/z 값을 얻습니다. 표적 분석에서 분자 식별을 위해 선택된 이온의 MS/MS 분석을 수행합니다. 데이터는 호환되는 데이터 수집 및 해석 소프트웨어를 사용하여 수집되었습니다.

8. 데이터 분석

  1. 사용자 지정 R 스크립트를 사용하여 원시 SCMS 데이터를 전처리합니다. 전처리 단계에는 배경 및 노이즈 제거와 TIC 11,12,23에 대한 이온 강도 정규화가 포함됩니다.
  2. Python 패키지 ms_deisotope를 사용하여 SCMS 데이터를 탈동위원소로 만듭니다.
  3. 사내 Python 스크립트(60)를 사용하여 피크 정렬을 수행한다. 구간화에는 0.01m/z의 빈 너비를 사용하십시오. 피크 정렬을 위해 0.01m/z 또는 5ppm의 질량 허용 오차를 사용합니다.
  4. MetaboAnalyst 6.0을 사용하여 통계 데이터 분석을 수행합니다62. t-검정을 수행하고 히트 맵을 생성합니다(상대 대사 산물 수준의 경우). T-검정/ANOVA에서 상위 100개 사용을 선택하여 비교에서 유의미한 차이(p < 0.05)가 있는 p-값으로 순위가 매겨진 상위 100개 대사산물을 생성합니다. 이 상위 100개 대사산물을 사용하여 히트맵을 그립니다.
  5. Human Metabolome Database(HMDB63)에 대해 정확한 m/z 값 및 MS/MS 스펙트럼을 검색합니다. MS 데이터베이스 검색에서 10ppm의 질량 허용 오차를 사용합니다.
    참고: LipidMaps64와 같은 다른 데이터베이스를 데이터베이스 검색에 사용할 수 있습니다.

결과

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이 보고서는 세포 세척, 급속 세포 담금질, 진공 건조 및 -80°C에서의 보관을 통합하는 방법론을 설명합니다(그림 1). 구체적으로, 이 접근법은 SCMS 분석 전에 세포의 대사체 상태를 보존하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜의 효과는 두 가지 다른 조건에서 세포를 준비하여 테스트되었습니다: 새로 담금질되고 건조된 세포(그룹 1, 대조군 역할을 함)와 담금질, 건조 및 -80°C 저장된 세포(그룹 2). 각 그룹은 양이온 및 음이온 모드 모두에서 단일 프로브 SCMS 방법을 사용하여 분석되었습니다. 주성분 분석(PCA) 및 히트 맵 시각화를 사용하여 그룹 간 대사체 프로필의 차이를 평가했습니다.

양이온 모드의 PCA 결과(그림 2A)는 그룹 1과 그룹 2가 유사한 전체 대사 산물 프로필을 가졌음을 보여주었습니다. 그룹 1과 그룹 2의 거의 동일한 프로파일은 세포가 건조되기 전에 적절하게 담금질되는 경우 -80°C 48시간 동안 보관해도 대사체가 크게 변경되지 않음을 보여줍니다. 음이온 모드(그림 2B)에서는 유사한 패턴이 관찰되지만, 그룹 2는 특정 대사산물 클래스 간의 이온화 차이로 인해 약간 더 뚜렷하게 나타나지만, 예를 들어, 포스파티딜콜린은 양성 모드에서 더 잘 검출되는 반면, 지방산은 음성 모드에서 더 효율적으로 이온화됩니다60. 이러한 변화에도 불구하고 두 모드에서 그룹 1과 2 사이의 일관된 클러스터링은 통합 담금질-건조-저장 프로토콜이 대사 무결성을 유지한다는 결론을 뒷받침합니다.

히트 맵 분석은 두 그룹에 걸쳐 상위 100개 대사산물의 상대적 풍부도를 묘사하여 PCA 결과를 추가로 검증했습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 상위 100개 대사산물은 두 이온 모드 모두에서 그룹 1과 그룹 2 사이에 매우 일관된 존재도 패턴을 나타냅니다. 주요 변화나 그룹별 클러스터링은 관찰되지 않지만 일부 대사산물 클러스터의 사소한 변화는 이온화 효율 또는 대사 산물 안정성의 차이를 반영할 수 있습니다. 이러한 결과는 담금질-건조-보관 워크플로우가 높은 충실도로 세포 대사체 프로필을 보존하여 주변 SCMS 응용 분야에 매우 적합하다는 것을 종합적으로 보여줍니다.

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그림 1: LN2 담금질 및 -80°C에서 48시간 보관이 단일 세포의 대사 산물 프로파일에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 단일 세포 질량 분석법(SCMS) 분석을 위한 일반 워크플로우. (A) 세포를 파종하고, 배양하고, 암모늄 형식(AF) 용액을 사용하여 헹구었습니다. (B) 두 개의 세포 그룹을 준비했습니다-그룹 1: 세포를 세척, 담금질 및 동결 건조하여 보관 없이 즉시 SCMS 실험을 수행했습니다. 그룹 2: 세포를 세척, 담금질, 동결 건조 및 -80°C에서 보관했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: (A) 양이온 모드 및 (B) 음이온 모드에서 실험군의 HCT-116 세포에서 SCMS 데이터의 주성분 분석(PCA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 다양한 조건에서 준비된 단일 HCT-116 세포에서 검출된 상위 100개 대사산물의 상대적 수준을 보여주는 히트 맵으로, (A) 양이온 모드 및 (B) 음이온 모드에 대해 제시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 중요한 단계는 AF로 세척한 후 LN2 를 사용하여 살아있는 세포를 즉시 담금질하는 것으로, 이는 효소 활성을 실질적으로 감소시키고 진행 중인 대사 과정을 중단시킵니다. 또한 소멸하기 전에 AF로 세포를 세척하면 이온 강도가 향상되고 매트릭스 효과가 감소하여 SCMS 감도를 개선하기 위한 준비 단계로 포함할 수 있습니다. 현재 연구에서는 생물학적 분산을 최소화하기 위해 동일한 초기 배치를 사용하여 서로 다른 그룹(즉, 그룹 1 및 그룹 2)의 세포를 배양했습니다. 48시간 보관 시간이 선택된 이유는 추가 성장 시간이 있는 세포(그룹 1)가 저장된 세포(그룹 2)와의 비교 SCMS 분석을 위해 적절한 세포 밀도(예: 세포 응집체를 피하기 위해)를 여전히 유지할 수 있기 때문입니다. 그러나 냉장 보관에 의존할 때는 48시간 동안이라도 갓 건조된 샘플과 보관된 샘플 간의 비교에서 상당한 대사 변화가 여전히 관찰되었기 때문에 주의가 필요합니다(그룹 1 대 그룹 2). 실제 연구에서 세포 및 조직 샘플은 일반적으로 -80°C 냉동고에서 장기간(예: 몇 주 및 몇 달) 동안 보관되지만 대사 산물의 변화를 최소화하기 위해 보관 시간을 단축하는 것이 좋습니다.

따라서 문제 해결은 건조와 SCMS 분석 사이의 시간을 최소화하여 해동 조건에서 결로나 부분적인 재수화를 방지하는 데 중점을 두어야 합니다. 샘플 전이 중 잔류 수분 함량과 수분 응축은 세포를 부분적으로 재수화하고 대사 산물을 분해하는 가수분해, 산화 및 단백질 분해와 같은 효소 및 화학 반응을 가능하게 할 수 있습니다65 대사 산물 조성의 인위적인 변화로 이어집니다. 완전히 건조된 샘플은 이러한 과정을 효과적으로 차단하고 분자 무결성을 보존합니다66. 습기가 없는 건조 환경을 보장하고 SCMS로의 신속한 전환이 이러한 함정을 피하는 데 중요합니다.

대사산물 프로필을 보존하는 데 있어 이 방법의 성공에도 불구하고 한계는 남아 있습니다. 이 방법은 진공 건조 시스템과 -80°C 냉동고에 대한 접근이 필요하며 장기 보관에는 완전히 효과적이지 않습니다. 또한, 급속 실온 건조는 대사산물을 일시적으로 보존하지만 LN2 담금질을 대체할 수는 없습니다. 저장 관련 변경은 불완전한 수분 제거와 샘플 취급 중 재수화 위험으로 인해 여전히 발생할 수 있습니다. 이러한 제한 사항은 더 긴 저장 또는 더 높은 처리량이 필요한 경우 분석법 개선의 필요성을 강조합니다.

이 작업에서 보고된 프로토콜은 주변 SCMS에 대한 단일 세포 대사체를 보존하기 위한 간단하고 효과적인 접근 방식을 제공합니다. 정교한 냉동 보호제나 현장 냉동이 필요한 방법과 달리 당사의 워크플로우는 기존 주변 이온화 기술과 쉽게 호환되며 유연한 샘플링 및 분석 일정을 허용합니다. 대사체 충실도의 실질적인 손실 없이 세포 세척, 담금질, 건조 및 단기 보관을 통합하면 질량 분석기에 대한 주문형 액세스가 부족한 실험실에 실용적인 솔루션을 제공합니다. 이 접근법은 단일 세포 시스템 생물학, 암 대사, 약물 반응 이질성 및 희귀 세포 집단의 대사 표현형 분석 연구를 발전시킬 수 있는 강력한 잠재력을 가지고 있습니다. 특히 주변 이온화 기반 SCMS 플랫폼에 대한 이러한 프로토콜의 광범위한 적용 가능성은 단일 세포 분석 기술 분야에 중요한 기여를 합니다. 향후 연구에서 이러한 프로토콜은 더 다양한 세포 유형을 수용하도록 조정되고 개선될 수 있습니다. 추가 시료 전처리 단계(예: 매트릭스 적용)를 통해 처리된 세포를 잠재적으로 다른 SCMS 기술(예: MALDI 및 SIMS)으로 분석할 수 있으며, 더 많은 수의 세포(예: 고도로 융합된 세포)를 분석하기 위해 더 높은 공간 분해능과 처리량을 제공합니다. 결과는 또한 이러한 담금질-건조-보관 프로토콜이 잠재적으로 운송을 위한 세포를 준비하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다(예: 드라이아이스 용기에서) 다양한 위치에서 공동 SCMS 연구를 가능하게 합니다.

공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 국립과학재단(2305182), 국립보건원(1R01AI177469) 및 Chan Zuckerberg Initiative의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender(https://BioRender.com/yqn5isk)에서 작성되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
-80 &g도; C 냉동고에펜도르프 뉴브런즈윅U700시료 준비
아세톤트릴써모피셔 사이언티픽240744SCMS 실험 설정
포름산암모늄 써모피셔 사이언티픽401152500시료 준비
커버슬립 18mmVMR 마이크로 커버 유리48380046세포 배양
디지털 실체현미경심천 D& 에프(주)슈퍼아이즈 T004분석
이중 보어 석영 튜브, 1.120"x0.005"x12"프리드리히 & 딤목, Inc.MBT-005-020-2Q단일 프로브 제작
에폭시 수지데브콘부품 번호 20945단일 프로브 제작
포름산워드의 과학 470301-120 500mLSCMS 실험 설정
용융 실리카 모세관, ID: 40 & micro; m, OD: 100 및 마이크로; m폴리마이크로 테크놀로지스TSP040105단일 프로브 제작
용융 실리카 모세관, ID: 50 & micro; m, OD: 150 및 마이크로; m폴리마이크로 테크놀로지스1068150015SCMS 실험 설정
유리 커버슬립, 18mmVWR 48380046세포 배양
하이클론 합성 세럼(FBS)하이클론SH3006603세포 배양
부 화기 헤라셀(헤레우스)세포 배양
레이저 풀러서터 인스트루먼트 컴퍼니모델 P-2000단일 프로브 제작
LED UV 램프Foshan Liang Ya 치과 장비LY-C240 시리즈단일 프로브 제작
맥코이의 5A 깁코 2537128세포 배양
마이크로유니온IDEX 건강 및 사이언스 LLCM-539SCMS 실험 설정
수정된 FAIMS 프로 인터페이스 써모 피셔 98100-20046분석
MycoAlert PLUS 마이코플라스마 검출 키트론자LT07-703세포 배양
광학 보드 Thorlabs Inc., 뉴턴분석
Optima LC/MS 등급 물(Fisher Chemical, 미국)써모피셔 사이언티픽W6500시료 준비
Orbitrap Exploris 240 질량분석기 써모피셔 사이언티픽SCMS 실험 설정
페니실린/스트렙토마이신깁코15140-122세포 배양
인산염 완충 식염수(PBS)VWR0780-50L세포 배양
SpeedVac 집중 장치(Savant)써모피셔 사이언티픽 SPD111V시료 준비
주사기 펌프(SKE10)케믹스 주식회사80561SCMS 실험 설정
주사기, 250 & 마이크로; L해밀턴1725LTN250ULSCMS 실험 설정
TC20 자동 세포 계수기바이오 래드 연구소 1450102EDU세포 수
조직 배양 접시, 100mm피셔 사이언티픽 FB012924세포 배양
트립신-EDTA써모피셔 사이언티픽25200-072세포 배양
USB 디지털 현미경("전갈자리" 500 줌)Chinavasion, 도매 주식회사분석
UV 경화 수지프라임 치과품목 번호 006.030단일 프로브 제작
Xcalibur 소프트웨어써모피셔 사이언티픽
XYZ 스테이지(CONEX-MFACC)뉴포트 주식회사분석

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