Multiplex Real-Time Fluorescent PCR에 의한 황색포도상구 균 및 메티실린 내성 황색포도상구 균의 신속한 검출

Summary

이 프로토콜은 SA 특이적 nuc 및 MRSA mecA 유전자를 표적으로 하는 프라이머/프로브와 함께 다중 실시간 PCR을 사용합니다. 인간 가래 샘플에서 SA/MRSA 핵산을 신속하게(<1시간) 정성적으로 검출할 수 있어 배양 기반 방법의 한계를 극복할 수 있습니다.

Abstract

황색포도상구 균(S.aureus)은 국소 표재성 병변 및 식중독에서 치명적인 전신 감염에 이르기까지 다양한 임상 증상을 보이는 지역사회 획득 및 병원 감염을 일으키는 일반적인 그람 양성 인간 병원체입니다. 항생제의 발견으로 사망률은 크게 감소했지만 이후 약물 내성 문제가 점점 더 두드러지고 있습니다. 1960년 MRSA가 처음 확인된 이후 이 변종은 전 세계적인 공중 보건 위협으로 부상했습니다. MRSA는 병원 감염의 주요 병원체로 심내막염, 만성 골수염, 폐렴, 화농성 관절염, 균혈증 등 다양한 중증 질환을 일으킬 수 있습니다. 따라서 S. aureus 와 그 약물 내성을 신속하고 정확하게 검출하는 것은 임상 치료를 안내하는 데 중요합니다.

S.aureus 및 MRSA에 대한 현재의 일상적인 검출 방법에는 상당한 한계가 있습니다. 수십 년 동안 "황금 표준" 역할을 해온 전통적인 박테리아 배양 방법은 확실한 종 식별 및 약물 민감성 결과를 제공할 수 있지만 이 과정은 48-72시간이 걸릴 정도로 시간이 많이 걸립니다. 또한 이 방법은 오염되기 쉽고 전문 실험실 시설과 숙련된 기술자에게 의존합니다. 혈청학적 검사는 환자 혈청에서 황색포도상구균 항체를 검출하여 비침습적 진단을 달성하지만 활동성 감염과 과거 감염을 구별할 수 없으며 약물 내성 균주(예: MRSA)를 식별할 수 없습니다.

본 연구는 위에서 언급한 한계를 극복하기 위해 새로운 다중적 실시간 형광 PCR 검출 방법을 개발하는 데 중점을 둡니다. 이 방법은 S.aureus 의 종 특이적 nuc 유전자와 메티실린 내성을 매개하는 mecA 유전자를 표적으로 하는 특정 프라이머 및 TaqMan 형광 프로브를 설계하여 단일 반응 시스템에서 S.aureus 와 MRSA를 동시에 증폭하고 검출할 수 있습니다. 이 기술은 검출 시간을 크게 줄여 S.aureus 및 MRSA 검출을 위한 신속하고 정확하며 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다. 이러한 혁신적인 접근 방식은 임상 진단 효율성을 크게 향상시키고 표적 항생제 요법의 조기 시행을 촉진하여 약물 내성 세균 감염을 통제하는 데 중요한 기여를 합니다.

Introduction

S. aureus는 건강한 개인의 코 점막에 서식하는 광범위한 그람 양성 조건부 병원체입니다 ^1,2. 숙주 면역이 손상되면 국소 피부 감염, 심부 조직 침범 또는 전신 질환(예: 폐렴, 심내막염, 골수염 및 균혈^증)을 유발할 수 있습니다3. 반합성 페니실린인 메티실린은 1959년 황색포도상구균 감염에 임상적으로 적용되었으며, 2년 후 영국에서 MRSA가 등장하여 덴마크, 프랑스, 스위스 등 유럽 국가로 빠르게 확산되었습니다⁴. β-락탐 항생제에 대한 MRSA 내성은 임상 관리를 복잡하게 만들 뿐만 아니라 감염 위험을 크게 높입니다⁵. 통제할 수 없는 집락화/확산, 높은 예방 비용, 항생제 남용 등 여러 요인이 총체적으로 MRSA 감염률을 높였습니다⁶. MRSA 감염은 빠른 전파와 복잡한 내성 메커니즘으로 인해 높은 치사율과 관련이 있으며, EU 국가에서는 매년 거의 150,000건의 사례가 보고되고 >7,000명이 사망합니다⁷. CHINET 감시 데이터에 따르면 중국의 MRSA 감염률은 지난 5년 동안 30% 이상을 유지해 왔습니다⁸. 병원 교차 감염의 높은 위험은 공중 보건 부담을 더욱 심화시키고 의료 시스템에 부담을 줍니다 ^9,10. 따라서 효율적이고 정밀한 신속 MRSA 검출 기술의 개발은 조기 진단, 맞춤형 치료, 사망률 감소 및 전염 사슬 차단을 달성하기 위해 임상적으로 시급합니다.

S.aureus 및 MRSA에 대한 현재 검출 기술은 표현형 검출, 게놈 검출, 전사체 검출, 단백질체 검출, 질량 분석 기술 및 생물정보학 기반 분석을 포함한 여러 분야에 걸쳐 있습니다¹¹.

디스크 확산 방법(KB 방법) 및 최소 억제 농도 방법(MIC 방법)과 같은 표현형 검출 방법은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) 및 EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)에서 "황금 표준"으로 권장합니다. 이러한 방법은 특수 장비가 필요하지 않다는 장점이 있어 저항 스펙트럼 감시 및 역학 조사에 널리 사용됩니다. 그러나 그들의 단점도 분명합니다: 긴 배양 기간(24시간 이상) 및 일부 새로운 항생제에 대한 KB 방법의 결과는 MIC 값에 의한 검증이 필요하며 중단점 균주에 대한 결과는 인적 요인에 취약합니다^12,13.

게놈 수준의 검출 방법 중 기존 PCR은 감도가 높고 특이성이 강한 특성을 가지고 있어 내성을 예비 판단하고 실험 시간을 단축할 수 있으며 비용과 효율성이 높습니다. 그러나 그 한계는 알려진 내성 유전자만 검출할 수 있고 특수 기기에 의존할 수 있다는 것입니다¹⁴. 미생물 내성의 메커니즘은 매우 복잡하므로 알려지지 않은 내성 표현형을 다루고 신속한 식별을 가능하게 하는 기술적 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 새로운 GoPhAST-R(RNA 검출을 통한 결합 유전자형 및 표현형 AST) 기술은 mRNA 발현 수준을 검출하여 내성 표현형을 결정하고, 여러 병원체에 걸쳐 다양한 내성 관련 유전자를 동시에 검출할 수 있도록 하고, 실험 처리 시간을 단축하고, 기계 학습과 결합할 때 94-99%의 정확도를 달성합니다¹⁵.

단백질체 수준의 검출 방법 중 PBP2a 라텍스 응집 방법은 항원-항체 특이적 결합을 기반으로 하며 조작이 간단하고 결과가 빠르며 MRSA에 대한 특이성과 민감도가 높습니다. 그러나 다른 종의 포도상구균을 구별할 수 없으며 상용 키트의 검출 감도가 다소 감소하여 옥사실린⁸로 유도한 후 재검사가 필요합니다.

DOT-MGA(DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification) 방법과 같은 MALDI-TOF MS 기반 검출 방법은 배양 6-8시간에서 최적의 분석 성능을 달성하며 검출률은 96.4%에 달하며 민감도와 특이도는 모두 100%입니다. 그러나 비용이 높고 타겟 플레이트의 제한된 위치로 인해 수백 개의 샘플을 동시에 검출하기가 어렵습니다^16,17.

내성 예측을 위한 오믹스 데이터와 결합된 생물정보학 분석 기술 중에서 전유전체 염기서열 분석 기술은 고해상도와 포괄적인 정보 분석 능력이 돋보입니다. Resfinder와 같은 내성 유전자 분석 데이터베이스와 결합하여 균주가 특정 내성 유전자를 가지고 있는지 여부를 분석하고, 내성 전위를 예측하고, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 및 내성 관련 유전자 돌연변이를 검출하는 동시에 전체 게놈 데이터의 저장 및 재분석을 지원할 수 있습니다¹⁸. 그러나 이 방법은 생물정보학 배경을 가진 전문가의 운영이 필요하고 일상적인 검사에는 거의 사용되지 않으며 일반적으로 병원체의 역학 분석 또는 분자 감시에 사용됩니다¹⁹.

앞서 언급한 방법론은 비용이 많이 들거나 시간이 많이 걸리거나 아직 연구 개발 단계에 있습니다. 임상적으로, "즉각성"과 "정확성"의 균형을 맞추는 솔루션이 시급히 필요하며, 새로운 다중 형광 PCR 기술은 단일 튜브에서 nuc/mecA 유전자를 동시에 증폭하여 검출 주기를 1시간으로 압축함으로써 이러한 격차를 메웁니다. 이는 전통적인 "응급 선별 - 저항성 유형" 프로세스의 시간 창 격차를 정확하게 해소하여 병원 감염 예방 및 통제를 위한 보다 시간 효율적인 분자 진단 도구를 제공합니다. 이 특정 PCR 분석은 주로 호흡기 검체의 검출에 활용되며, 가래 검체를 대표적인 예로 들 수 있습니다. 500 copies/mL의 민감도와 높은 특이성을 나타내면서 항균제의 영향을 받지 않습니다. 이러한 유리한 성능 특성으로 인해 이 PCR 분석은 호흡기 감염 진단 및 MRSA로 인한 병원 감염 감시에 상당한 적용 가치를 지니고 있습니다.

Protocol

본 연구는 광동성 인민병원 윤리위원회의 승인을 받았다(윤리번호: KY2025-510-01). 본 연구에 사용된 재료(시약, 화학 물질, 장비 및 소프트웨어)에 대한 자세한 정보는 재료 표에서 확인할 수 있습니다.

1. 표본 수집 및 보존 프로토콜

1. 포함 기준: 품질 관리 재료를 제외하고 수집된 모든 샘플을 황금 표준 방법(배양 기반 분석)을 사용하여 양성 표본으로 식별합니다.
2. 인간 가래 수집
   1. 멸균 샘플링 튜브를 사용하여 피험자의 하기도에서 1-3mL의 깊은 기침 가래를 수집합니다. 튜브를 즉시 밀봉하고 분석을 위해 운송하십시오. 테스트를 위해 샘플을 즉시 처리하십시오.
3. 표본 보관:
   1. 위의 방법으로 수집된 샘플을 즉시 분석하십시오. 단기 보관은 다음과 같은 조건에서 허용됩니다.
      2-8 °C: ≤7일
      -20°C ± 5°C: ≤6개월
      -70°C ± 5°C: ≤24개월
      참고: 이 연구에서 가래 샘플은 방부제(예: BHI 국물 + 글리세롤 등)로 처리되지 않았습니다. 수집 후에는 위에서 설명한 조건에서 보관했으며 반복적인 냉동 및 해동은 엄격히 피했습니다. 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오. 최대 허용 동결-해동 주기: ≤3.

2. 핵산 추출

알림: 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛 내에서 모든 절차를 완료하십시오.

1. 가래 샘플 전처리의 경우 샘플을 4% NaOH 용액과 1:4 비율로 혼합하여 점성 가래 샘플을 액화하고 간섭 불순물을 제거한 다음 철저히 소용돌이(30초) 실온(22-25°C)에서 30분 동안 배양하여 액화합니다.
2. 핵산 추출 시약의 제조
   1. 키트에서 미리 포장된 96웰 플레이트를 꺼냅니다. 96웰 플레이트를 가볍게 넘겨 시약과 마그네틱 비드를 96웰 플레이트 바닥에 농축시킵니다.
   2. 액체가 튀는 것을 방지하기 위해 96웰 플레이트가 진동하지 않도록 알루미늄 호일 밀봉 필름을 조심스럽게 떼어냅니다.
   3. 96웰 플레이트의 컬럼 1 및 컬럼 7의 용액에서: 먼저 20μL Proteinase K를 첨가한 다음 추출할 200-300μL 샘플을 첨가합니다.
3. 자동 핵산 추출(마그네틱 비드 기반 방법)
   1. 샘플이 추가된 사전 포장된 96웰 플레이트를 자동 핵산 추출 기기의 해당 슬롯에 넣습니다.
   2. 아래에 설명된 대로 핵산 추출 과정을 따르십시오.
      1. 실험실 챔버의 자석 스틱을 사용하여 핵산이 흡착된 자기 비드를 다른 시약 구멍으로 옮깁니다.
      2. 교반 세트를 사용하여 액체를 빠르고 반복적으로 혼합하여 액체와 자기 구슬이 고르게 혼합되도록 합니다.
      3. 액체 구슬과 자기 구슬이 조화롭게 결합함에 따라 자동 핵산 추출기는 세포 용해, 핵산 흡착(70°C, 15분, 자기 흡착 3회), 세척(3회, 매번 2분간 혼합한 후 자기 흡착을 2회(각 15초)하고 용출(2회, 매번 5분 동안 혼합, 자기 흡착의 3배), 결국 고순도의 핵산을 얻습니다.
      4. 분광 광도계를 사용하여 핵산 농도와 순도를 검증합니다. 핵산 샘플의 부피는 50μL였으며 농도 범위는 50 내지 100 ng/μL이고 A260/A280 비율은 1.8 ± 0.2였습니다.
   3. 프로그램이 종료된 후 후속 테스트를 위해 열 6과 열 12에서 핵산이 함유된 용출액을 직접 빨아들입니다. 필요한 경우 장기간 보존 및 향후 사용을 위해 추출된 나머지 핵산 샘플을 -20°C에 보관하십시오.

3. S. aureus 핵산 및 MRSA 핵산의 qPCR 검출

1. 증폭 시약의 준비
   1. 키트에서 핵산 증폭 반응 용액과 nuc/mecA 반응 용액(S. aureus의 경우 nuc 유전자 특이적 프라이머/프로브, MRSA의 경우 mecA)을 꺼냅니다. 22-25°C에서 해동한 후 완전히 진동시켜 고르게 혼합한 후 순간 원심분리(~6000g, 15초, 22-25°C)를 수행합니다.
   2. 테스트할 샘플 수에 따라 N+2의 총량을 기준으로 시약을 준비합니다(N은 샘플 수, 2는 음성 및 양성 품질 관리). 구체적인 단계는 다음과 같습니다.
      1. 반응 시스템 혼합물(16 μL 핵산 증폭 반응 용액(완충액, dNTP, DNA 중합효소, UDG 효소) + 4 μL nuc/mecA 반응 용액(표적 검출 유전자 nuc, mecA 및 GAPDH 내부 참조에 대한 프라이머 및 프로브)을 준비합니다.
      2. 적절한 크기의 원심분리관에 넣고 완전히 진동시켜 고르게 혼합한 후 순간 원심분리(~6000g, 15초, 22°C-25°C)를 수행합니다. 그런 다음 튜브당 20μL를 PCR 반응 튜브에 분배합니다.
2. 핵산 및 품질 관리 샘플 추가:
   1. 위에서 준비한 PCR 반응 튜브(20μL)에 각각 테스트 샘플, 양성 대조군 및 음성 대조군에서 5μL의 핵산을 첨가하여 튜브당 25μL의 최종 부피를 달성합니다.
   2. 튜브를 단단히 캡핑하고 순간 원심분리(~6000 × g, 15초, 22-25°C)를 수행한 다음 튜브를 PCR 기기에 넣습니다.
3. PCR 증폭:
   1. 사이클링 프로그램을 다음과 같이 설정합니다. 사전 변성: 97 °C, 90초, 1 사이클; 42사이클 동안 다음 2단계: 97°C 변성 2초 및 55°C 어닐링 15초.
   2. 형광 신호 검출 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. nuc 유전자의 FAM 형광 표지를 사용합니다. mecA 유전자의 VIC 형광 표지; 키트의 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자의 CY5 형광 표지. 55°C에서 데이터를 수집합니다. 반응이 완료되면 향후 분석을 위해 데이터가 저장되었는지 확인하십시오.
   3. qPCR 전용 소프트웨어(SLAN 96P)를 사용하여 데이터 분석:
      1. 샘플 정보: 소프트웨어의 웰 플레이트 레이아웃 다이어그램에서 샘플 로딩 위치에 해당하는 샘플 유형(예: 양성 대조군, 음성 대조군, 알 수 없는 샘플, 내부 참조 유전자 등)에 라벨을 붙입니다.
      2. 반응 튜브 배치: 기기 가열 모듈의 뚜껑을 열고 밀봉된 PCR 플레이트/튜브를 내부에 안정적으로 놓고 가열 모듈에 꼭 맞는지 확인한 다음 모듈 뚜껑을 단단히 닫습니다(온도 불균일을 방지하기 위해).
      3. 반응 시작: 소프트웨어의 프로그램 설정이 올바른지 확인한 후 실행 시작 을 클릭하고 나중에 참조할 수 있도록 실험 ID를 기록합니다.
      4. 실행 중지 및 튜브 제거: 프로그램 실행이 완료된 후 가열 모듈의 온도가 50°C 이하로 떨어질 때까지 기다린 다음 뚜껑을 열어 PCR 플레이트/튜브를 제거하고 샘플을 적절하게 취급합니다.
4. 데이터 분석
   1. 데이터 분석 전에 세 가지 시각적 결과를 확인하십시오: 1) 모든 샘플(내부 대조군 포함)의 증폭 곡선은 평평하거나 비정상적으로 지연된 상승 곡선이 없는 전형적인 S자 모양을 보여줍니다. 2) 형광 임계선은 곡선의 지수 위상을 교차하고 내부 대조군(예: GAPDH)의 Ct 값은 ≤ 38주기 이내입니다(변동 계수 < 5%); 3) 오염 가능성을 모니터링하기 위해 전체 실험에 걸쳐 음성/양성 대조군이 포함됩니다.
      1. 실험이 통제 불능 상태인 경우 전체 배치를 다시 확인하십시오. 샘플에서 비정상적인 증폭(예: 비정형 S-곡선 또는 임계 범위 내의 Ct 값)을 보이면 해당 특정 표본을 다시 확인하십시오.
   2. 소프트웨어에서 실험 데이터를 불러오고, 임계값과 기준선을 설정하고, 기기가 기준선 임계값을 자동으로 선택하므로 Ct 값을 자동 또는 수동으로 계산합니다. 최종 양성 결정 값을 Ct ≤ 36으로 설정합니다. 내부 참조 유전자의 참조 범위에는 Ct ≤ 38이 필요합니다. 증폭 곡선이 특징적인 S자형 프로파일을 나타내는지 확인합니다.

Results

qPCR을 이용한 S. aureus 및 MRSA 검출
S. aureus의 종 특이적 nuc 유전자와 MRSA의 mecA 약물 내성 유전자를 기반으로 qPCR 검출을 위해 뚜렷한 형광단으로 표지된 프라이머와 프로브를 설계했습니다. qPCR 실험 전반에 걸친 모든 품질 관리 결과는 일관되게 권장 임계값 내에 속하여 검출 결과의 신뢰성을 확인했습니다(그림 1).

본 연구에서는 분석 키트의 민감도(검출 한계), 정밀도 및 양성/음성 일치율을 검증했습니다.

검출 한계(LOD): 저농도 핵산을 검출하는 키트의 능력을 평가하기 위해 500 copies/mL 품질 관리 물질에 대해 8회 복제 테스트를 수행했습니다. 결과는 nuc의 Ct 값이 33.56에서 34....

Discussion

메티실린 내성의 정확하고 조기 발견은 S. aureus로 인한 감염의 예후에 매우 중요합니다. S. aureus 및 MRSA의 조기 식별은 광범위한 항생제의 오용을 줄이고 박테리아 내성의 출현 및 확산으로 이어지는 선택압을 감소시킬 수 있습니다.

cefoxitin 디스크 확산과 같은 전통적인 표현형 검출 방법은 18-24시간의 배양 기간이 필요하고 이종 내성 균주에 대해 높은 위음성 비율을 나타내므로 중증 감염에 대한 신속한 진단 요구를 충족하기 어렵습니다²⁰. 실시간 형광 PCR 기술의 출현으로 병원체 식별이 표현형 의존적 추론에서 직접 유전자형 검출로 전환되었습니다. 표적 핵산 서열의 고특이성 인식을 통해 내성 유전자의 신속한 타이핑을 가능하게 하고 정확한 임상 관리를 위한 분자 기반을 제공합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
자동 핵산 추출기	다안	스마트 32	DNA 추출용
BSC-1500IIA2-X	바이오베이스	세다 20143222263	생물안전 캐비닛
E-원심분리기	웰텍		튜브 벽에서 잔류 액체를 원심분리합니다.
메티실린 내성 황색포도상구균 약물 내성 유전자 검출 키트	보제	ZC-HX-38-2	메티실린 내성 황색포도상구균 내성 유전자 검출
핵산 추출 키트	보제	TQ-BG-001-96B	핵산 추출
SLAN 전자동 의료용 PCR 분석 시스템	홍시		데이터 분석
SLAN-96S 실시간 PCR 기계	홍시	슬란-96S	형광 정량 PCR 증폭
Thermo Scientific NanoDrop	써모 사이언티픽	나노드롭 원	DNA, RNA 및 단백질의 정량 분석
초저온 냉동고(DW-YL450)	멜링	세다 20172220091	-20 &g도; 시약 보관용 C
소용돌이-5	킬린벨		혼합 시약용