방법 논문

효모 세포의 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 유세포 분석법과 결합된 최적화된 LIVE/DEAD 분석

DOI:

10.3791/69005

⸱

2025년 8월 29일

 ,  , 
1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 효모 샘플에서 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 원형질막 무결성을 정량화하기 위해 SYTO 9와 요오드화 프로피듐(PI)이라는 두 가지 형광 염료를 사용합니다. 유세포 분석을 사용하여 산화 후 스트레스 샘플에 대한 살아있는 세포, 죽은 세포 및 손상된 세포 분획에 대한 정량적이고 재현 가능한 추정치를 제공합니다.

초록

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생존을 정량화하는 것은 효모 연구에서 일반적이고 중요한 작업입니다. 원형질막 무결성을 기반으로 하는 LIVE/DEAD 염색은 유세포 분석과 결합할 때 효모 생존을 위한 신속하고 높은 처리량 분석을 제공합니다. 그러나 염색 완충액, 염료 농도, 배양 시간 및 유세포 분석 설정의 변화는 데이터 품질과 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 효모에서 스트레스 후 생존 정량화를 위한 표준화된 LIVE/DEAD 분석을 제시합니다. 기회 효모 병원체인 칸디다 글라브라타를 다양한 용량의 과산화수소로 처리한 후, 스트레스 후 샘플을 SYTO 9와 요오드화 프로피듐(PI)으로 구성된 2성분 LIVE/DEAD 염색으로 염색했습니다. 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포, 손상된 세포 및 죽은 세포 집단을 구별하고 각 샘플에서 백분율을 정량화했습니다. 살아있는 백분율 통계를 기반으로 한 생존 추정치를 동일한 샘플의 CFU(Colony Forming Unit) 결과와 비교했습니다. 두 가지 방법은 모의 및 치사량(1MH2O2)으로 처리된 샘플에 대해 일관된 결과를 산출했습니다. 100mM H2O2의 치사 이하 선량에서 SYTO 9/PI는 CFU보다 더 높은 생존율을 추정했으며, 여기에 제시된 프로토콜은 스트레스 직후 세포 생존을 평가하는 반면 CFU는 회복 및 번식할 수 있는 세포의 백분율을 정량화합니다. 따라서 이 프로토콜은 세포 사멸 과정의 초기 단계에서 생존력을 측정합니다. 요약하면, 여기에 설명된 프로토콜은 효모의 스트레스 후 생존 정량화를 위한 CFU에 대한 빠르고 확장 가능한 대안을 제공합니다. 그 결과는 초기 단계에서 생존을 평가하고 죽은 세포와 손상된 세포를 구별함으로써 CFU에 보완적인 정보를 제공합니다.

서론

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발아 효모 아문에는 많은 중요한 생물학적 및 생명 공학 모델이 포함되어 있습니다. 효모 연구에서 일반적이고 중요한 작업은 스트레스 또는 약물 치료를 포함하는 유전적 또는 환경적 교란의 영향을 정량화하는 것입니다. 예를 들어, 산업용 발효에서 생산자는 발효 공정의 효율성과 품질을 보장하기 위해 효모 배양의 생존 가능성을 모니터링해야 합니다1,2. 병원성 효모 종을 연구할 때 스트레스 또는 항진균제 치료 후 생존을 측정하는 것은 항진균제 내성과 같은 감염 관련 특성의 유전적 및 기계론적 기초를 이해하는 데 중요합니다. 카테터와 표면의 생존율을 측정하는 것도 임상 환경에서 중요한 작업입니다3. 이러한 다양한 시나리오는 모두 약물 및 스트레스 치료의 결과를 빠르고 정확하게 측정할 수 있는 정량적 접근 방식을 요구합니다.

위의 목표를 달성하기 위한 기존 방법은 측정 대상에 따라 세 가지 주요 범주로 나뉩니다. 첫 번째 범주는 클론 형성 또는 개별 효모 세포가 스트레스 후 단일 콜로니를 형성하는 능력을 측정합니다. 이 범주의 대표적인 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 분석입니다. 두 번째 범주는 살아있는 세포에서 효소 활동을 감지하는 데 의존하는 활력을 측정합니다. 예를 들면 FUN-1 염료와 같은 화학적 프로브가 있다4. 세 번째 범주의 방법은 원형질막 무결성을 측정합니다 - 원형질막 무결성의 돌이킬 수 없는 손실은 세포 사멸의 "돌아올 수 없는 지점"으로 간주됩니다5. 이 범주의 예로는 요오드화 프로피듐(PI)과 같은 형광 염료가 있습니다.

이 연구는 스트레스 처리 후 효모 생존의 빠르고 확장 가능한 정량화를 달성하기 위해 유세포 분석과 결합된 최적화된 LIVE/DEAD 분석을 제시합니다. 이 막 투과성 기반 분석은 CFU보다 빠르며, 콜로니가 형성되는 데 24-48시간의 배양에 비해 염색의 시간이 15-30분이 소요됩니다. 또한 LIVE/DEAD 염색으로 염색된 샘플은 현미경 검사와 함께 유세포 분석을 사용하여 쉽게 분석할 수 있으며, 현미경은 몇 초 만에 수만 개의 세포를 측정하고 고처리량 분석을 위해 96웰 샘플을 쉽게 처리할 수 있습니다. 결과적으로 이 분석은 빠르고 정량적이며 확장 가능합니다. 이 프로토콜에서는 향상된 분해능을 달성하기 위해 SYTO 9 및 PI로 구성된 2성분 LIVE/DEAD 염색이 사용됩니다. SYTO 9는 살아있든 죽든 모든 세포를 라벨링하는 반면, PI는 손상된 원형질막이 있는 세포에만 들어갑니다 6,7. 따라서 살아있는 세포는 SYTO 9만 축적하는 반면 죽은 세포는 SYTO 9와 PI를 모두 축적합니다. PI는 핵산에 대해 SYTO 9보다 친화력이 높기 때문에 세포8에서 후자를 경쟁적으로 배제합니다. 또한 두 염료는 FRET(Förster Resonance Energy Transfer) 쌍을 형성하며, 여기서 SYTO 9 방출은 여기로 PI에 흡수됩니다. 결과적으로 죽은 세포는 음소거된 녹색과 강한 적색 형광을 나타냅니다. 대조적으로, 살아있는 세포는 밝은 녹색 형광을 나타냅니다8. 이러한 차이는 각 그룹 내에서 형광 강도의 변화가 있는 경우 살아있는 세포와 죽은 세포를 더 잘 구별할 수 있게 해줍니다.

2004년 효모에 대한 적용에 대한 초기 보고서 이후 효모 연구에서 SYTO 9/PI의 사용은 불규칙했으며 현미경 7,9,10,11,12,13,14,15를 사용한 정성적 평가로 크게 제한되었습니다. 효모 생존을 위한 정량적 분석으로 채택하는 데 있어 주요 한계는 CFU와 같이 널리 사용되는 방법과의 체계적인 특성화 및 비교가 부족하다는 것입니다. 이 프로토콜은 염색 완충액, 염료 농도, 염색 시간 및 유세포 분석을 포함하는 표준화된 분석을 설명하며, 이는 C. glabrata 및 다른 두 가지 효모 종에 적용할 때 아티팩트를 최소화하고 재현 가능한 결과를 생성하는 것으로 밝혀졌습니다16. SYTO 9/PI 염색은 염색 패턴에서 살아있는 세포와 죽은 세포와 다른 중간 "손상된" 세포 집단을 나타내기 때문에 효모 세포에 대한 스트레스 처리의 효과에 대한 보다 미묘한 정보를 밝혀 CFU를 보완할 수 있으며 잠재적으로 새로운 응용 분야를 가능하게 합니다.

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프로토콜

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본 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 과산화수소 응력의 적용

  1. 실험 최소 하루 전에, 새로 줄무늬가 있는 플레이트의 단일 콜로니에서 C. glabrata 의 하룻밤 배양액을 3mL의 합성 완전(SC) 배지(1.7g/L 효모 질소 염기, 완전 아미노산 혼합물, 2% w/v 포도당, 물)에 접종하고 유리관을 롤러 드럼에 넣고 30°C에서 성장시킵니다. 또는 유리관을 비스듬한 각도로 놓고 배양액을 200rpm으로 흔들어 오비탈 셰이커를 사용할 수 있습니다.
    1. 다음날 아침 하룻밤 배양의 광학 밀도(OD600)를 측정하고 신선한 SC 배지로 총 부피 10mL의 OD600 ~0.2로 희석합니다. 중간 로그(OD600 ~1) 단계에 도달하기 위해 약 4시간이 걸리는 두 배로 성장시킵니다.
      예: 하룻밤 배양의 OD600 = 10인 경우, 이 배양액 200μL를 9.8mL SC 배지에 첨가합니다.
  2. 스트레스 처리 전 30분 이내에 과산화수소 스트레스 매체를 준비합니다. 30% 스톡(9.798M)에서 합성 완전(SC) 배지로 과산화수소를 원하는 농도로 연속적으로 희석합니다. 모의 치료(과산화수소가 첨가되지 않은 SC)와 치사량( C. glabrata에는 1M이 적합함)을 포함합니다.
    예: 100mM 과산화수소 스트레스 배지를 만들려면 10.3μL의 9.798M 과산화수소 스톡을 1mL SC에 첨가합니다. 부드럽게 피펫을 사용하여 혼합합니다. 10mM 과산화수소 스트레스 배지를 만들려면 100mM 과산화수소 스트레스 배지 500μL를 4.5mL의 SC에 희석합니다.
  3. 중간 로그 배양의 OD600 을 측정하고 SC 배지를 추가하여 예를 들어 OD600 = 1로 표준화합니다.
    예: 중간 로그 문화권은 OD600 = 1.2입니다. 배양액 1mL당 0.2mL SC 배지를 첨가합니다.
  4. 테스트 조건당 600μL 중간 로그 배양을 96 딥웰 플레이트로 옮깁니다. 실온에서 5분 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 펠릿 세포를 만듭니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 흡인하여 상청액을 조심스럽게 제거합니다.
  5. 1.2단계에서 준비된 모의 또는 과산화수소 스트레스 배지 600μL를 각 웰에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
  6. 플레이트를 30°C에서 300rpm으로 흔들면서 120분 동안 배양합니다.
    참고: 배양 시간은 관심 있는 생물학적 질문에 따라 다릅니다.

2. SYTO 9/PI 염색 적용

  1. 실험 전에 최소 10mL의 멸균 0.85% 식염수 완충액을 준비합니다.
    참고: 우리는 0.85% 식염수 완충액이 탈이온수 또는 성장 배지와 비교하여 모의 처리 샘플에서 염색되지 않은 죽은 세포와 같은 세포를 최소화하는 염색 인공물, 즉 염색되지 않은 죽은 세포를 생성하는 것을 발견했습니다16.
  2. 멸균된 탈이온수를 사용하여 0.2mM에서 PI의 작업 원액을 준비합니다.
    참고: 이 PI 작업 재고는 4°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 실험 직전에 멸균된 탈이온수와 함께 33.4μM의 작동 SYTO 9 원액을 준비합니다.
    참고: 각 실험을 위해 SYTO 9 작업 스톡을 새로 준비하십시오. 보관 및 재사용하지 마십시오.
  4. 부드럽게 피펫을 사용하여 치료 플레이트에서 각 웰의 세포를 혼합합니다. 각 처리 조건의 OD600 을 측정하고 세포를 OD600 1로 재현탁하는 데 필요한 완충액의 양을 계산합니다.
    알림: 다중 채널 피펫은 효율적이고 균일한 혼합을 위해 사용할 수 있습니다. 샘플을 과도하게 혼합하지 마십시오.
  5. 모의 또는 스트레스 처리 후 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 효모 세포를 수집합니다. 흡인을 통해 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 멸균 0.85% 식염수 완충액에 세포를 OD600 = 1로 재현탁합니다(2.4단계에서 계산).
    참고: 다중 채널 피펫을 사용하여 세포를 재현탁합니다. 모든 처리 후 배양균을 주의해서 다루고 과도하게 혼합하지 마십시오.
  6. 각 샘플의 50 μL를 비염색 및 단일 염료 염색 대조군으로 사용합니다.
    참고: SYTO 9 및 PI에 대한 두 채널 모두에서 야생형 C. glabrata 에 대해 최소 자가형광이 발견되었습니다. 그러나 항상 염색되지 않은 샘플의 자가형광을 확인하고 적절한 배경 빼기를 수행하거나 낮은 자가형광 성장 배지를 사용하십시오.
  7. 0.85% 식염수 완충액에 재현탁된 16μL의 처리 후 샘플을 50μL PCR 튜브에 분취합니다. 0.2mM PI 작업 스톡 2μL를 세포 현탁액에 첨가합니다. 그런 다음 SYTO 9의 33.4μM 작업 스톡 2μL를 동일한 튜브에 추가하여 최종 부피 20μL가 됩니다.
    1. PI 및 SYTO 9의 최종 농도는 각각 20μM 및 3.34μM입니다. 부드럽게 피펫을 사용하여 혼합하고 실온에서 어두운 곳(블랙박스 사용 가능)에서 30분 동안 배양합니다.

3. 유세포 분석기 설정 및 교정

참고: 이것은 각각의 새로운 기기와 다른 종/균주, 새로운 스트레스 요인 또는 성장 프로토콜 등을 포함하여 SYTO 9/PI 염색의 새로운 응용 프로그램에서도 수행되어야 합니다. 아래 설정은 Attune NxT 유세포 분석기에서 개발되었습니다. 구체적인 지침은 사용 중인 기기의 사용 설명서를 참조하십시오.

  1. 유세포 분석기에 적합한 형광 채널/필터 선택: 530nm ± 30nm 대역 통과 필터(BL1) 및 600nm 장관 필터(> 600nm, BL3)를 사용하여 녹색(SYTO 9) 및 빨간색(PI 및 SYTO 9) 채널에서 신호를 수집했습니다. 둘 다 488nm 청색 레이저에 흥분했습니다.
  2. 유속을 200 μL/min으로 설정하고 최소 30,000개의 이벤트가 수집되면 중지합니다.
    참고: 샘플당 이벤트 수는 백분율의 강력한 추정치를 달성하기 위해 조정할 수 있습니다. 이벤트(셀)가 너무 적은 샘플은 제외해야 합니다. 다음 단계는 초기 설정 중에 FSC 및 SSC 채널의 전압을 조정하는 것입니다.
  3. 16 μL 모의 처리된 염색되지 않은 샘플을 200 μL 멸균 0.85% 식염수 완충액에 희석합니다. 유세포 분석 직전에 부드럽게 피펫을 사용하여 혼합합니다. 이 샘플을 실행하고 모집단이 FSC 대 FSC의 중심에 오도록 FSC 및 SSC 채널의 전압을 조정합니다 . SSC 밀도 플롯.
    참고: FSC 및 SSC에는 각각 345mV 및 399mV의 전압이 사용되었습니다. 다음 단계는 초기 설정 중에 수집(BL1 및 BL3) 채널의 전압을 조정하는 것입니다.
  4. 24 μL 모의 처리 시료를 24 μL의 1000 mM 과산화수소 처리 또는 열사멸 시료와 혼합합니다.
  5. 혼합된 생세포와 죽은 세포 샘플을 각각 16μL의 튜브 3개로 나눕니다. 3개의 튜브를 (1) 2μL SYTO 9 및 2μL 물로 30분 동안 염색합니다. (2) 30분 동안 2μL PI 및 2μL의 물; (3) 2μL SYTO 9 및 2μL PI를 30분 동안 사용합니다. 이전 섹션의 염색 프로토콜을 따릅니다.
    1. 배양 후 멸균 0.85% 식염수 완충액 200μL를 각 튜브에 첨가합니다. 이제 유세포 분석을 할 준비가 되었습니다.
  6. 튜브(1)를 실행하여 녹색 형광(BL1) 채널의 전압을 조정합니다. 그런 다음 튜브(2)를 실행하여 적색 형광(BL3)의 전압을 조정합니다. 목표는 계측기의 전체 다이내믹 레인지를 활용하기 위해 각 채널의 강도 분포 모드를 ~10 4-105가 되도록 하는 것입니다.
    알림: 전압을 조정할 때 특정 유세포 분석기의 지침을 따르십시오. 일부 유세포 분석기는 전압이 고정되어 있으며 이 단계는 생략됩니다.
  7. 튜브(3)를 실행하여 살아있는 세포와 죽은 세포 집단이 잘 분리되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우 BL1 또는 BL3 채널 전압을 조정합니다.
    참고: Attune NxT의 BL200 및 BL1 채널 모두에 3mV의 전압이 사용되었습니다.
  8. 설정된 전압 설정에서 모의 처리된 염색되지 않은 샘플을 실행하여 샘플이 관심 채널에서 자가형광을 최소화하는지 확인합니다(<102).

4. 유세포 분석기에서 샘플 실행

  1. 위에서 설정한 유세포 분석기 설정을 적용하고 염색되지 않은 샘플을 먼저 실행하여 BL1 및 BL3 채널 모두에서 자가형광 신호가 102 미만인지 확인합니다.
  2. 염색된 각 샘플에 200 μL 0.85% 식염수 완충액을 첨가하고 유세포 분석기에서 실행합니다.
    참고: 여러 샘플을 분석하는 경우 각 샘플이 유세포 분석기에서 실행되기 전에 30분 동안 염색되도록 염색 단계를 엇갈리게 합니다.
  3. 유세포 분석 출력을 .fcs 파일(FCS 3.0 또는 3.1 표준)으로 내보냅니다.

5. R의 데이터 분석

참고: 샘플 분석 스크립트는 보충 파일 1로 제공됩니다. 예제 게이팅 전략은 대표 결과 섹션에 제공됩니다.

  1. 필요한 패키지를 설치하고 로드합니다: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. .fcs 파일을 현재 R 환경으로 가져옵니다.
  3. 파일 이름을 조정하고 처리 조건을 지정합니다.
  4. FSC의 모든 이벤트에 대한 2D 밀도 플롯을 만듭니다. H에 대한 SSC.H. 다각형 게이트를 사용하여 셀이 아닌 이벤트를 제외합니다. 이 게이트의 이름을 "cells"로 지정합니다.
    참고: 특정 유세포 분석기에서는 Height보다 Area 매개변수가 권장됩니다. 기기별 권장 사항을 확인하십시오.
  5. "세포" 게이트 모집단의 경우 FSC에 2D 밀도 플롯을 만듭니다. FSC.W에 대한 H 일반적으로 두 개의 클러스터가 유사한 범위의 FSC로 표시됩니다. H이지만 다른 FSC.W. 평균 FSC가 낮은 클러스터입니다. W 레벨에는 단일 셀("싱글릿")이 포함됩니다. 다각형 게이트를 그려 선택하고 게이트의 이름을 "싱글렛"으로 지정합니다.
  6. "일중항" 게이트 모집단의 경우 BL1에 2D 밀도 플롯을 만듭니다. BL3에 대한 H. H. 살아있는 세포와 죽은 세포 대조군을 기반으로 살아있는 개체군, 손상된 개체군 및 죽은 개체군에 대한 다각형 게이트를 그립니다. 대표 결과 섹션에 예제가 제공됩니다.
  7. 각 모집단의 백분율을 사용하여 생존율을 결정하고 통계를 내보냅니다.

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결과

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SYTO 9/PI 염색은 녹색(500nm-560nm) 및 빨간색(>600nm) 채널의 형광 신호를 기반으로 살아있는 효모 세포와 죽은 세포를 구별합니다. SYTO 9만 축적하는 살아있는 세포는 최소한의 빨간색 신호로 녹색 채널에서 강한 형광을 발합니다. 죽은 세포는 SYTO 9와 PI를 모두 축적하고 PI 및 FRET에 의한 SYTO 9의 경쟁적 배제로 인해 살아있는 세포에 비해 녹색 형광 신호가 낮은 빨간색 채널에서 강하게 형광을 발할 것으로 예상됩니다.

상기 SYTO 9/PI 염색 프로토콜을 산화 스트레스 C . glabrata 세포에 적용하였다. 중간 로그기 C. glabrata 세포를 0 mM, 100 mM 및 1,000 mM H2O2<...

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토론

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이 프로토콜은 두 가지 형광 염료인 SYTO 9 및 PI를 사용하고 유세포 분석을 사용하여 효모에서 스트레스 후 생존을 정량화하는 LIVE/DEAD 분석을 설명합니다. 이 두 염색은 문헌에서 다양한 효모 종의 생존을 평가하기 위해 적용되었으며 상용 키트로 제공되지만 제조업체 설명서나 문헌은 염색 프로토콜 또는 유세포 분석 설정에 대한 충분한 세부 정보를 제공하지 않습니다7. 여기에서는 최적의 염색 완충액, 염료 농도, 염색 시간 및 유세포 분석 설정을 포함하여 분석의 체계적인 특성화로 인한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 별도의 연구에서 설명된 추가 실험은 이 분석을 다양한 효모 종 및 항진균제 치료와 같은 다른 유형의 스트레스에 적용합니다16. 따라서, 여기에 설명된 프로토콜은 추가 검증에서 보다 일반적으로 유용할 수 있다.

제시된 ...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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현미경 검사에 대한 교육과 지원을 해주신 Michael Dailey 박사와 Carver Center for Imaging에 감사드립니다. 프로토콜에 대한 귀중한 피드백을 주신 Gene Regulatory Lab의 과거 및 현재 회원들에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 심부 웰 플레이트써모피셔278606NUNC 96
플레이트 리더가 장착된 Attune NxT 유세포 측정기써모피셔 A24858A24858오토샘플러 (A42901)
Candida glabrataCG99, 임상 분리균에서 유래한 실험실 균주(Cormack & 팔코우, 1999)
펑가라이트 효모 LIVE/DEAD 키트써모피셔 A24858L34952SYTO 9(3.34 mM)와 프로피듐 아이오다이드(20 mM)를 함유하고 있습니다. 이 두 부품은 여러 공급업체로부터 별도로 구매할 수도 있습니다.
과산화수소시그마 올드리치H1009
라이카 콘포컬 SP8 현미경라이카TCS SP8 X
소금시그마 올드리치S9888멸균된 0.85% NaCl 용액을 만드는 데 사용됨
아미노산이 없는 효모 질소염기시그마 올드리치Y06262% 포도당과 아미노산 혼합물을 포함한 합성 완전 배지를 만드는 데 사용되었습니다

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products. Food Res Int. 34 (9), 791-796 (2001).
  2. Qiu, X., et al. Stress tolerance phenotype of industrial yeast: industrial cases, cellular changes, and improvement strategies. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (16), 6449-6462 (2019).
  3. Welsh, R., et al. Survival, persistence, and isolation of the emerging multidrugresistant pathogenic yeast Candida auris on a plastic health care surface. J Clin Microbiol. 55 (10), 2996-3005 (2017).
  4. Millard, P. J., Roth, B. L., Thi, H. P., Yue, S. T., Haugland, R. P. Development of the FUN1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl Environ Microbiol. 63 (7), 2897-2905 (1997).
  5. WlochSalamon, D. M., Bem, A. E. Types of cell death and methods of their detection in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Appl Microbiol. 114 (2), 287-298 (2013).
  6. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD BacLight: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. J. Microbiol. Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  7. Zhang, T., Fang, H. H. P. Quantification of Saccharomyces cerevisiae viability using BacLight. Biotechnol Lett. 26 (12), 989-992 (2004).
  8. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry A. 61A (2), 189-195 (2004).
  9. Sun, S., Baryshnikova, A., Brandt, N., Gresham, D. Genetic interaction profiles of regulatory kinases differ between environmental conditions and cellular states. Mol Syst Biol. 16 (5), e9167(2020).
  10. Li, Z., et al. Allicin shows antifungal efficacy against Cryptococcus neoformans by blocking the fungal cell membrane. Front Microbiol. 13, 1012516(2022).
  11. Jin, Y., Zhang, T., Samaranayake, Y., Fang, H. H. P., Yip, H. K., Samaranayake, L. P. The use of new probes and stains for improved assessment of cell viability and extracellular polymeric substances in Candida albicans biofilms. Mycopathologia. 159 (3), 353-360 (2005).
  12. Bojsen, R., Regenberg, B., Folkesson, A. Saccharomyces cerevisiae biofilm tolerance towards systemic antifungals depends on growth phase. BMC Microbiol. 14, 305(2014).
  13. Ryan, L. K., et al. Activity of potent and selective host defense peptide mimetics in mouse models of oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3820-3827 (2014).
  14. Chudzik, B., Koselski, M., Czuryło, A., Trębacz, K., Gagoś, M. A new look at the antibiotic amphotericin B effect on Candida albicans plasma membrane permeability and cell viability functions. Eur. Biophys. J. (EBJ). 44 (1-2), 77-90 (2015).
  15. Roscetto, E., Contursi, P., Vollaro, A., Fusco, S., Notomista, E., Catania, M. R. Antifungal and antibiofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against Candida spp. clinical isolates. Sci Rep. 8 (1), 17570(2018).
  16. Tang, H., Liang, J., He, B. Z. An optimized LIVE/DEAD assay using flow cytometry to quantify poststress and antifungaltreatment survival in diverse yeasts. BioRiv. , (2025).
  17. Stiefel, P., SchmidtEmrich, S., ManiuraWeber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiol. 15 (1), 36(2015).
  18. Rego, A., Ribeiro, A., CôrteReal, M., Chaves, S. Monitoring yeast regulated cell death: Trespassing the point of no return to loss of plasma membrane integrity. Apoptosis. 27 (9), 778-786 (2022).
  19. CarmonaGutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  20. Miller, J., et al. Using colony size to measure fitness in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 17 (10), e0271709(2022).

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