이 논문은 사향의 주성분인 무스콘이 슈완 세포의 증식 및 세포사멸에 미치는 영향을 연구합니다. 결과는 벨 마비의 산화 스트레스 손상을 약화시키기 위해 IL-1R1을 억제함으로써 사향이 NF-κB 경로 활성을 감소시키는 잠재적인 메커니즘을 예비적으로 보여줍니다.
방법 논문
이 논문은 사향의 주성분인 무스콘이 슈완 세포의 증식 및 세포사멸에 미치는 영향을 연구합니다. 결과는 벨 마비의 산화 스트레스 손상을 약화시키기 위해 IL-1R1을 억제함으로써 사향이 NF-κB 경로 활성을 감소시키는 잠재적인 메커니즘을 예비적으로 보여줍니다.
천연 사향이 벨 마비를 치료하는 방법의 기본 메커니즘은 명확하지 않습니다. 본 연구는 시험관 내에서 말초신경손상 치료에 있어 사향의 잠재적 기전을 밝히는 것을 목표로 한다. 이를 달성하기 위해 염화코발트(CoCl2)를 사용하여 Schwann 세포(SC)에서 산화 스트레스 손상 모델을 확립했습니다. 이 손상에 대한 Muscone(Mus)의 보호 효과를 평가하고 그 메커니즘을 탐색하기 위해 세포 생존율 분석, siRNA 형질감염, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR), 웨스턴 블로팅, 면역형광 염색 및 세포의 미세구조 분석. 그 결과, Mus 개입은 저산소증 하에서 SC 증식과 S-100b mRNA를 향상시키는 동시에 활성 산소종(ROS)을 감소시키고 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 수준을 상승시키는 것으로 나타났습니다. Mus는 IL-1β 및 TNF-α를 감소시켜 저산소 SC의 산화 스트레스 및 염증을 개선했습니다. 또한 Mus는 C-JUN 및 GDNF를 포함하여 산소 대사, 세포 복구 및 신경대사와 관련된 주요 지표를 조절했습니다. SC 막에 국한된 IL-1R1은 저산소증에 의해 상향 조절되었지만 Mus 개입 후에는 유의하게 하향 조절되었습니다. Mus는 또한 NF-κB 경로 성분(IRAK1, IKK, p65, p50)의 발현을 억제하고 IκB-α를 증가시켰습니다. 결정적으로, siRNA 녹다운을 통한 IL-1R1 발현 제거는 Mus. IL-1R1을 억제함으로써 Mus는 NF-κB 경로의 억제를 통해 저산소성 SC의 염증을 약화시켰다는 결론을 내렸습니다. 이 연구는 저산소증으로 인한 SC 기능 장애에서 IL-1R1의 역할을 나타냈습니다. 더욱이 Mus는 벨 마비 치료에 잠재적으로 효과적인 약이 될 수 있습니다.
무스콘(Mus), 3-메틸사이클로펜타데카논은 일찍이 1906년에 사슴 사향의 천연 추출물에서 분리되었습니다 1. 귀중하고 효과적인 한약(TCM)인 사향은 팽창, 항염증, 소생, 혈액순환 촉진 등 광범위한 치료 효과가 있습니다2. 사향 함유 한의학은 중추신경계 질환3, 해독4, 위장관 종양5, 바이러스성 간염6, 관상 동맥 심장 질환7 등 다양한 일반적인 질병에 활용되어 왔습니다. 머스크의 의약품 유효성분인 머스는 항염증8, 항산화 8,9, 신경 손상 복구, 심근경색 완화10 등 우수한 생물학적 효과를 보여주었습니다. 기계적으로, 연구는 Mus가 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 활성 산소종(ROS)1,8과 같은 염증 사이토카인의 방출을 감소시키고 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK), 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인자(NF-κB), 라파마이신의 AKT/기계론적 표적(mTOR) 및 CaN/Erk1/2 경로1, 8,11 등
중국에서는 일부 의사들이 이전 문헌 기록과 임상 경험에 따라 천연 사향으로 벨 마비를 성공적으로 치료한 것으로 보고되었습니다 12,13,14,15. Mus는 진단 및 치료 지침에서 권장되는 약물은 아니지만 저개발 의료 분야나 스테로이드나 항바이러스제를 사용할 수 없는 일부 사람들에게는 Mus가 또 다른 선호 옵션이 될 수 있습니다. 최근 몇 년 동안의 문헌 분석에 따르면 사향은 말초 안면 마비 치료를 위해 발표된 한약 패치 처방 및 경혈 연구에서 가장 자주 사용되는 한약입니다16. 무스에 대한 많은 약리학적, 의학적 연구가 있지만, 사향이 벨 마비를 정확히 어떻게 치료했는지, 근본적인 신경화학적, 세포생물학적 메커니즘이 무엇인지는 아직 알려지지 않았습니다.
급성 특발성 안면 마비인 벨 마비는 모든 안면 근육을 자극하는 말초 안면 신경의 기능 장애로 인해 발생합니다. 벨 마비 증상의 가장 눈에 띄는 징후는 한쪽 안면 근육의 약화와 처짐입니다. 벨의 안면 마비는 생명을 위협하지는 않지만 환자의 삶의 질에 영향을 미치고 불안과 우울증을 유발할 수도 있습니다. 특히 걱정스러운 점은 환자의 최대 30%가 적절한 치료를 받더라도 공운동, 구축, 영구적인 안면 마비, 안면 비대칭 등 장기적인 후유증을 겪고 있다는 점이다. 따라서 벨 마비의 해결책을 찾고 마비의 위험을 줄이는 것이 우리의 주요 목표입니다. 벨 마비의 병원성 메커니즘에 대한 현재 지식은 불분명합니다. 최근 연구에 따르면 바이러스의 재활성화가 벨 마비의 주요 원인일 수 있으며, 이러한 바이러스는 신경 부종과 염증을 일으켜 벨 마비의 발작을 유발할 수 있습니다.
최근의 증거를 바탕으로 우리는 Mus가 안면 신경의 산화 스트레스 손상을 개선하여 벨 마비의 증상을 완화한다는 가설을 세웠습니다. 본 연구는 실험적으로 Mus의 치료 효과를 나타냈으며, SC에서 상향 조절된 IL-1R1이 NF-κB 경로를 활성화하여 세포 손상을 유발한다는 사실을 밝혔습니다. 결정적으로, 우리는 Mus가 IL-1R1을 하향 조절하여 NF-κB 신호 전달을 억제한다는 것을 입증했습니다. 우리의 연구 결과는 시험관 내에서 산화 스트레스에 노출된 SC에서 IL-1R1 상향 조절의 역할을 확인하고 Mus 투여를 새로운 치료 전략으로 포지셔닝했습니다.
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본 실험적 연구는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: LL-240077)의 승인을 받아 수행되었습니다.
세포 배양 및 약물 개입
쥐 슈완 세포(SC)를 기초 배지, 5% 소 태아 혈청, 1% 슈완 세포 성장 보충제, 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신으로 구성된 슈완 세포 배지에서 배양했습니다. 모든 세포는 37°C에서 5% CO2 분위기에 보관되었습니다. 70-80%의 밀도까지 성장하도록 허용했을 때 SC는 4개의 그룹(그룹당 n = 5)으로 나뉩니다: (1) NC 그룹; (2) NC+CoCl2 그룹; (3) NC+CoCl2+Mus 그룹; (4) NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus 그룹.
저산소증을 모방하기 위해 자주 사용되는 제제인 염화코발트(CoCl2)는 저산소증 유도 인자의 분해 및 안정화 및 HIF-1α 단백질의 축적 방해와 같은 저산소증과 유사한 반응을 유발하는 것으로 알려져 있습니다15. Osuru et al.17에 기초한 수정된 방법에 따르면, NC+CoCl2 그룹 및 NC+CoCl2+Mus 그룹에서, 240 μM CoCl 2가 보충된 Schwann CellMedium에서 가습 인큐베이터 (21%O2) 에서 37°C에서 95% 공기 및 5%CO2의 대기 조건에서 8시간 동안 SC를 배양하였다. 그런 다음 Mus 그룹에서 추가 24시간 동안 1.25μg/mL Mus의 개입을 적용했습니다. 한편, NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus 그룹에서 SC는 먼저 24시간의 siRNA 감염으로 처리한 다음 240μM CoCl2로 8시간 동안 지속적으로 배양한 후 이전 그룹과 마찬가지로 추가로 24시간 동안 1.25μg/mL Mus를 중재했습니다. 실험 과정의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.
세포 생존율 분석
SC의 생존력은 제조업체의 지침에 따라 세포 계수 키트-8(CCK-8) 분석 시약을 사용하여 결정되었습니다. 5 × 105 세포/웰의 밀도로 배양된 SC를 5% CO2 가습 분위기에서 37°C에서 100μL의 완전 성장 배지와 함께 96웰 세포 배양 플레이트에 파종했습니다. 컨플루언트가 70-80%에 도달하면 CCK-8 용액 10μL를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 96웰 플레이트의 광학 밀도(OD)는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 측정하고 세포 생존율을 계산했습니다. 세포는 NC군, NC+CoCl2 군, NC+CoCl2+Mus군, NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus군의 4군으로 나누었다. 실험 결과는 블랭크 웰(배지+CCK8 용액)을 사용하여 보정되었습니다. 세포 생존율 = [(실험군 - 빈 웰)/(NC 그룹 - 빈 웰)] × 100%.
siRNA 형질감염
형질감염은 24시간 동안 농도 100ng/μL의 siIL-1R1(AUAGUCUUGGAUUUUCUCCAA, GGAGAAAAUCCAAGACUAUGA)의 합성 siRNA 듀플렉스를 사용하여 상업용 시험관 내 siRNA/miRNA 형질감염 시약의 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. siIL-1R1 형질감염 후, 형질감염 24시간 후 RT-qPCR 분석을 수행하여 siIL-1R1 발현을 평가하였고18, 그 효율은 80% 이상이어야 한다
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)
배양 후 상청액을 수집하고 그룹별 조건(2950g, 20분, 25°C)에서 원심분리했습니다. IL-1β, TNF-α, ROS 및 SOD의 세포외 수치는 키트 지침에 따라 ELISA를 통해 분석되었습니다. 450nm에서의 최종 흡광도 판독값은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 얻었습니다.
RNA 분리 및 정량적 실시간 PCR(RT-qPCR)
제조업체의 지침에 따라 TRizol 시약을 사용하여 배양 세포에서 총 RNA를 추출했습니다. 표적 유전자(IL-1β, TNF-α, S-100b, IL-1R1)를 PCR 기기에서 40주기 동안 20μL의 SYBR qPCR 혼합 반응에서 증폭했습니다. 데이터 정규화는 β-액틴을 사용했으며 용융 곡선 분석을 통해 PCR 특이성을 검증했습니다. 2-ΔΔCt 방법은 3중으로 분석된 5개의 독립 샘플에서 상대적 발현을 정량화했습니다. 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다.
웨스턴 블롯
처리 후, 모든 실험군의 SC를 24시간 동안 배양하고 수확했습니다. 총 단백질은 총 단백질 추출 키트를 사용하여 추출되었습니다. 단백질 용해물을 98°C에서 5분 동안 변성된 나트륨 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 로딩 완충액과 결합하고 10-12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리(레인당 20μg)했습니다. 분해된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 전기영동으로 전달했습니다. 멤브레인을 5% 무지방 분유로 실온에서 60분 동안 차단한 후, 항-HIF-1α 항체 (1:1000), 항-GAPDH 항체 (1:1000), 항-IL-1R1 항체 (1:1000), 항-C-JUN 항체 (1:1000), 항-GDNF 항체 (1:1000), 항-IRAK1 항체 (1:1000), 항-IKK 항체 (1:1000), 항-p65 항체 (1:800), 항-p50 항체 (1:900), 항-IκB-α 항체(1:900) 및 항-β-액틴 항체(1:1000). 세척 후, 멤브레인을 25°C에서 60분 동안 양 고추냉이 과산화효소(HRP) 접합 2차 항체로 조사했습니다. 단백질 신호는 Image Studio Digits Ver 4.0을 사용하여 검출되었습니다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화되었고 β-액틴 및 GAPDH 발현으로 정규화되었습니다. 세 가지 독립적인 실험이 수행되었습니다.
면역형광
SC의 IL-1R1 국소화는 Zhao et al.19에 따라 평가되었습니다. 트립신화에 의해 로그 성장 단계에서 세포를 수확하고, 신선한 완전 배지에 재현탁하고, 완전히 분쇄하여 균일한 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 멸균 커버 슬립이 들어 있는 배양 플레이트에 세포를 시드합니다. 세포가 완전한 합류에 도달하면 인산염 완충 식염수(PBS)로 1-2회 헹구고 커버 슬립을 조심스럽게 제거한 다음 부착 세포를 PBS에서 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하고 0.05% Triton X-100(10분)으로 투과화하고 5% 염소 혈청으로 차단합니다(1시간). 1차 배양은 토끼 항쥐 IL-1R1 mAb를 사용했습니다. PBS 세척 후, 샘플을 실온에서 2시간 동안 FITC 접합 염소 항토끼 IgG와 함께 배양했습니다. 장착을 위해 커버 슬립에 수용성 마운팅제를 첨가하십시오. 면역 표지 세포는 여기 파장 492nm, 방출 파장 520nm의 형광 현미경을 사용하여 시각화 및 정량화되었습니다.
초미세구조 분석
Zhao et al.의 프로토콜19에 따라 SC를 2.5% 글루타르알데히드에 고정하고 1% 사산화오스뮴에서 4°C에서 하룻밤 동안 사후 고정했습니다. 샘플은 에탄올/아세톤 탈수 시리즈를 거쳤습니다. 초박형 절편(80nm)은 투과전자현미경을 이용한 미미세구조검사 전에 우라닐아세테이트와 구연산납으로 염색하였다.
유해 화학 시약의 폐기
CoCl2 를 함유한 배지 및 용액은 지정된 중금속 폐기물 용기에 수집됩니다. 피펫 팁, 원심분리기 튜브, 장갑 등 앞서 언급한 액체와 접촉한 모든 일회용품은 중금속 유해폐기물로 분류되어 적절한 폐기를 위해 관련 당국의 승인을 받은 허가된 유해폐기물 관리 회사로 이송됩니다. 폐 파라포름알데히드 용액은 전용 알데히드 폐기물 용기에 버리십시오. 사용한 소모품은 알데히드 폐기물로 수거하여 동일한 허가를 받은 유해 폐기물 관리 회사에서 처리해야 합니다.
통계 분석
다그룹 비교는 GraphPad Prism 8.0에서 Tukey의 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석으로 분석되었습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 정의되었습니다. 데이터는 평균 ±± 표준 편차(SD)로 표시됩니다.
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시험관 내 Schwann 세포의 산화 스트레스 손상에 대한 Mus의 보호 효과
HIF-1α의 발현은 저산소 상황의 변화에 반응하여 변화를 나타냈습니다20. 저산소증을 모델링하기 위해 SC는 CoCl2에 노출되었으며, 이는 웨스턴 블로팅을 통해 표준 저산소증 마커인 HIF-1α 단백질 수치 상승에 의해 확인된 바와 같이 저산소증을 성공적으로 유도했습니다(그림 2A). 저산소 SC의 후속 Mus 개입은 증식 및 스트레스 반응에 미치는 영향을 평가했습니다. CCK-8 분석은 Mus가 저산소성 SC 증식을 유의하게 증가시킨 것으로 나타났습니다(그림 2B). 재생 능력을 평가하기 위해 재생 마커인 S-100b mRNA 발현을 RT-qPCR에 의해 정량화했습니다. 저산소증은 S-100b 전...
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벨 마비는 편측성 안면 약화를 특징으로 하는 특발성 말초 안면 신경 마비입니다. 수초는 뉴런의 효과적인 기능에서 다양한 중요한 기능을 수행합니다23. 신경 자극의 원활한 전도를 보장하고, 영양 인자를 공급하여 뉴런을 지원하며, 재생 과정을 돕습니다24 . 따라서 말초 신경계에서 미엘린이 손실되면 탈수초성 신경병증이 발생하여 근육 위축, 감각 이상, 무감각 및 마비를 유발할 수 있습니다25. 말초 신경계의 주요 신경교세포인 슈완 세포(SC)는 신경 재생 과정에서 중요한 역할을 합니다26. 신경이 손상되면 SC는 재프로그래밍을 거쳐 특수한 "복구 SC"로 변모합니다. 이러한 복구 SC는 퇴행성 축삭과 수초 파편을 제거하고 축삭의 재성장을 촉진하며 궁극적으로 재생 축삭을 재수초화하는 역할을 합니다
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저자는 경쟁 이해관계를 가지고 있지 않음을 선언합니다.
모든 저자는 바오산구 위생위원회 인재(우수 학술 리더) 프로그램(BSWSYX-2024-02), 상하이 중의학 대학 지출 예산 프로그램(2021LK003), 바오산구 위생위원회 우수 청소년(Yucai) 프로그램(BSWSYC-2024-02) 및 기조 연설 의학 분야 및 특징 브랜드의 육성 프로젝트 클래스 B, 상하이 바오산구 보건위원회(BSZK-2023-BP07). 이러한 자금 지원 기관은 연구 설계나 출판을 위해 원고를 제출하는 결정에 어떠한 역할도 하지 않았습니다.
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| TBS 10배 | 유바이오텍 | BF0153 | |
| 10-180 KD 프리스테인드 컬러 단백질 마커 | 유바이오텍 | P0069 | |
| 5% 무지방 분유 | Beyotime Biotechnology, 중국 | P0216-300g | |
| 항-C-JUN 항체 | 세포 신호 전달, 미국 | #9165T | |
| 항-GAPDH 항체 | abcam, 영국 | AB245355 | |
| 항-GDNF 항체 | 세포 신호 전달, 미국 | #47808 | |
| 항-HIF-1&알파; 항체 | 세포 신호 전달, 미국 | #14179 | |
| 항-IKK 항체 | 세포 신호 전달, 미국 | #2682 | |
| 항-IL-1R1 항체 | 세포 신호 전달, 미국 | #6775 | WB용 |
| 항-IL-1R1 항체 | 프로틴테크 | 84094-6-RR | 면역형광용 |
| 항-IRAK1 항체 | 세포 신호 전달, 미국 | #4395 | |
| 안티 I&카파; B-&알파; 항체 | 세포 신호 전달, 미국 | #8943 | |
| 항-P50 항체 | abcam, 영국 | AB305263 | |
| 항-p65 항체 | abcam, 영국 | AB16502 | |
| 항쥐 IL-1R1 mAb | Beyotime Biotechnology, 중국 | AF7212 | |
| 항-&베타;-액틴 항체 | 앱캠 | AB179467 | |
| BCA 단백질 정량 키트 | 유바이오텍 | WB2123 시리즈 | |
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