방법 논문

NgTET 지원 CRISPR-Cas 시스템을 사용한 정확한 파지 돌연변이 유발

1.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69022

⸱

2025년 10월 14일

 ,  , 
1Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 2Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 3Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, 4Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), 5Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

이 논문에서

요약

여기에서는 NgTET 효소를 사용하여 박테리오파지의 DNA 변형을 줄여 효율적이고 흉터가 없는 CRISPR-Cas 돌연변이 유발을 가능하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 생명공학 및 파지 치료에 응용하기 위한 파지의 유전 공학을 용이하게 합니다.

초록

박테리아 숙주를 특이적으로 표적으로 삼는 바이러스인 박테리오파지는 생명공학 및 의학, 특히 다제내성 감염 퇴치에 있어 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 파지 감염의 기초가 되는 분자 메커니즘은 대부분 충분히 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 파지의 정밀하고 부위 특이적 돌연변이 유발은 유전자 기능과 파지-숙주 상호 작용을 밝히는 강력한 도구입니다.

그러나 파지 게놈 돌연변이 유발의 주요 과제는 CRISPR-Cas와 같은 기존 게놈 편집 도구를 방해하는 파지 DNA 변형의 존재입니다.

CRISPR-Cas 시스템은 다양한 유기체의 표적 돌연변이 유발에 성공적으로 사용되었지만 파지 돌연변이 유발에서의 효과는 종종 시토신 글리코실화와 같은 DNA 변형에 의해 제한됩니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 우리는 파지 DNA 변형의 풍부함을 일시적으로 감소시켜 효율적인 CRISPR-Cas 표적화와 파지 게놈에 대한 정확한 돌연변이 도입을 가능하게 하는 효율적인 방법을 개발했습니다. 구체적으로, 우리는 DNA에서 메틸화 및 하이드록시메틸화된 시토신을 반복적으로 모독화하는 Naegleria gruberi (NgTET)의 TET(Ten Eleven Translocation) 메틸시토신 디옥시게나제를 사용합니다. NgTET는 파지 DNA 내에서 하이드록시메틸화된 시토신을 산화함으로써 글리코실화와 같은 후속 시토신 변형을 방지하고 Cas 매개 DNA 절단의 효율성을 크게 향상시킵니다.

결론적으로, 여기에 제시된 흉터가 없고 정밀한 게놈 편집 접근 방식은 파지 게놈의 천연 유전자 구조를 유지하면서 점 돌연변이를 효율적으로 도입할 수 있게 해줍니다. 이 방법은 손상되지 않은 전사 및 번역 프레임워크를 보존함으로써 복잡한 규제 네트워크에 대한 의도하지 않은 중단을 최소화합니다. 이는 필수 또는 다기능 파지 단백질을 조사하는 데 특히 중요합니다. 외부 서열을 도입하지 않고 표적 유전자 변형을 생성하는 능력은 파지 생물학을 위한 실험 툴킷을 크게 확장합니다. 이 전략은 상세한 기능 연구를 촉진할 뿐만 아니라 치료 및 생명공학 응용을 위한 파지의 합리적인 엔지니어링 가능성을 향상시킵니다.

서론

박테리오파지는 박테리아를 특이적으로 표적으로 삼는 바이러스입니다. 그들은 생명공학 및 의학, 특히 다제내성 박테리아와의 싸움에서 엄청난 잠재력으로 인해 상당한 연구 관심을 끌었습니다 1,2,3. 그럼에도 불구하고 파지 생물학은 상대적으로 연구가 부족합니다. 박테리아 숙주를 납치하는 분자 메커니즘에 대한 더 깊은 이해는 치료 및 생명 공학 잠재력을 완전히 활용하는 데 필수적입니다4. 효율적인 파지 감염의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하고 특정 응용 분야를 위해 파지를 조작하려면 파지 게놈을 유전적으로 변형하는 능력이 필수적입니다. 그러나 이는 파지 생물학 분야에서 가장 중요한 과제 중 하나로 남아 있습니다 3,5,6.

파지 DNA는 종종 퓨린 및 피리미딘 염기의 특정 화학적 변화, 예를 들어 시토신 글리코실화 및 메틸화에 의해 변형됩니다. 이러한 변형은 숙주 뉴클레아제에 의한 인식 및 분해로부터 파지 유전 물질을 보호합니다6. 이러한 변형은 파지 적합성에 중요하지만 DNA 표적 시스템에 의존하는 파지 게놈 공학 접근법에 중요한 장애물입니다 2,3,7.

제한 변형 시스템 및 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-CRISPR 관련(Cas) 단백질 기반 기술을 포함한 기존 돌연변이 유발 전략은 시토신 글리코실화와 같은 보호적 후생유전학적 변형으로 인해 파지 DNA를 변형할 때 심각한 문제에 직면해 있습니다8. 박테리아 및 진핵 세포에서 매우 효과적인 CRISPR-Cas 매개 게놈 편집은 Cas 뉴클레아제에 의한 표적 게놈 유전자좌에서 DNA의 정확한 절단에 이어 원하는 돌연변이를 운반하는 기증자 DNA와의 상동 재조합을 통한 DNA 복구라는 두 가지 주요 단계에 의존합니다1. 그러나 파지에서 DNA 변형은 종종 Cas 뉴클레아제가 게놈에 효율적으로 결합하거나 절단하는 것을 방해합니다. 또한, 파지 복제의 빠르고 일시적인 특성은 상동 재조합의 효율성을 더욱 제한할 수 있습니다. 이러한 장벽으로 인해 파지 돌연변이 유발을 위해 DNA 표적 CRISPR-Cas 기술을 적용하는 것이 특히 어렵습니다. 파지 DNA 변형은 시험관 내 및 생체 내 CRISPR-Cas로 파지 DNA 표적화를 손상시키는 것으로 나타났습니다 6,7.

파지의 보호 DNA 변형으로 인한 문제를 해결하기 위해 우리는 TET(ten-eleven translocation) 메틸시토신 디옥시게나제, 특히 NgTET의 활성을 활용하는 게놈 돌연변이 유발 전략을 도입합니다. 진핵생물에서 TET 효소는 반복적인 과정을 통해 메틸화된 시토신의 단계적 산화를 촉매합니다: 메틸시토신(5mdC)은 먼저 하이드록시메틸시토신(5hmdC)으로 전환된 다음 포르밀시토신(5fdC), 마지막으로 카르복시시토신(5cadC)으로 전환됩니다(그림 1).

당사의 파지 돌연변이 유발 접근법에서 NgTET는 보호 DNA 변형의 풍부함을 일시적으로 감소시키는 데 사용되어 Cas 효소와 같은 게놈 편집 도구에 대한 파지 DNA의 접근성을향상시킵니다 9. NgTET는 이종 박테리아 숙주, 특히 대 장균에서 활성 가용성 형태로 성공적으로 발현되었다는 이전 보고로 인해 박테리오파지 게놈을 조절하기 위해 선택되었습니다. NgTET는 파지 감염 동안 활성 상태를 유지해야 하므로 이 특성은 필수적입니다10.

figure-introduction-1
그림 1: TET Dioxygenase1에 의한 5-메틸시토신의 단계적 산화. TET 디옥시게나제는 5-메틸-2'-데옥시시티딘(5mdC)의 연속적인 산화를 촉매하여 5hmdC, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘(5fdC), 궁극적으로 5-카르복실-2'-데옥시시티딘(5cadC)으로 산화합니다. 최종 산물인 5cadC는 자발적으로 또는 효소적으로 변형되지 않은 시토신(dC)으로 되돌아가 동적 후생유전학적 조절에 기여합니다. 이 다단계 과정은 진핵생물에서 활성 DNA 메틸화의 핵심입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

메틸시토신과 하이드록시메틸시토신은 글리코실화와 같은 부피가 큰 보호 구조를 포함하여 파지 DNA 과변형의 일반적인 전구체이기 때문에 TET 디옥시게나제의 산화 활성을 이용하여 이러한 DNA 과변형의 형성을 방지할 수 있습니다9. 이 TET 기반 게놈 돌연변이 유발 접근법에서는 대장균에서 NgTET를 이종적으로 재조합하여 감염 시 파지 게놈의 하이드록시메틸화 시토신을 산화시켜 부피가 큰 글리코실화의 형성을 방지합니다. 이러한 부피가 큰 DNA 변형의 풍부함을 줄임으로써 우리의 접근 방식은 CRISPR-Cas 뉴클레아제에 대한 파지 DNA 접근성을 높일 수 있습니다. 이러한 향상된 접근성은 효율적인 표적 인식, 정확한 DNA 절단 및 파지 게놈에 흉터 없는 점 돌연변이를 도입하여 유전자 결실, 리포터 유전자 삽입 또는 PCR 기반 돌연변이 선택을 위한 인공 접합의 통합에 의존하는 전통적인 파지 돌연변이 유발 방법과 구별됩니다 1,11. 이러한 기존 전략은 지금까지 파지 게놈에서 표적 돌연변이 유발을 위해 사용할 수 있는 유일한 도구였으므로 여기에 제시된 방법의 중요한 기초를 나타냅니다. 그러나 단일 파지 단백질은 여러 기능을 가질 수 있습니다. 관심 단백질을 암호화하는 전체 유전자의 결실은 모든 관련 기능을 방해합니다. 대조적으로, 점 돌연변이의 표적 도입은 특정 기능의 선택적 비활성화를 허용하여 그 역할에 대한 자세한 분석을 가능하게 합니다. 현재까지 많은 파지 단백질의 기능은 거의 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다. 따라서 주어진 유전자와 관련된 추가 활동을 간과할 수 있습니다. 따라서 전체 단백질에 최소한의 변화를 일으키면서 단일 기능만 제거하는 것을 목표로 하는 최소한의 접근법이 바람직하다12,13. 여기에 설명된 방법은 전체 게놈 조직이나 기능을 방해하지 않고 정확한 유전자 변형을 가능하게 합니다. 이전 파지 돌연변이 유발 방법의 또 다른 주요 과제는 일반적으로 약 0.1%의 돌연변이율을 산출하는 낮은 효율성이었습니다1,11. 이 기술을 통해 우리는 단일 코돈 변화를 도입할 수 있는 최초의 돌연변이 유발 전략을 제시하여 표적 효율성의 눈에 띄는 7배 증가를 달성합니다. ONT 기반 고처리량 스크리닝 방법과 결합하면 점 돌연변이 검출이 단순화되어 하나의 돌연변이를 분리하기 위해 대규모 파지 집단을 스크리닝할 필요가 없습니다. 여기에 설명된 TET 기반 돌연변이 유발 전략은 현장의 오랜 한계를 해결하고 보다 신뢰할 수 있는 게놈 편집을 가능하게 합니다14.

전반적으로 이 방법은 박테리오파지 감염 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 적용될 뿐만 아니라 합성 생물학에도 상당한 가능성을 가지고 있습니다. 정확하고 효율적인 파지 게놈 엔지니어링을 가능하게 함으로써 파지를 특정 응용 분야에 맞게 조정할 수 있는 길을 열어 생명공학 및 의료 응용 분야의 잠재력을 향상시킵니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

NgTET 처리된 T4 파지의 생성을 보여주는 개략도가 그림 2에 나와 있습니다.

figure-protocol-1
그림 2: T4 파지 돌연변이 유발 및 돌연변이 스크리닝을 위해 확립된 워크플로우의 개략적 개요. 워크플로에는 LC-MS 분석 또는 CRISPR-Cas 절단 분석을 통해 검증할 수 있는 NgTET를 사용한 저변형 T4 파지 생성이 포함됩니다. 그 후, 관심 돌연변이는 CRISPR-Cas 매개 부위 지향적 돌연변이 유발을 통해 파지 게놈에 도입되고 역선택에 의해 식별됩니다. 그런 다음 Nanopore 시퀀싱을 사용하여 원하는 돌연변이의 존재를 확인할 수 있습니다. 검증 후, 돌연변이 파지는 DNA 과변형을 복원하기 위해 증식될 수 있습니다. 이를 통해 용해 분석 및 버스트 크기 측정을 통한 감염 표현형 분석을 포함하여 다운스트림 응용 분야에서 엔지니어링된 파지를 사용할 수 있습니다. 그림의 각 단계에는 프로토콜 단계를 그림의 각 부분과 쉽게 연결할 수 있도록 괄호 안에 해당 프로토콜 번호가 주석이 달려 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. NgTET 전처리를 이용한 파지 DNA 변형 감소(~2일)

참고: 이 단계는 파지 DNA 변형의 풍부함을 줄임으로써 돌연변이 유발 중에 효율적인 Cas 뉴클레아제 표적화를 가능하게 하는 데 중요합니다.

  1. 글리세롤 스톡에서 30μg/mL 카나마이신이 보충된 LB 배지 10mL로 물질을 옮겨 pET28a_NgTET로 형질전환된 대 장균 BL21(DE3) 균주를 접종합니다. 160rpm에서 흔들면서 37°C에서 밤새 배양합니다.
  2. 다음날, 하룻밤 배양을 사용하여 30μg/mL 카나마이신을 함유하는 LB 배지 50mL에서 0.1의 초기 OD600 에 주 배양물을 접종합니다. 0.4의 OD600 에 도달하면 50μM IPTG로 배양을 유도합니다.
  3. 배양액을 37°C에서 160rpm으로 흔들면서 OD600 0.8에 도달할 때까지 성장시킵니다.
  4. 0.1의 감염 다중도(MOI)에서 관심 파지로 배양물을 감염시키고 120rpm에서 흔들면서 실온에서 4시간 동안 배양합니다.
  5. 4°C에서 20분 동안 4000× g 에서 원심분리하여 세포를 수확합니다.
  6. 상청액을 0.45μm 필터에 통과시켜 저변형 DNA를 가진 NgTET 처리 파지를 얻습니다. 나중에 사용할 수 있도록 여과된 파지를 4°C에서 보관합니다.
    참고: (일시 중지 지점) 여과된 파지는 4°C에서 몇 달 동안 안정적이며 유리병의 LB 배지에 보관됩니다.

2. 검증

참고: 이 단계의 목적은 파지 DNA 변형의 감소된 풍부함을 실험적으로 검증하는 것입니다.

  1. LC-MS를 통한 치료 검증(~ 2일)
    1. 자당 구배를 통한 파지 정제
      1. 용해물에서 잔류 핵산을 제거하려면 500 μL의 파지 현탁액(>10 10 PFU/mL)을 20 U의 DNase I 및 2 μL의 RNase A/T1 혼합물(4 μg의 RNase A, 10 U의 RNase T1)으로 처리합니다.
      2. 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
      3. TM 완충액(50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, pH 7.5)에서 0-45% 자당 구배를 준비합니다. 그라디언트 믹서를 사용하거나 수동으로 그라디언트를 준비합니다.
        참고: 수동 준비의 경우 먼저 5mL의 TM 완충액을 그래디언트 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 끝이 뭉툭한 캐뉼라를 사용하여 튜브 바닥에서 45% 자당 용액 5mL를 천천히 피펫팅하여 0% 용액이 서서히 상승하도록 합니다.
      4. 그래디언트 위에 처리된 파지 용액 500μL를 로드합니다.
      5. 70,000 × g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
      6. 바닥에서 원심분리 튜브에 불을 붙입니다. 이렇게 하면 그라디언트에서 탁한 띠로 나타나는 파지를 시각화할 수 있습니다. 무딘 캐뉼라를 사용하여 파지 함유 분획을 조심스럽게 제거합니다.
      7. 추출된 파지 분획을 새로운 초원심분리 튜브로 옮깁니다.
      8. 얼음처럼 차가운 TM 완충액 30mL를 첨가하고 100,000 × g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리합니다.
      9. 상청액을 버리고 펠릿을 500μL의 TM 완충액에 재현탁합니다.
      10. 재현탁된 파지를 유리 바이알에 4°C에서 밤새 보관합니다.
    2. 파지 DNA 분리
      1. 재현탁된 파지에 1μg의 Proteinase K를 첨가합니다.
      2. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
      3. 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(P/C/I) 혼합물 1부피를 첨가합니다. 반전으로 혼합합니다. 4°C에서 1분 동안 15,000 x g 에서 원심분리하여 상을 분리합니다. 수성을 새 반응 튜브로 옮깁니다. 추출을 세 번 반복합니다.
        주의: 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(P/C/I)은 독성이 강하고 부식성이 있으며 휘발성이 높습니다. 실험실 가운, 보안경, 이중 니트릴 장갑 등 적절한 보호 장비를 착용한 상태에서 항상 흄 후드 내부에서 취급하십시오. 피부와 눈에 닿지 않도록 하고 단단히 밀봉된 용기에 담아 지정된 화학 캐비닛에 보관하십시오. 승인된 유해 폐기물 채널을 통해 폐기물을 처리하십시오. 접촉한 경우 즉시 물로 헹구고 의사의 진료를 받으십시오.
      4. 잔류 페놀을 제거하려면 1 부피의 클로로포름으로 클로로포름 역추출을 3회 수행합니다.
      5. -20°C에서 0.1부피의 3M NaOAc(pH 5.5)와 2.5부피의 에탄올로 하룻밤 동안 DNA를 침전시킵니다.
      6. 다음날, 4°C에서 1시간 동안 15,000 × g 에서 원심분리하여 DNA를 펠릿화합니다.
      7. DNA 펠릿을 200μL의 70% 에탄올로 두 번 세척하고 부드럽게 흔든 후 15,000 × g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
      8. 정제된 DNA를 초순수에 재현탁합니다.
      9. 추가 사용할 때까지 DNA를 -20°C에서 보관하십시오.
        참고: (일시 중지 지점) 침전된 DNA는 -20°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
    3. LC-MS 분석을 위한 파지 DNA 준비
      1. 뉴클레오사이드 분해 믹스를 사용하여 정제된 DNA를 단일 뉴클레오시드로 분해합니다.
      2. LC-MS를 통한 DNA 조성 분석.
        참고: 이 단계를 통해 NgTET 치료의 효과를 검증할 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 특정 장비 및 컬럼에 맞게 조정되지만 사용 가능한 리소스 및 조건에 따라 조정할 수 있습니다.
      3. 정제된 파지에서 분리된 분해된 DNA를 사용합니다(단계 2.1.10).
      4. 측정을 위해 dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC와 같은 상업적으로 이용 가능한 표준을 포함합니다. 가능한 경우 파지 DNA에 존재하는 시토신 과변형의 표준을 포함합니다.
      5. C18 컬럼(150 × 2.1 mm, 100 Å, 3 μm) 및 20 × 2.1 mm 가드 컬럼이 장착된 HPLC 시스템을 사용하십시오.
      6. 컬럼 온도를 40°C로 설정하고 용리액 유속을 0.2mL/min으로 설정합니다.
      7. 다음과 같이 용리액을 준비합니다.
        용리액 A: 물(pH 4.5)에 10mM 암모늄 아세테이트.
        용리액 B: 메탄올 함량 0.1% 포름산.
        주의: 메탄올의 0.1% 포름산은 가연성이며 피부, 눈 및 호흡기를 자극할 수 있습니다. 항상 환기가 잘 되는 곳이나 흄 후드에서 사용하십시오. 실험실 가운, 보안경, 니트릴 장갑 등 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 열, 스파크 및 화염에서 멀리 보관하십시오. 가연성 보관 캐비닛에 보관하십시오. 승인된 유해 폐기물 프로토콜을 통해 폐기하십시오.
      8. 다음 이동상 프로파일을 적용합니다: 0-1분: 5% B에서 일정함; 1-5분: 5%에서 90% B까지의 기울기; 5-7분: 90% B에서 일정함; 7-7.1분: 90%에서 5% B까지의 기울기; 7.1-12분: 5% B에서 일정합니다.
      9. 다음 조건에서 고온 전기분무 이온화(H-ESI) 소스와 함께 음극 및 양극 이온화 모드(별도 주입)에서 질량 분석기를 사용하십시오.
        H-ESI 스프레이 전압: 3400 V (+), 2400 V (-), 시스 가스: 35 임의 단위, 보조 가스: 7 임의 단위, 스윕 가스: 0 임의 단위, 이온 전달 튜브 온도: 300 °C, 기화기 온도: 275 °C, 검출 모드: Orbitrap 질량 분석기를 사용한 전체 스캔, 질량 분해능: 120,000, 질량 범위: 200-450 (m/z).
      10. Tracefinder 소프트웨어를 사용하여 [MH]- (dA, dT, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC) 및 [M+H]+ (5ghmdC) 형태의 이온 크로마토그램을 추출합니다.
      11. dG를 시료별 내부 표준으로 사용하여 각 신호의 피크 면적을 시료 내의 dG 피크 면적으로 정규화하여 각 변형의 상대적 풍부도를 계산합니다.
  2. CRISPR-Cas 절단 분석을 통한 검증(~2.5일)
    참고: 이 단계를 통해 NgTET 치료의 성공 여부와 CRISPR-Cas 절단에 미치는 영향에 대한 표현형 평가가 가능합니다. NgTET가 활성화되면 보호 DNA 변형을 제거하면 게놈이 CRISPR-Cas12 또는 9 절단에 취약해지기 때문에 처리된 파지 DNA에서 플라크가 형성되지 않거나 파지 역가가 감소해야 합니다. 대조적으로, 파지 DNA를 처리하지 않으면 형성된 플라크의 수는 파지의 역가에 해당하며, 이는 과도하게 변형된 T4 파지 게놈이 CRISPR-Cas12 또는 9 절단에 내성이 있음을 나타냅니다.
    1. pET28a_NgTET 플라스미드와 Cas12 또는 Cas9 발현 플라스미드(예: 스페이서가 없는 DS-spCas 또는 pCpf1)로 형질전환된 하룻밤 배양에서 대장균 BL21(DE3)을 접종합니다. 추가 정보가 있는 모든 플라스미드는 표 1에서 찾을 수 있습니다.
      1. 적절한 항생제가 보충된 LB 배지에서 3°C에서 0.1의 OD600 부터 시작하여 흔들면서 세포를 성장시킵니다. 배양이 약 0.4의 OD600 에 도달하면 0.05mM IPTG를 첨가하여 NgTET 발현을 유도하고 3°C에서 추가로 2시간 동안 배양합니다.
      2. 대조군으로서, NgTET 과발현 유무에 따른 대 장균 BL21(DE3) 균주를 비교합니다. NgTET 활성이 없는 경우 더 많은 수의 플라크 형성 단위가 예상되며, 이는 파지 DNA에 당화된 5ghmdC의 존재로 인해 CRISPR-Cas 효율성이 감소했음을 나타냅니다.
    2. 대 장균 배양액 300μL를 멸균 튜브로 옮깁니다.
    3. MOI 0.01의 T4 WT 또는 NgTET 처리 파지로 배양물을 감염시킵니다. 이 실험에서는 박테리아가 한 번에 하나의 파지에만 감염되도록 낮은 MOI를 적용합니다. 이는 CRISPR-Cas 절단 스크리닝의 효율성을 극대화하고 결과 해석을 단순화합니다. 파지가 고르게 분포되도록 부드럽게 혼합하십시오.
    4. 박테리아-파지 현탁액을 37°C에서 7분 동안 배양합니다.
    5. 박테리아-파지 혼합물을 항생제가 보충된 LB 연질 한천 4mL(0.75%)에 첨가합니다. 거품이 생기지 않도록 철저하게도 부드럽게 섞으십시오.
    6. 부드러운 한천 혼합물을 예열된 LB 한천 플레이트에 붓습니다.
    7. 플레이트가 실온에서 잠시 응고되도록 합니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
    8. 다음날 결과 플라크를 세어 플라크 형성 단위(PFU)를 결정합니다.

3. CRISPR-Cas 돌연변이 유발(~1주)

참고: CRISPR-Cas 돌연변이 유발은 파지 게놈 내의 특정 부위가 파지 감염 중에 Cas 뉴클레아제의 표적이 되어 이중 가닥 절단을 초래한다는 원리를 기반으로 합니다. 이 절단은 돌연변이 유발 중에 감염된 숙주 균주에 존재하는 두 번째 플라스미드에 제공되는 기증자 DNA를 사용한 상동 재조합을 통해 복구됩니다. 기증자 DNA를 포함하는 플라스미드는 또한 NgTET를 암호화하는데, 이는 앞서 설명한 바와 같이 변형된 시토신의 풍부함을 감소시켜 Cas 뉴클레아제에 대한 파지 DNA의 접근성을 유지하는 데 필수적입니다. 이 단계에서, 표적 돌연변이는 대 장균15의 감염 시 NgTET 처리된 T4 파지의 게놈에 도입됩니다. T4 게놈에서 일관되게 낮은 수준의 DNA 변형을 보장하기 위해 NgTET 디옥시게나제는 돌연변이 유발 과정 전반에 걸쳐 50μM IPTG(단계 1.2와 유사)를 첨가하여 발현됩니다.

  1. 골든 게이트 클로닝을 통한 pET28a_NgTET_donor DNA 플라스미드 생성15
    1. 기증자 DNA의 생성을 위해, 원하는 서열을 전체 유전자로 주문하거나 게놈(예를 들어, 파지 게놈)으로부터 증폭하고, 원하는 돌연변이를 도입한다.
      참고: 기증자 DNA 설계의 경우, 표적 부위 옆에 있는 상동 영역을 포함합니다(점 돌연변이의 경우 양쪽에 ≈200bp, 더 큰 삽입물의 경우 더 긴 영역). 선형 기증자 단편은 절단 시 플라스미드와 호환되는 돌출부를 생성하는 BsaI 인식 부위를 전달해야 합니다. 구성 설계를 확인하기 위해 인실리코 복제를 권장합니다. 대표적인 결과에서 기증자 DNA에 대한 모든 중요한 구성 요소가 예에 설명되어 있습니다.
    2. Golden Gate 어셈블리를 사용하여 NgTET 코딩 서열 및 터미pET28a_NgTET네이터의 다운스트림에 NgTET 코딩 서열 및 터미네이터를 도입합니다.
      1. 70 fmol의 pET28a_NgTET 플라스미드, 140 fmol의 기증자 DNA 삽입물, 1 μL의 BsaI(20 U/μL), 5 U의 T4 DNA 리가아제 및 2 μL의 10× 리가아제 완충액을 결합하여 조립 반응을 준비하고 뉴클레아제가 없는 물을 20 μL의 최종 부피에 첨가합니다.
      2. PCR 사이클러에서 1) 제한, 37°C에서 1.5분, 2) 결찰, 16°C에서 3분, 3) 최종 제한, 37°C에서 5분, 4) 변성, 60°C에서 10분 동안 PCR 사이클러에서 25사이클로 반응을 실행합니다.
    3. 반응 혼합물 6μL(단계 3.1.2)를 화학적으로 유능한 대 장균 DH5α 100μL에 첨가하고, 얼음 위에서 10분 동안 배양하고, 42°C에서 45초 동안 열충격을 가한다. 즉시 세포를 얼음 위에 1분 동안 놓은 다음 750μL LB 배지를 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 흔들면서 500rpm으로 회복합니다. 카나마이신(30μg/mL)을 함유한 LB 한천에 플레이트를 넣고 37°C에서 밤새 배양합니다.
    4. 단일 콜로니를 선택하고 카나마이신(30μg/mL)이 보충된 LB 배지 20mL를 접종합니다. 160rpm에서 흔들면서 37°C에서 밤새 배양합니다.
    5. 하룻밤 배양 5mL에서 세포를 펠릿화하고 표준 플라스미드 추출 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 플라스미드를 40μL의 뉴클레아제가 없는 물에 용리합니다.
    6. Sanger 시퀀싱을 사용하여 플라스미드의 삽입 부위를 시퀀싱하여 올바른 클로닝을 확인합니다.
  2. 스페이서 함유 CRISPR-Cas 플라스미드 구축(모델로서의 pCpf1-sp)15
    참고: 이 장에서 설명하는 플라스미드는 파지 게놈에 부위 특이적 이중 가닥 절단을 도입하여 돌연변이 유발의 첫 번째 단계를 가능하게 합니다. 절차는 여기에서 CRISPR-Cas12 시스템(pCpfl-sp 플라스미드)을 사용하여 시연되지만, CRISPR-Cas9(DS-spCas 플라스미드)와 같은 대체 뉴클레아제도 사용할 수 있습니다15 .
    1. 돌연변이 유발 부위를 표적으로 하는 20-nt 스페이서를 설계합니다(PAM: TTTV). 생물정보학 도구를 사용하여 적합한 프로토스페이서와 해당 스페이서를 식별하고 설계합니다.
    2. 2개의 5'-인산화 올리고뉴클레오티드를 합성합니다. 각각이 원하는 스페이서 서열의 10 nt(함께 전체 20 nt 스페이서 형성)와 pCpf1-sp 플라스미드 내의 삽입 부위에 상보적인 추가 10 nt 영역을 운반하는지 확인하십시오.
    3. 2단계의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 통해 설계된 CRISPR-Cas 스페이서를 pCpf1-sp 플라스미드에 삽입합니다. 다음과 같이 반응을 설정합니다(최종 부피 50μL): 5μL 10× GC 완충액, 1μL 10mM dNTP, 1μL 순방향 프라이머(10μM), 1μL 역방향 프라이머(10μM), 2.5μL DMSO, 2fmol에 해당하는 플라스미드 템플릿, 1μL Phusion DNA 중합효소(2U/μL) 및 뉴클레아제가 없는 물을 50μL까지 설정합니다.
    4. 반응 튜브를 열순환기에 넣고 다음 프로그램을 실행합니다: 98°C에서 30초 동안 초기 변성; 98°C에서 10초 동안 25사이클, 적절한 온도(X °C)에서 30초 동안 어닐링, 72°C에서 6분 동안 연장; 이어서 72°C에서 10분 동안 최종 연장합니다. 추가 처리가 될 때까지 샘플을 4°C에서 유지합니다.
    5. PCR 반응 5μL를 DNA 로딩 완충액(10×)과 혼합하고 1% 아가로스 겔에 로드합니다. 겔을 130V에서 20분 동안 실행하고 UV 트랜스 조명을 사용하여 DNA 밴드를 시각화합니다. 증폭이 성공하면 적절한 클린업 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하고 뉴클레아제가 없는 물 20μL에 용리합니다.
    6. 총 반응 부피 15μL에서 1× T4 DNA 리가아제 완충액 및 60 U T4 DNA 리가아제와 혼합된 증폭된 생성물 100ng를 사용하여 결찰에 의해 플라스미드를 순환화합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 3.1.3단계에 설명된 대로 화학적으로 유능한 대장균 100μL를 결찰 생성물로 형질전환합니다. 50μg/mL 스트렙토마이신을 함유한 LB 한천에 세포를 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
    7. 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 50μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 LB 배지 20mL에 접종합니다. 160rpm에서 흔들면서 37°C에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양 5mL에서 원심분리로 세포를 수확하고 선택한 플라스미드 추출 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 플라스미드를 40μL의 뉴클레아제가 없는 물에 용리합니다.
    8. Sanger 시퀀싱을 사용하여 삽입 부위에서 플라스미드를 시퀀싱하여 성공적인 클로닝을 확인합니다.
  3. 파지 돌연변이 유발
    1. 대 장균 BL21(DE3) 세포를 두 가지 플라스미드로 형질전환합니다: pET28a_NgTET_donor-DNA 및 pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9) 스페이서(3.1단계 및 3.2단계에서 생성됨). 각 플라스미드 1μL를 화학적으로 유능한 대 장균 BL21(DE3) 100μL와 혼합합니다. 3.1.3단계에 설명된 프로토콜을 따릅니다. 형질전환된 세포를 50μg/mL 스트렙토마이신 및 30μg/mL 카나마이신을 함유한 한천에 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
    2. 형질전환된 대장 균 균주(대장 균 BL21(DE3) pET28a_NgTET_donor-DNA 및 pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer)를 30μg/mL 카나마이신 및 50μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 LB 배지 10mL에 접종합니다. 160rpm에서 흔들면서 37°C에서 밤새 배양합니다.
    3. 다음날, 30μg/mL 카나마이신 및 50μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 LB 배지 50mL에서 하룻밤 배양을 0.1의 초기 OD600 으로 희석합니다.
    4. OD600 이 0.8에 도달할 때까지 160rpm에서 흔들면서 37°C에서 배양액을 성장시킵니다. 온도를 실온(RT)으로 낮추고 교반 속도를 130rpm으로 줄입니다.
      1. 파지 흡착 및 DNA 주입을 향상시키려면 MgCl2 및 CaCl2 를 각각 1mM의 최종 농도까지 첨가하십시오.
      2. NgTET-전처리된 T4 파지로 배양물을 감염시키고, 음성 대조군으로서 MOI 0.1에서 NgTET-처리되지 않은 T4 파지로 감염시킵니다. RT에서 4시간 동안 배양을 계속합니다.
    5. 배양 후, 배양물을 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 4°C에서 4000× g 에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 0.45μm 필터를 통해 상청액을 여과하여 잔류 박테리아 세포를 제거합니다. 플라크 분석(단계 2.2에 설명됨)에 여과된 상청액을 사용하여 파지 농도를 결정하거나 반대 선택을 수행합니다.

4. 돌연변이 식별

참고: 역선택의 목적은 돌연변이 유발 후 집단에 남아 있는 야생형 파지의 비율을 줄이는 것입니다. 이를 위해, 돌연변이 유발 단계(단계 3.3)에서 얻은 파지는 다른 플라스미드 pBA560(표 1의 추가 정보)에 의해 암호화되는 동일한 CRISPR-Cas13 시스템을 운반하는 대장균을 감염시키는 데 사용되며, 이는 돌연변이 유발 중에 적용된 동일한 스페이서 서열에 의해 암호화됩니다. 이 설정에서 Cas 뉴클레아제는 야생형 파지 DNA를 선택적으로 인식하고 절단하는 반면, 원하는 돌연변이를 운반하는 파지는 영향을 받지 않습니다. 이 선택적 압력은 야생형 복제를 억제하고 돌연변이 파지의 개체군을 풍부하게 합니다14.

  1. Cas13을 사용한 반대 선택
    1. 대 장균 Cas13a_spacer(플라스미드 pBA560)를 반대 선택을 위해 파지로 감염시킵니다. 이 단계는 의도한 돌연변이를 겪지 않은 파지 RNA를 분해하여 반대 선택을 용이하게 합니다.
    2. 돌연변이 유발 중에 사용된 것과 동일한 조건에서 반대 선택을 수행합니다(3.3.1-3.3.5단계 참조). 플라크 감소가 스페이서 특이적임을 확인하기 위해 비표적 Cas13a 스페이서를 발현하는 대장균 을 음성 대조군으로 사용합니다.
    3. 배양 후, 0.45μm 필터를 통해 반대 선택된 파지를 포함하는 상청액을 여과하여 박테리아 파편을 제거합니다.
      참고: (일시 중지 지점) 여과된 파지는 4°C에서 몇 달 동안 안정적이며 유리병의 LB 배지에 보관됩니다.
    4. 대 장 균 B 균주에 대한 플라크 분석을 위해 반대 선택 및 필터링된 파지를 사용하여 다운스트림 검증을 위해 개별 플라크를 분리합니다.
  2. 차세대 염기서열 분석 (~ 1주)
    참고: 고도로 다중화된 시퀀싱 접근법의 방법은 긴 판독 차세대 시퀀싱에 적합한 다중화된 앰플리콘 DNA를 생성하기 위한 2단계 PCR 프로세스를 포함합니다16.
    1. 2.2단계에서 설명한 대로 파지를 도금하여 돌연변이 유발에서 파지를 분리합니다. NgTET 발현의 존재 여부 모두에서 수행된 돌연변이 유발에서 얻은 파지를 사용하여 적절한 대조군을 포함합니다. 대조군으로서, NgTET 없이 CRISPR-Cas9 및 Cas12 표적화는 점 돌연변이의 도입을 초래해서는 안 됩니다. 대조적으로, NgTET의 공동 발현은 성공적인 편집을 가능하게 하여 돌연변이 유발 효율을 높일 것으로 예상됩니다.
    2. 단일 파지를 분리하려면 플레이트에서 개별 플라크를 선택하고 100μL의 Pi-Mg 완충액(26mM Na2PHO4, 68 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, pH 7.5) 및 1 μL의 CHCl3.
      주의: 클로로포름은 독성이 있고 휘발성이 있으며 소량으로도 발암 물질이 의심됩니다. 연기 후드에서만 취급하고 실험실 가운, 보안경, 니트릴 장갑을 포함한 완전한 보호 장비를 착용하십시오. 흡입 및 피부 접촉을 피하십시오. 통풍이 잘되는 가연성 화학 캐비닛에 단단히 밀봉된 용기에 보관하십시오. 유해 폐기물 수집을 통해 클로로포름 폐기물을 처리하십시오.
    3. Pi-Mg 완충액에 분리된 파지 T4 1μL를 스크리닝을 위한 주형으로 사용합니다.
    4. 0.125μM의 각 프라이머(삽입 위치 주변)와 1x 고정밀 중합효소 마스터 믹스로 반응 혼합물을 준비하고 증폭 반응의 총 부피를 10μL로 조정합니다. 30개의 증폭 주기로 PCR 반응을 실행합니다.
    5. 두 번째 PCR을 수행하여 바코드를 부착합니다. 따라서 첫 번째 PCR에서 생성물의 1:10 희석액 1μL를 템플릿으로 사용합니다.
    6. 0.3μM 바코드 프라이머와 충실도 핫스타트 중합효소 혼합물을 총 부피 7μL로 반응 혼합물을 준비합니다. 20회 증폭 주기로 PCR을 수행합니다.
      참고: (일시 중지 지점) PCR-제품은 -20°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
    7. 모든 바코드 PCR 산물을 풀링하고 차세대 염기서열 분석 라이브러리 준비를 위한 표준 프로토콜에 따라 마그네틱 비드 기반 클린업을 사용하여 정제합니다.
    8. 마그네틱 비드를 사용하여 DNA를 포획하고 80% 에탄올로 두 번 세척한 다음 용출 완충액 100μL(5mM Tris-HCl, pH 8.5)에 용리합니다.
    9. 분광 광도법 및 형광법을 사용하여 DNA 농도를 측정하고 적절하게 광범위 또는 고감도 분석을 적용합니다.
      참고: (일시 중지 지점) DNA는 -20°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
    10. 제조업체의 지침에 따라 1μg의 입력 DNA부터 시작하여 결찰 기반 프로토콜을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 생성합니다.

5. DNA 변형 및 증명의 돌연변이 번식 복구

참고: 원하는 파지 돌연변이체가 확인되면 야생형 대장균 에서 증식하여 WT 파지와 유사한 DNA 변형 수준을 복원합니다. 이를 통해 돌연변이 파지는 도입된 돌연변이를 제외하고는 타협 없이 후속 생물학적 실험에 활용될 수 있습니다.

  1. LB 배지에서 대장균 B 균주의 10mL 배양액을 준비하고 160rpm에서 흔들면서 37°C에서 밤새 배양합니다.
  2. 다음날, 신선한 50mL LB 배지에 하룻밤 배양액을 접종하여 초기 OD600 0.1을 달성합니다.
  3. 배양액이 OD600 0.8에 도달할 때까지 160rpm에서 흔들면서 37°C에서 성장하도록 합니다.
  4. 50μL의 돌연변이 파지 스톡(4.2.2)을 배양액에 첨가합니다. CHCl3이 전이되지 않도록 상을 조심스럽게 제거하십시오.
  5. 감염된 배양액을 실온에서 밤새 120rpm으로 부드럽게 흔들면서 배양합니다.
  6. 배양 후 배양액을 4000× g 에서 원심분리하여 박테리아 세포를 제거합니다. 0.45μm 필터를 통해 상청액을 여과하여 파지를 수집합니다.
  7. 여과된 돌연변이 파지를 유리 용기에 옮기고 추가 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
    참고: (일시 중지 지점) 여과된 파지는 4°C에서 몇 달 동안 안정적이며 유리병의 LB 배지에 보관됩니다.
  8. DNA 변형, 특히 당화된 시토신의 재생에 대한 선택적 검증으로 2.1단계에 설명된 대로 LC-MS 분석을 수행합니다.
    1. 이를 위해, 2.1.1단계에서 설명한 대로 파지 자손으로부터 회수된 파지 DNA를 정제하고, 2.1.2단계와 같이 분리한 후, 2.1.3단계에 설명된 대로 LC-MS 분석을 준비한다.
    2. 2.1.3단계에 설명된 대로 dG를 시료별 내부 표준으로 사용하여 각 신호의 피크 면적을 시료 내의 dG 피크 면적으로 정규화하여 이온 크로마토그램을 분석하고 각 변형의 상대적 풍부도를 계산합니다.
      참고: 5ghmdC의 풍부도를 직접 검증하고 비교하기 위해 T4 야생형 파지, NgTET로 처리된 T4 파지 및 비활성 NgTET D234A 변이체로 처리된 T4 파지를 대조군으로 포함하는 것이 권장됩니다10.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

구배에서 파지 밴드의 식별.
그래디언트에서 파지 밴드의 가시성은 그래디언트에 로드된 초기 샘플의 파지 농도에 따라 달라집니다. 파지가 충분히 농축되면(~>1 × 1011 PFU/mL), 광원으로 바닥에서 기울기를 비추면 밴드를 명확하게 볼 수 있습니다( 그림 3 참조).

그러나 파지 농도가 낮으면 밴드가 쉽게 보이지 않을 수 있습니다. 이 경우 파지를 검출할 수 있는 어둠 속에서 아래에서 튜브를 비추어 시각화 시도를 반복하는 것이 좋습니다.

파지 밴드가 여전히 보이지 않으면 무딘 캐뉼라를 사용하여 상단에서 구배 분획을 조심스럽게 제거하고 분획당 1.5mL를 수집합니다. 그런 다음 이러한 분획을 플라크 분석을 통해 분석하여 파지 농도를 결정할 수 있습니다. 파지 농도가 가장 높은 두 분획은 후속 DNA 추출을 위해 결합...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 연구는 단일 뉴클레오티드 변화를 포함하여 박테리오파지 게놈에 정확한 점 돌연변이를 도입하기 위한 강력하고 적응 가능한 전략을 제시합니다. 워크플로의 핵심 요소는 각 단계에서 엄격한 검증 단계를 통합하는 것이며, 이는 게놈 편집의 정확성과 효율성을 모두 보장하는 데 필수적입니다. 이는 워크플로의 다단계 특성과 파지와 박테리아 숙주 간의 동적 상호 작용을 고려할 때 특히 중요하며, 이는 파지 돌연변이 유발의 성공에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 수많은 변수를 도입합니다. 이러한 요인에는 무엇보다도 I) 표적 DNA 영역의 접근성, II) CRISPR 관련 뉴클레아제의 활성, III) 대 장균 숙주 균주에서 CRISPR-Cas 매개 돌연변이 유발 동안 기증자 DNA의 안정성, IV) 자연 선택 또는 진화로 인한 원하는 돌연변이의 손실, 및 V) 짧은 파지 감염 주기에 의해 부과되는 시간적 제약. 이러한 매개변수는 궁극적으로 설명된 게놈 편집 접근법의 전반...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

KH와 NP는 "파지 공학"에 대한 유럽 특허 출원, 유럽 특허 출원 번호 23 175 257.7을 제출했습니다. 다른 저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 프로젝트는 독일 연구 위원회(DFG; 막스 플랑크 학회의 SPP 2330 프로젝트 번호 464500427, RTG 2355 프로젝트 11 및 RTG 2937(프로젝트 번호 505997786)은 K.H.에 대한 막스 플랑크 연구 그룹 리더 자금 지원).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5mL 반응 튜브사르슈테트72.690.001
15 mL 카노셜 튜브사르슈테트62.554.502
15 mL 개방형 얇은 벽 폴리프로필렌 튜브Beckman Coulter 생명 과학36170616 mm x 95 mm (초원심분리용)
50mL 표준 튜브사르슈테트62.547.254
5x GC 버퍼써모 피셔 사이언티픽 F519엘
6x TriTrack DNA 로딩 염료 써모 피셔 사이언티픽 R1161
아가로스메리디안 바이오사이언스바이오-41025분자 등급
Avanti J-30I 원심분리기Beckman Coulter 생명 과학카탈로그 없음  수세리엔-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
붕산 머 크10043-35-3
BsaI-HF v2NEBR3733S
칼슘염소 헥사히드랏아크로스 오가닉스7774-34-797 %, 엑스트라 퓨어 
세포 밀도계하버드 바이오크롬 80211630
케미독 MP 바이오라드12003154
클로로포름VWR650498
큐 벳사르슈테트67.742
디메틸 설폭사이드(DMSO) 시그마 알드리치D4540
인산수소이나트륨네오프록스 GmbH7558-79-4제약 등급
일회용 유리 파스퇴르 피펫VWR612-1702230 밀리미터
DNase I 로슈471672800110 U/&마이크로; L
dNTP 혼합물(각 dNTP 10mM) 시그마-알드리치72004
DS_SPcas_ModA사내 제품.https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_mapsCRISPR-Cas12/ModA sgRNA를 포함하는 플라스미드 구축물
DS-spCas(CRISPR-Cas9 시스템)Addgene 48645 (addgene 액세서리 번호)파지 돌연변이 유발을 위한 스페이서 함유 CRISPR-Cas 플라스미드(CRISPR-Cas9 시스템) 구축을 위한 플라스미드(단계 3.2)
대장균 B 균주는 T4 감염에 사용되었습니다.DSMZ카탈로그 없음  수대장균 (Migula 1895) Castellani 및 Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
대장균 BL21 (DE3) 발현 균주, 유능한 세포인비트로젠C600003발현 균주, 유능한 세포.
대장균 DH5&알파; 복제 균주, 유능 세포인비트로젠18265017복제 균주, 유능한 세포. 
EDTA로스8043.2
에탄올(절대) VWR200-578-6
Flongle 플로우 셀옥스포드 나노포어 기술카탈로그 없음  수R10.4.1. 화학, https://nanoporetech.com/document/flongle
유전자 JET 플라스미드 미니프렙 키트 써모 피셔 사이언티픽 10242490
GeneRuler 1 kb Plus DNA 래더써모 피셔 사이언티픽 에스엠1331
GeneRuler ULR DNA 사다리 써모 피셔 사이언티픽 SM1213
그라디언트 마스터 108바이오콤프카탈로그 없음  수https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Heraeus Pico 17 원심분리기써모 사이언티픽75002410
인포어 HT 인큐베이터 미니트론인포스 AG카탈로그 없음  수https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
이소프로필-&베타;-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)시그마-알드리치367-93-1
카나마이신칼 로스T832.1
LB-한천칼 로스엑스969.1
LB-medium(루리아/밀러) 칼 로스엑스968.1
염화마그네슘 육수화물 시그마-알드리치7791-18-6
황산마그네슘 시그마-알드리치7487-88-9
MinION 장치 Oxfrod 나노포어 기술카탈로그 없음  수https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fwIDTGAATTAGTTTCAGATGA
ACAAGCGGTAATGATAC
CAGCT		ModA E165A에 대한 점 돌연변이 도입 및 골든 게이트 복제를 위한 끈적끈적한 말단 도입을 위한 포워드 프라이머(3.1단계)
ModA E165A_revIDTCATATTACGATAACGA
TGACTATCCGGAAAC		ModA E165A에 대한 점 돌연변이 도입 및 Golden Gate 복제를 위한 끈적끈적한 말단 도입을 위한 역방향 프라이머(3.1단계)
ModA_sgRNA_Cas12_fwIDTTCTTGTTCATCTACAAC
AGTAGAAATTAATTTAAA
GTTCTTAGACCCG		파지 돌연변이 유발 및 역선택을 위한 CRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13 시스템용 스페이서 생성을 위한 포워드 프라이머(단계 3.2 및 단계 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_revIDTAGTAATGATAAAGAACT
TTAAATAATTTCTACTGT
TGTAGATGCTAC		파지 돌연변이 유발 및 반대 선택을 위한 CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 시스템용 스페이서 생성을 위한 역방향 프라이머(3.2단계 및 4.1단계)
NanoDrop ND-1000 분광 광도계 써모 피셔 사이언티픽AZY2019944
NucleoMag 키트 마셰리 나겔참조 번호 744970.50
뉴클레오시드 소화 혼합물 뉴잉글랜드 바이오랩스M0649S
pBA560 (CRISPR-Cas13 시스템)아드진186236(addgene 액세서리 번호)카운터 셀렉션을 위한 CRISPR-Cas13 시스템을 인코딩하는 플라스미드(단계 4.1)
pCpfl-sp 플라스미드(CRISPR-Cas12 시스템)아드진122186
pCpfl-sp 플라스미드(CRISPR-Cas12 시스템)아드진122186(addgene 액세서리 번호)파지 돌연변이 유발을 위한 스페이서 함유 CRISPR-Cas 플라스미드(CRISPR-Cas12 시스템) 구축을 위한 플라스미드(단계 3.2)
PCR 반응 용기사르슈테트72.991.002
펙그린VWR732-3196
pET28a_NgTET 사내 제품.카탈로그 없음  수플라스미드는 요청 시 사용할 수 있으며 플라스미드 맵은 다음 https://zenodo.org/records/10615143  에서 찾을 수 있습니다.
pET28a_NgTET 사내 제품.카탈로그 없음  수Golden Gate Cloning(단계 3.1)을 통한 pET28a_NgTET_donor DNA 구축을 위한 플라스미드, 플라스미드  요청 시 사용할 수 있으며, 플라스미드 맵은 다음 https://zenodo.org/records/10615143  에서 찾을 수 있습니다.
페트리 플레이트사르슈테트82.1473.00192 x 16 mm(캠 포함)
Phusion DNA 중합효소 써모 피셔 사이언티픽 F-530XL2 U/&마이크로; L
인산칼륨시그마 알드리치7778-77-0단염기성
PowerPac 범용 전원 공급 장치바이오 래드1645070
프로테이나제 K 칼 로스 7528.1100 mg/mL
QIAquick PCR 정제 키트 키아겐28506
Quantus 형광계, QuantiFluor dsDNA 시스템프로메가E2670
RNase A/T1 써모 피셔 사이언티픽EN0551 인증RNase A 2mg/mL 5000 U/mL RNase T1  혼합;
DNA 추출을 위한 Roti-Aqua P/C/I 칼 로스엑스985.1
아세트산나트륨 시그마-알드리치127-09-3
염화나트륨 시그마-알드리치7647-14-5
SQK-LSK109 결찰 시퀀싱 키트옥스포드 나노포어 기술카탈로그 없음  수https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
Steritop 필터, 0.22 및 마이크로; M 기공 크기밀리포어S2GPT05RE250mL 및 500mL
스트렙토마이신 50 mg/L칼 로스HP66.1
자당류네오프록스 GmbH57-50-1분자 생물학 
스윙 버킷 알루미늄 로터 Beckman Coulter 생명 과학JS[1]24.15
T4 DNA 리가아제 5 U/µ L써모 피셔 사이언티픽 엘0011
T4 DNA 리가아제 완충액써모 피셔 사이언티픽 B69
시험관, 두꺼운 벽, 테두리가 없는칼 헤흐트 GmbH42775054100mm x 18mm
열 순환기, T100바이오라드1861096
열믹서 편안함 에펜도르프5382000015
트리즈마 베이스시그마 알드리치77-86-1
수욕, VWB2 VWR462-055712L 용량

참고문헌

  1. Pozhydaieva, N., et al. Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications. PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).
  2. Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation. FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).
  3. Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), 205(2018).
  4. Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels. Viruses. 14 (11), 2502(2022).
  5. Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics. Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).
  6. Vlot, M., et al. Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes. Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).
  7. Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9. ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).
  8. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147(2016).
  9. Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation. Science. 328 (5980), 916-919 (2010).
  10. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
  11. Shitrit, D., et al. Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages. ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).
  12. Dedrick, R. M., et al. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).
  13. Marinelli, L. J., et al. BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes. PLoS One. 3 (12), e3957(2008).
  14. Adler, B. A., et al. Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing. Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).
  15. Pozhydaieva, N., Höfer, K. Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis. Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).
  16. Ramírez Rojas, A. A., et al. DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs. ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).
  17. Lagerbäck, P., et al. Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates. Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).
  18. Lagerbäck, P., Carlson, K. Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis. J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).
  19. Shembrey, C., et al. Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision. Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).
  20. Molina Vargas, A. M., et al. New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity. Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).
  21. Shi, P., Wu, X. Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13. RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).
  22. Levin, B. R., et al. The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity. PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).
  23. Hershey, A. D., Chase, M. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).
  24. Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI. J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

NgTETDNAT4

관련 논문