고처리량 형식을 이용한 미생물 2차 대사산물에 대한 잎 반응 평가

요약

이 프로토콜은 동일 시료 내에서 식물 이온 누출, 과산화효소 활성, 칼로스 생성을 평가하는 고처리량 접근법을 설명합니다.

초록

미생물은 식물 감염 시 구조적으로 다양한 2차 대사산물을 분비하며, 일부는 식물 세포에 의해 감지되어 스트레스 반응을 유발합니다. 이 방법에서는 이온 누출, 과산화효소 활성, 칼로스 생성의 유도가 동일한 잎 디스크 샘플에서 측정됩니다. 먼저, 애기장대(Arabidopsis) 또는 보리 잎 원반을 96웰 플레이트에 진공 침투합니다. 4-6시간 후에는 전도도를 측정하고, 24시간 후에 과산화효소 활성과 칼로스 침착을 측정합니다. FLG22 펩타이드는 세 가지 반응을 모두 유도하며, 저렴한 양성 대조군입니다. 서팩틴과 그래밀린 순환 리포펩타이드는 각각 과산화효소 활성과 이온 누출을 유도하는 반면, 식물독성인 T-2 트리코테센은 과산화효소 활성을 억제합니다. 전반적으로 이 접근법은 식물 유전자형 또는 대사산물 처리 간에 다중 비교를 가능하게 합니다. 이 접근법은 화학 유전학이나 생물보호학에 적용되어 스트레스 조절 화합물을 식별하여 추가 연구를 수행할 수 있습니다. 식물 유전학에서는 이 접근법을 유전적 지도 작성을 위한 식물 집단 간 반응을 비교하고 식물-미생물 상호작용에 대한 이해를 높이는 데 활용될 수 있습니다.

서론

식물은 다양한 미생물 분자에 반응하여 세포 스트레스 반응을 활성화하며, 이는 질병 저항성을 형성할 수 있습니다. 박테리아 편모에서 나오는 flg22 펩타이드와 같은 미생물 관련 분자 패턴(MAMPs)은 식물 수용체 단백질에 의해 감지되어 여러 세포 신호 반응을 시작합니다. 여기에는 키나제 연쇄 반응, 활성 산소종(ROS) 생성, 칼슘 스파이킹, 막 탈분극, 칼로스 침착 및 과산화효소 활성 유도와 같은 후기 반응이^{포함됩니다.} 미생물 2차 대사산물(MSM)은 작은(50-1,500달톤) 구조적으로 다양한 분자로, 성장과 발달에는 불필요하지만 미생물의 생존을 촉진합니다. 일부 MSM은 식물에서 세포 스트레스 반응을 유도하지만, 이러한 반응을 시작하는 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다 ^2,3. 식물이 MSM을 인식하는 제안된 메커니즘으로는 기계감각, 산화환원 유도 단백질 변형, 지질 기반 신호 전달 등이 있습니다 ^4,5. 경우에 따라 MSM은 농도에 따라 스트레스 반응을 유발하거나 세포 손상을 일으킬 수 있습니다. 예를 들어, T-2 독소는 1 μM에서 칼로스와 ROS 생성을 유도하고 10 μM에서 세포 사멸을 일으키며, 일반적으로 식물독소⁴로 설명됩니다. MSM은 일부 식물-미생물 상호작용에서 병태에 영향을 미치며, 식물에 대한 감수성 또는 저항성을 유발할 수 있습니다. 예를 들어, 그래밀린 순환 리포펩타이드는 ROS 생성, 이온 누출, 칼로스 생성을 유도하면서 보리에 대한 Fusarium graminearum²에 대한 감수성을 증가시킵니다. 시링고마이신과 시링고펩틴 순환 리포펩타이드는 식물의 ROS 생성을 유도하고 Pseudomonas fluorescens 박테리아에 대한 숙주 내성을^{촉진합니다.} 서팩틴과 이투린과 같은 다른 MSM은 비병원성 미생물에 의해 생성되며, 식물 스트레스 반응을 유도하여 이후 병원체 감염에 대한 내성을 촉진합니다 ^6,7. 이러한 생체보호 MSM은 이온 플럭스, ROS 생성, 전사 변화, 칼로스 생성 등 세포 반응을 유도합니다^. MSM과 식물 간의 상호작용을 이해하는 것은 MSM이 질병 저항성에서 어떤 역할을 하는지 파악하고, 작물 저항성 개선에 활용할 수 있는 숙주 유전자를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

현재 MSM에 의한 식물 스트레스 반응을 평가하는 방법은 일반적으로 한 번에 하나의 스트레스 반응을 검사하는 것입니다⁸. 2차 MSM은 추출이 어렵고 대사산물의 양도 제한적일 수 있으므로, 동일한 샘플 내에서 여러 반응을 검사하면 MSM이 식물 세포에 영향을 미친다는 확신을 줄 수 있습니다. 포포플라스틱 ROS 폭발을 평가하는 고처리량 방법 중 하나는 고추냉이 과산화효소⁹가 존재하는 상태에서 산화된 루미놀에 의해 생성된 발광을 검출하는 것입니다. 안타깝게도 루미놀 기반 발광은 양이온과 일부 용매에 의해 소환되어, 염을 포함한 추출물이나 DMSO에 용해해야 하는 비극성 분자에 대한 이 분석법의 사용이 제한되어 이러한 오염물질과 함께 작동하는 방법이 필요하다⁹. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 동일한 잎 샘플에서 고처리량 분석에서 세 가지 스트레스 반응(이온 누출, 과산화효소 활성, 굳은뼈)을 평가하는 기존 방법을 확장하였습니다(그림 1)10,11,12. 저희 접근법은 96웰 플레이트에서 진공 침투를 이용해 MSM으로 잎 디스크를 처리하는 것입니다. 다음으로, 치료 후 4-6시간 후에 이온 누출을 평가하기 위해 전도도 측정을 실시하고, 24시간에 과산화효소 활성과 칼로스 침착 측정을 실시합니다. 우리의 접근법은 애기장대와 보리에 최적화되어 왔으나, 실험적 검증을 통해 다른 식물 종으로도 확장될 수 있습니다. 예를 들어, 유도된 보리 과산화효소 활성은 이 방법으로 검출되지 않지만, 독성 화합물에 의한 활성 억제는 감지할 수 있습니다. 따라서 잎의 특성이나 유도된 반응의 진폭은 종마다 다르기 때문에 일부 식물 종에 대한 적용 가능성이 제한됩니다.

이 방법을 사용할 경우 MSM의 대조군, 복제, 농도를 고려하여 최상의 결과를 보장해야 합니다. 음성 대조군은 상처 효과와 통계적으로 다른 수준의 스트레스 반응을 유발하는 MSM을 식별하는 데 필수적입니다. 이상적으로는 음성 대조군에 MSM과 동일한 용매를 포함하지만 MSM이 없는 상태여야 합니다. 소수성 MSM의 대표적인 용매로는 DMSO와 메탄올이 있으며, 이들은 고농도에서 ROS 생성과 같은 세포 반응을 유도합니다^13,14. 이 분석에서 우리는 과산화효소 활성에 영향을 미치는 것을 관찰하는데, 10% 이상의 DMSO와 메탄올이 flg22 유도 과산화효소 활성을 차단합니다(그림 2). 복잡한 추출물의 경우, 관심 있는 대사산물이 알려지지 않은 상태에서 MSM이 전혀 없는 음성 대조군을 개발하기 어려울 수 있습니다. 대신 크기, 극성, 전하에 따라 추출물을 분획함으로써 분획 간 상대적 비교를 통해 가장 응력 유발 분획을 식별하여 추가 분석을 할 수 있습니다. 또한, 1 μM flg22 또는 10 μM T-2 독소와 같은 양성 대조군을 포함하면 연구자가 분석이 제대로 작동하는지 평가할 수 있습니다. 우리는 한 처리당 4회의 기술적 복제를 포함하고, 실험 내에서 여러 판을 측정할 경우 각 판에 양성 및 음성 대조군을 포함할 것을 권장합니다.

전반적으로 이 접근법은 MSM에 의해 유발된 세 가지 식물 스트레스 반응을 포착하여, 식물-MSM 상호작용을 조사하는 접근성과 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 고처리량 포맷은 연구자들이 동일한 실험 단위 내에서 식물 유전자형이나 미생물 추출물 간의 미묘한 차이를 포착할 수 있게 합니다. 이를 통해 시스템 차원의 접근법으로 식물 유전자 가족을 이해하거나 유전적 지도를 조사할 수 있습니다. 미생물 측면에서 이 접근법은 잠재적인 생물학적 보호 성분을 선별하거나, 특정 스트레스 반응을 증강하거나 억제하는 화합물을 식별하는 화학 유전체학에 활용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 샘플 준비 및 처리

참고: 실험자와 환경에 대한 위험을 최소화하기 위해 모든 적절한 안전 수칙과 폐기 절차를 반드시 지켜야 합니다.

1. 식물 재배
   1. 애기장대는 코넬 토양 혼합물(이탄 이끼 300개, 버미큘라이트 1개, 서방성 비료 4.2개 석회)로 4-5주 성장 단계까지 키우세요. 화분당 24화분에 2그루씩 키우세요. 필요에 따라 아래에서 트레이에 물을 넣어 물을 주세요. 성장실 온도를 21 ^°C로 연속 설정하고, 16시간의 빛과 8시간의 어두움을 유지하며, 습도는 약 30-50%로 유지하세요. 완전히 팽창한^5-9번째 잎을 실험용으로 사용해 아침에 수확하세요.
   2. 보리를 75 화분용 흙에서 1, 2 번째 진엽이 완전히 확장될 때까지 재배합니다: 24 흑토 혼합토: 1 석회토 혼합토. 화분당 씨앗 한 개를 24개 구역에 심고, 필요할 때 물을 주세요. 성장실 조건을 21 ^도C, 16시간 빛, 8시간 어두운 환경에서 약 30-50% 습도로 설정하세요. 첫 번째와 두 번째 완전히 확장된 잎을 샘플링하고 아침에 수확하세요.
2. 식물당 4mm 직경의 코르크 보러를 사용해 잎 디스크 3개를 채집하고, 중맥을 피하세요. 날카로운 보러를 사용해 조직을 마세레이팅하지 않도록 비틀어 사용하세요.
3. 잎 디스크를 즉시 조심스럽게 96웰 플레이트의 한 웰에 196 μL 멸균 Milli-Q H₂O에 넣습니다. 필요한 샘플 수가 채취될 때까지 디스크를 계속 채취합니다.
4. 2차 대사산물이나 용매 처리를 원하는 농도의 최종 부피인 200 μL에 개별 웰에 첨가합니다.
5. 뚜껑을 열어둔 96웰 플레이트를 진공 노즐이 달린 벨 자에 넣으세요.
6. 진공 호스를 벨자 노즐에 연결하고 진공 압력을 켜서 진공이 9.8파운드/제곱인치(보통 10초)에 도달할 때까지 유지하세요. 이 과정을 한 번 더 반복하세요.
7. 뚜껑을 플레이트 위에 올려놓고, 궤도 셰이커(55rpm)에서 빛(13 W, 50 μmol∙^m-2∙^s-1)을 셰이커 위 23cm 위치에 4시간 동안 인큐베이션합니다.

2. 이온 누출 측정

1. 프로브를 밀리-Q 물에 씻고 킴와이프를 가볍게 두드려 말리세요. 참고로 물의 전도도 측정값을 참고하세요.
2. 처리 후 4-6시간 후, 잎 원반 주변 액체에 프로브를 담가 개별 웰에서 전도도를 샘플링하고 기록합니다. 프로브가 완전히 나오도록 플레이트를 45° 각도로 잡으세요.
3. 샘플 사이에 Milli-Q 물에 담근 후 Kimwipe에 닦아서 프로브를 씻어내세요. 가끔은 수질 전도도를 테스트하여 프로브 측정값이 안정적인지 확인하세요.
4. 플레이트에 플라스틱 밀봉 필름을 붙이고 다시 궤도 셰이커로 돌아가 하룻밤 동안 부양합니다.

3. 퍼옥시다아제 활성 측정

1. 과산화효소 기질은 매일 50mL 용액으로 신선하게 준비하세요. 40mL의 증류된 멸균수를 70 ^°C까지 가열한 뒤, 5-아미노살리실산 50mg(1 mg/mL)을 가열한 물에 녹입니다. 최대 50mL까지 물을 넣고 NaOH를 사용해 pH를 6으로 조절하세요. 용액은 빛에 민감하므로 알루미늄 호일로 덮거나 호박 튜브를 사용하세요.
2. 50 mL 호박 원뿔 튜브에 10% H_2O 2 용액 1.7 mL를 30% H₂O₂ 1 mL에 48.3 mL Milli-Q H₂O 1을 첨가하여 만듭니다.
3. 분석 직전에, 분석이 필요한 5-아미노살리실 용액 1밀리터당 10 μL H₂O₂ 용액을 첨가하여 분석 배지를 생성합니다.
4. 처리된 잎 원반을 샘플링하기 위해 각 웰에서 원하는 시점에 50 μL을 채취합니다. 투명하고 평평한 바닥의 96웰 플레이트에 옮기고, 50μL 액자를 첨가하여 5번 피펫팅하여 혼합합니다.
5. 반응을 상온에서 3분간 배양한 후, 20 μL 2N NaOH를 첨가하고 부드럽게 두드려 반응을 멈추세요.
6. 플레이트 리더기로 595 nm 거리에서 웰의 흡광도를 측정합니다.

4. 칼로스 영상 및 영상 분석

1. 과산화효소 분석용 웰을 샘플링한 후, 남은 액체를 제거하고 고정 및 염색을 위해 100 μL 아세트산-에탄올(1:3) 용액을 추가합니다. 플레이트 위에 뚜껑을 덮고, 셰이커(60rpm)에서 실온에서 24시간 동안 배양합니다.
2. 염색 용액을 신선한 용액으로 교체하고 실온에서 24시간 더 배큐하세요.
3. 염색 용액을 피펫으로 빼내고 각 웰에 150 mM K₂HPO₄ 100 μL 용량을 추가합니다. 접시를 셰이커에 올려놓고 실온에서 30분간 부큐브합니다.
4. K₂HPO₄ 세척액을 제거하고 150 mM K₂HPO₄ 100 μL 알코올과 0.1 mg/mL 아닐린 블루를 첨가합니다. 96웰 플레이트를 덮고 알루미늄 호일을 덮고, 셰이커에서 최소 2시간 이상 (애기장대) 또는 보리(보리)를 하룻밤 이상 배양하세요.
   참고: 아닐린 블루는 빛에 민감하므로 각 기술 복제마다 신선하게 만들어야 합니다.
5. 아닐린 블루 용액을 제거하고 50% 글리세롤로 교체하세요. 96웰 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 4°C에서 보관하여 영상 촬영 준비가 될 때까지 보관하세요.
6. 깨끗한 유리 슬라이드에 50% 글리세롤 용액을 한 방울 떨어뜨립니다. 핀셋으로 잎 원반을 부드럽게 집어 슬라이드 위에 배가 위로 올려놓으세요. 1.5 커버슬립으로 덮어 공기 방울을 최소화하고, 필요하면 커버슬립 아래에 50% 글리세롤을 추가해 넣으세요.
7. 20배 건식 대물렌즈 아래에서 투과된 백색광(밝은 시야)을 사용해 잎 재료를 초점에 맞추세요.
8. 아닐린 블루 이미징을 위해 여기 파장을 370 nm, 방출 파장을 509 nm로 선택하고 노출 시간을 설정합니다. 충분한 신호를 확보하되 픽셀 과포화를 피할 수 있도록 노출 시간을 최적화하세요. 이미지의 정량적 비교를 위해서는 모든 생물학적 복제, 처리 및 기술적 복제에 대해 레이저 강도와 노출 시간이 일관되어 있는지 확인하세요.
9. 각 잎 원반마다 세 가지 다른 시야각을 선택해 4.8단계에서 설정한 매개변수를 사용하여 각각의 이미지를 획득합니다. 식물 물질이 시야를 완전히 채우고 배경 영역이 최소화된 모든 이미지를 촬영하세요(식물 재료가 아닌 경우). 잎 표면의 단일 z-평면에서 이미지를 획득하세요.
   참고: 배경 지식은 불가피할 수 있으며, 이후 이미지 정량화 단계에서 보정할 수 있습니다. 이 예시에서는 수은 램프와 DAPI 필터 큐브(여기 360/40 nm, 방출 460/50 nm)가 장착된 직립형 에피형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 수은 램프가 없는 경우에는 다중 파장 LED 광원을 사용할 수 있습니다.
10. 이미지에서 칼로스 스팟을 정량화하려면 https://imagej.net/Fiji/Downloads 에서 온라인 설명을 참고해 무료로 제공되는 FIJI 이미지 처리 소프트웨어를 다운로드하여 설치하세요. FIJI를 열고 분석을 위해 아닐린 블루 이미지를 불러와. 이 분석에서는 해상도가 최소 300 dpi.tiff 있는 파일을 사용하세요. 분석 전에 현미경 소프트웨어를 사용해 이미지 파일을 .tiff 형식으로 내보내거나, FIJI가 파일을 열도록 하십시오.
    참고: 피지는 대부분의 독점 파일 형식(예: .czi, .nd2, .lif, .vsi)을 열 수 있습니다.
11. 이미지의 척도를 설정하세요 ( 분석 | 스케일 설정), 현미경 세팅의 거리 값을 사용해 말입니다.
12. 이미지를 32비트 그레이스케일 이미지로 변환하세요 (이미지 클릭 | 유형 | 32비트).
13. 임계값 조정 ( 이미지 | 조정 | Threshold)는 자동 버튼을 클릭한 후 임계값 곡선의 최소값과 최대값을 수동으로 조정하여 아닐린 블루 염색을 나타내는 형광 신호만 포함하도록 합니다. 임계값이 확정되면 Apply | 마스크로 전환하세요. 스프레드시트 소프트웨어를 사용해 각 이미지에 대해 선택한 임계값 매개변수를 작성하세요.
    참고: 식물 샘플의 고유한 자가형광과 식물 조직의 제거로 인해 임계값이 샘플마다 다를 수 있습니다. 재현성을 위해서는 각 이미지의 임계값을 기록하고 샘플 간 임계값을 일관되게 조정하는 것이 필수적입니다.
14. Analyze Particles를 사용하여 아닐린 블루 펀크타의 수와 크기를 정량화하세요 (Analyze 클릭 | 기본 설정을 사용해 입자를 분석합니다. 이미지 내 모든 펀크타의 평균 값을 원하시면 팝업 박스에서 요약을 선택한 후 확인을 클릭하세요.
15. 요약 박스에서 이 결과를 스프레드시트에 복사해서 붙여넣기, 임계값 매개변수와 함께 추가 분석을 하세요. 이 수치에 포함된 값에는 카운트(아닐린 블루 펀크타 수), 총 면적(아닐린 블루 펀크타²단위 총 면적), 평균 크기(아닐린 블루 펀크타²단위 평균 크기), %면적(아닐린 블루 형광^{2단위 평균} 덮개 비율)과 전체 면적에 대한 비율, Perimeter(펀크타 평균 둘레), IntDen(아닐린 블루 염색의 형광 강도 지표) 등이 포함됩니다.
16. 실험 중 획득한 모든 이미지에 대해 4.11-4.15 단계를 반복합니다. FIJI에서 임계값이 적용된 이미지를 닫을 때, 원시 데이터 이미지를 임계값 마스크로 변경하지 않도록 ' 저장하지 않음 '을 선택하세요.
17. 만약 이미지에 식물이 아닌 영역이 포함되어 있다면, 다각 형 또는 자유손수 선택 도구를 사용해 식물 조직의 영역을 수동으로 윤곽선으로 표시하고 면적 을 측정하세요(분석 | 측정). 이 값을 각 이미지별로 스프레드시트에 복사하세요.
18. 스프레드시트에서 한 생물학적 복제체의 세 시야각 이미지의 값을 평균내세요. 실험 중 일부 이미지에 비식물 영역이 포함되어 있다면(4.17단계 참조), 각 이미지의 식물 조직 면적을 기준으로 모든 값을 보정합니다. 예를 들어, 각 이미지의 식물 조직 면적으로 카운트 값을 나누어 그래프 작성과 통계 비교를 하세요.

5. 데이터 분석

1. 동일한 플레이트 내에서 양성 대조군과 음성 대조군을 t-검정을 사용하여 실험의 질을 평가합니다. 양성 대조군이 스트레스 반응에 유의미한 변화를 가져오지 않았다면, 식물 건강, 처리 시기, 음성 대조군, MSM의 잠재적 악화 등 실험 조건을 재평가하십시오.
2. 유의성 검정
   1. 만약 모든 기술적 복제가 동일한 판 내에서 평가된다면, Tukey 검정을 이용한 일방향 ANOVA와 같은 표준 통계적 접근법을 사용하여 개별 처리와 음성 대조군 간 차이를 분석합니다.
   2. 여러 판에서 기술적 복제를 평가할 경우, 판 간 오차의 영향을 최소화하기 위해 각 샘플을 음성 대조군에 대해 정규화합니다. 각 값을 같은 판 내 음성 대조군 샘플들의 평균으로 나누어 보세요. 정규화된 값을 표준 통계 방법에 적용하세요.

결과

이 방법을 사용하면 MSM이 식물 세포 스트레스 반응의 일부를 활성화하는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 분석의 결과는 과산화효소 활성, 이온 누출, 칼로스 생성을 정량화하여 MSM이 음성 대조군과 비교해 차이 있는 반응을 유도하는지 판단합니다. 화합물에 대한 양성 결과는 음수 대조군과 유의미한 차이로 나타난다. 이는 그라밀린 이온포어의 경우 이온 누출과 칼로스 생성을 유도한다(그림 3)². 1 μM flg22와 같은 양성 대조군을 포함하면 세 가지 반응을 모두 유도함으로써 식물의 성능과 실험 조건이 온전하게 유지됩니다(그림 3)^11,15. 그라밀린과 FLG22는 물에 녹고, 소수성 서팩틴과 T-2 독소는 DMSO에 녹습니다. 소수성 분자를 제조하기 위해 먼저 DMSO에서 10 mM 스톡을 준비합니다. 이 스톡은 0.1% DMSO를 함유한 Milli-Q 물에서 최종 농도인 10 μM의 최종 농도를 생성하는 데 사용됩니다. 서팩틴(10 μM)은 과산화효소 활성과 굳은칼로스를 유도하는 반면, T-2 독소(10 μM)는 과산화효소 활성을 억제하고 칼로스 생성을 유도하는데, 이는 아마도 세포 사멸에 의한 것으로 보입니다 ^2,6,16. 양쪽 모두 유사한 결과를 내므로 물 또는 0.1% DMSO를 음성 대조군으로 사용하는 것이 적절합니다(그림 2).

상업적으로 이용 가능한 MSM 100종을 예비 스크리닝한 결과, 조사한 대부분의 화합물에서 칼로스 유도가 나타났으며(>70%), 이온 누출과 과산화효소 활성은 더 적은 화합물(30%와 35%)에 의해 유발됩니다. 이들 화합물의 대부분은 푸사리움 종에 의해 생성되며, 여기에는 디옥시니발레놀(DON)과 T-2 독소와 같은 7가지 트리코테센이 포함됩니다. 이 결과를 확인하기 위한 추가 재현 연구가 진행 중이지만, 양성 대조군(그림 3)과 유사한 경향을 보여, 모든 처리에서 칼로스가 유도되고 일부 처리에서 이온 누출이나 과산화효소가 유발된 경우는 아닙니다.

그림 1: 잎에서 MSM에 의해 유도된 세포 반응을 평가하는 절차 개요. 잎 디스크는 관심 처리가 포함된 96웰 플레이트에 배치되며, 디스크는 진공 침투 처리됩니다. 각 플레이트에는 음성 대조군(용매가 포함된 물)과 양성 대조군(flg22 또는 T-2 독소)의 네 가지 복제본이 포함되어 있습니다. 4-6시간 후에는 잎 원반을 둘러싼 액체의 전도도를 이온 누출의 정량화로 측정합니다. 24시간 후에는 잎 디스크 주변의 액체를 이용한 색도 측정법으로 과산화효소 활성을 정량화하고, 잎 디스크를 염색하여 칼로스 정량화를 위해 처리합니다. 약자: MSM = 미생물 2차 대사산물. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 용매가 flg22 유도 이온 누출 또는 과산화효소 활성에 미치는 영향. 복제된 애기장대 4개 샘플은 1 μM flg22와 DMSO 또는 메탄올(0, 0.01, 0.1, 1, 10%)을 함께 처리하였다. 막대 그래프는 단일 실험에서 4시간 후 샘플의 평균 전도도 또는 처리 후 24시간 후 과산화효소 활성(OD₆₀₀)을 보여줍니다(n = 4, SD). 이 실험은 두 번 반복되었고 결과는 비슷했다. 수분 조절과의 유의미한 차이는 t-검정으로 결정되었으며, 별표(p < 0.05)로 표시되었습니다. 약어: DMSO = 디메틸 설폭사이드; MeOH = 메탄올. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 미생물 유래 분자에 의한 애기장대 잎 디스크 내 이온 누출, 과산화효소 활성 또는 칼로스 침착 유도. 치료제로는 면역원성 무독성 펩타이드 플로그22(1 μM), 고리성 리포펩타이드 그라밀린과 서팩틴(10 μM), T-2 독소(10 μM^)2,6이 포함되었습니다. 모든 데이터는 물 + 0.1% DMSO 통제로 정규화되었습니다. 박스 앤 위스커 플롯은 4시간 후 샘플의 전도도, 24시간 후 과산화효소 활성(OD₆₀₀), 또는 단일 실험(n = 4-16 식물)에서 24시간 후 칼로스 침전물 수를 보여줍니다. 박스 플롯은 평균의 값을 나타내는 'x'를, 박스는 처리의 첫 번째 사분위수, 중앙값, 세 번째 사분위수를 나타냅니다. 이상치가 아닌 가장 높은 및 최저 관측값은 수염(>1.5배 4분위 범위, 원으로 표시)으로 표시됩니다. 수분 대조와의 유의미한 차이는 별표로 표시되며, Tukey 검정을 이용한 일원 ANOVA로 결정되었습니다(p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

식물 정착 미생물 군집은 다양한 MSM을 분비하여 바이오필름 형성을 촉진하고, 경쟁 미생물을 억제하며, 식물 숙주에 영향을 미친다¹⁷. 일부 MSM은 식물에 영향을 미치지 않지만, 다른 것들은 빠른 세포 사死을 유도하거나 세포 기능을 억제하거나 식물 저항성을 유도합니다¹⁷. 일부 MSM은 MSM 생성 미생물에 대한 식물 저항성에 영향을 미치며, 저항성 유전자형은 MSM 민감성 ^2,3,18에 따라 선택할 수 있습니다. 다른 MSM들은 전신 내성을 유도하고 미생물 병원체에 대한 보호를 제공하며, 이는 농업에서 질병 억제를 위한 생물학적 보호 제품 개발에 사용되었습니다⁸. 효과적이고 지속 가능한 작물 개선 전략을 개발하기 위해서는 유익한 MSM과 최적의 MSM 반응성을 가능하게 하는 식물 유전자를 식별하는 것이 필수적입니다.

유익한 MSM을 찾는 것은 이들 화합물이 효소적으로 생성되기 때문에 복잡하며, 완성된 결과물에는 여러 효소가 필요하다². 이로 인해 유전 연구에서 MSM 생산을 없애기 위해 어떤 유전자를 표적으로 삼을지 결정하기 어렵습니다. 효소 생합성은 동일한 MSM에서 여러 구조적 변이를 초래하며, 잠재적으로 서로 다른 생활성을 나타냅니다¹⁹. 이 MSM들을 분리하고 정제하여 생체 활성 분자를 찾는 것은 시간이 많이 걸리거나 불가능할 수 있습니다. 경우에 따라 개별 MSM의 농도가 낮은 경우에만 정제가 가능하며, 여러 차례 정제 과정을 거쳐야 합니다^. 생리활성 화합물이나 추출물이 얻어지면, 미생물이 식물에 미치는 영향을 이해하기 위해 여러 가지 접근법을 사용할 수 있습니다.

과거 노력은 모델 플랜트에서 MSM이 전사 재프로그래밍 또는 생물보호에 미치는 영향을 모니터링하는 데 집중되어 왔습니다²⁰. 모델 플랜트를 넘어 MSM 반응을 평가하기 위해, 다양한 MSM에 대한 반응을 포착하고 최소한의 MSM으로 하는 고처리량 분석법이 잠재적으로 유용할 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 ROS 폭발은 그라밀린, 서팩틴, 시링고마이신, 시링고펩틴 ^2,3,7 등 MSM에 대한 초기 반응으로 흔히 나타납니다. 루미놀 기반 분석법은 과산화효소와 NADPH 산화효소에 의해 생성된 부작용성 ROS 폭발을 검출하며, 고처리량 시험에 적합하다²¹. 안타깝게도, MSM에 의해 유도되는 세포내 ROS, 예를 들어 서팩틴은 이 방법으로 검출되지 않습니다⁷. 과산화효소 활성을 정량화하는 것은 스트레스 중 ROS 생성 효소의 일시적 활성화를 감지하는 루미놀 기반 분석보다 더 민감한 대안을^{제공합니다.} 서르파틴이 과산화효소 활성을 유도한다는 우리의 관찰은, 아라비두시스에서 서르팩틴과 보베리신에 의해 촉발된다는 최근 연구와 일치합니다(그림 3)². 또한 flg22와 이오노포어 그라밀린이 이온 누출을 유도하며, flg22, T-2 독소, 서르팩틴, 그라밀린 등 모든 검사 화합물이 예상대로 칼로스를 유도함을 보여주었다(그림 3)^2,4,7.

동일한 샘플 내에서 여러 반응을 평가함으로써 각 형질을 개별적으로 평가할 때 실험적 변동을 최소화하고, 식물 스트레스 반응에 관한 시스템 수준 연구에서 형질 간 상관관계를 가능하게 합니다. 동일한 실험 단위 내에서 여러 처리나 유전자형을 평가하는 것은 집단 유전학을 위한 집단 수준의 표현형 분석도 가능하게 합니다. 예를 들어, 유사한 접근법이 보리²²에서 FLG22에 의해 유도된 ROS 생성의 근저가 되는 QTL을 규명하는 데 사용되었습니다. 이 분석법은 식물 스트레스 반응의 조절자를 찾거나 미생물 추출물에서 잠재적인 생물학적 보호 MSM을 식별하는 화학 유전학 스크리닝에도 활용될 수 있습니다.

실험 방법이 관심 있는 시스템 내에서 작동하는지 확인하기 위해 연구자들은 다음 요소와 한계를 고려해야 합니다:

잎 조직의 질
수확 전에 식물 잎 조직에 스트레스가 가지 않도록 하세요. 식물이 스트레스를 받았다는 징후는 종마다 다르지만, 일반적으로 시들기, 노란변색, 붉어짐, 반점, 잎이 과도하게 말리거나 말리는 현상이 포함됩니다. 잎 조직 샘플링은 상처를 유발하므로, 조직의 과도한 마세레이션을 피하면 다루는 과정에서 발생하는 배경 오류를 줄일 수 있습니다.

식물 종
이 프로토콜은 보리와 애기장대 잎에 최적화되어 있습니다. 보리 잎은 애기장대보다 칼로스에 더 긴 염색 시간이 필요한데, 이는 풀의 두꺼운 큐티클 왁스가 소수성을 높이고²³번 잎으로의 확산이 제한되기 때문일 가능성이 큽니다. 이 또한 우리 방법을 사용했을 때 과산화효소 활성 유도가 부족한 이유를 부분적으로 설명할 수 있으나, 우리는 애기장대에서 제시한 것과 유사한 독성 화합물에 의한 과산화효소 활성 억제를 관찰할 수 있었습니다(그림 3). 샘플당 잎 디스크 수를 5개로 늘리고, pH를 5, 6, 7로 조절하며, 진공 침투 횟수를 10개로 늘리고, 기질 농도를 변경하거나 기질을 구아이아콜²⁴로 변경하는 시도를 했습니다. 잎 원반과 침윤 주기가 많아질수록 과산화효소 활성이 증가했으나, 음성 대조군과 flg22 간의 차이는 여전히 작았으며(flg22 10% 증가) 또는 실험 간 유의하지 않았습니다. 우리는 보리가 FLG22에 반응하여 ROS 생성, 칼로스 생성, 과산화효소 발현을 유도한다는 것을 알고 있습니다^25,26. 옥수수 뿌리에서는 단백질 추출물이 MAMP 유도 과산화효소 활성을 보였으며, 이는 유도를 관찰하기 위해 단백질 추출이 필요할 수 있음을 시사하는데, 이는 우리 분석법²⁴에서 이루어진 것처럼 잎 원반에서 단백질 활성을 감지하는 것과 달리 가능함을 시사합니다. 우리 분석법에서는 손상이 음성 대조군 샘플에서 페르옥시다아제 활성을 명확히 유도하는데, 이는 독소 노출로 세포가 죽으면 이 활성이 사라지기 때문입니다. flg22 치료가 상처와 동일한 과산화효소를 유도하여 유도가 일어나지 않은 것처럼 보이게 할 가능성도 있습니다. 또는 분석이 미세한 변화를 감지할 만큼 민감하지 않거나, 과산화효소가 용액에 잘 확산되지 않을 수도 있습니다.

이 프로토콜을 다른 식물 종에 적용할 때는 설명한 방법을 사용하고 애기장대를 대조군으로 포함시켜 프로토콜이 효과적인지 확인하는 것을 권장합니다. 과산화효소 활성이 낮아 보인다면, 샘플당 잎 원반 수를 늘리고, 진공 침투 횟수를 5회 또는 10회로 늘리며, 다른 MAMP, 이온포어, T-2 독소 등 다양한 처리를 시도하면 긍정적인 결과를 얻을 수 있습니다.

음성 대조군 처리
이 방법은 비교를 위한 효과적이고 적절한 음성 대조군에 의존합니다. 이상적으로는 음성 대조군이 관심 있는 MSM 처리와 동일한 배경 용매를 포함하지만 MSM은 포함하지 않는 것이 좋습니다. 배경 용매는 물이거나, 측정된 응력에 물과 같은 영향을 미칩니다. 이는 MSM이 이미 정제되어 선택한 용매에 용해될 수 있는 실용적인 접근법입니다. 미생물 추출물을 비교할 때, 음성 대조군은 MSM 부분 정제의 부산물일 수 있으며, 이는 동일한 배경 배지를 포함하지만 분획 후 MSM 농도가 감소한 경우일 수 있습니다. 또는 실험자는 MSM 함유 추출물을 생성하는 배양 배지를 음성 대조군으로 사용할 수도 있습니다. 이러한 더 복잡한 시료에서는 음의 대조군에 전도도 측정을 부풀리는 염이 포함될 수 있고, 용매가 과산화효소 활성을 억제할 수 있습니다(그림 2). 염분이 이온 누출 결과에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 실험자는 잎 디스크가 없는 상태에서 음극 대조군과 샘플의 전도도를 테스트하여 샘플 또는 잎 자체가 전도도 변화를 일으키는지 확인할 수 있습니다. 용매가 과산화효소 반응에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 실험자는 음정 대조군에 flg22를 추가하고, 그 결과를 물에 녹인 FLG22와 비교하여 차이가 있는지 확인할 수 있습니다. 용매, 색조 화합물 또는 과도한 염분 사용이 음성 대조군에서 MSM이 식물 스트레스 반응에 미치는 영향을 가릴 수 있으므로, 이 접근법이 모든 상황에 적합하지는 않을 수 있습니다.

샘플링 시간
유도 방어 반응은 일주기 리듬을 따르며 이른 아침에 가장 큰 진폭을 보이기 때문에 아침에 치료를 시작하는 것이 중요합니다. 우리의 경험에 따르면, 애기장대는 보리와 옥수수보다 그라밀린에 반응하여 이온 누출을 4시간(4-7시간)보다 빠르게 발생시키므로, 실험 매개변수 ^2,28을 설정하는 데 일정 시간이 필요할 수 있습니다. 세포 반응성은 시간이 지남에 따라 감소하므로, 치료 후 30+시간 이상의 스트레스 반응 검사는 권장하지 않습니다.

농도
MSM 농도는 식물 스트레스 반응을 유발하는 데 비선형적인 영향을 미칠 수 있는데, 이를 호르메시스 20(hormesis²⁰)이라고 합니다. MSM의 가용성과 용해도에 따라, 실험자들은 이상적으로는 다양한 MSM 농도에서 공장 스트레스 반응을 테스트할 것입니다. 일반적인 농도는 100 nM에서 1,000 μM 사이로 2,11,20 사이로 다양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5-아미노살리실산	밀리포어 시그마와 nbsp;	A79809
바나트 진공 펌프	장인 기술 그룹	400-3910
COND-905 미세 전도도 탐침	라자르 연구소 주식회사
FLG22 펩타이드	아나스펙	AS-62633
인피니트 200PRO F	테칸 그룹 주식회사	30190086
서팩틴	시그마-올드리치	S3523
T-2 독소	케이맨 케미컬 컴퍼니 주식회사	20433