칸 디다 알비칸스 수용성 추출물 유발 가와사키병 관련 관상동맥염 쥐 모델의 확립 및 평가

피부 점막 림프절 증후군의 일종인 가와사키병(KD)은 5세 미만의 어린이에게 발생하는 자가면역 질환으로 열성 혈관염을 동반합니다 ^1,2,3. 연구에 따르면 치료되지 않았거나 10일을 초과하는 중증 KD는 주로 관상동맥류 및 관상동맥 협착증을 포함한 심각한 심혈관 합병증을 유발하기 쉽습니다 ^4,5. 관상동맥류의 파열은 심인성 쇼크 또는 급사로 이어질 수 있으며, 이는 소아 후천성 심장병의 주요 원인입니다 ^6,7. 정맥 면역글로불린의 적용으로 예후가 크게 개선되었지만 그 병인과 병인은 불분명하여 표적 치료 전략의 개발이 제한됩니다 ^8,9. 따라서 인간 질병의 특성을 정확하게 시뮬레이션할 수 있는 동물 모델을 구축하는 것이 현재 연구의 시급한 과제가 되었습니다.

현재 가와사키병 연구의 주요 장애물은 인간의 질병 병리를 완전히 요약하는 잘 특성화된 동물 모델이 없다는 것입니다. 현재 개발된 다양한 모델 중 락토바실러스 카제이 세포벽 추출물(LCWE)에 의해 유도된 혈관염 모델은 비교적 성숙한 시스템이며, 이 모델은 관상동맥염을 유발할 수 있습니다. KD 유사 혈관염에서 면역 조절 장애 및 특정 사이토카인의 메커니즘을 연구하는 데 널리 사용됩니다^10,11. 칸디다 알비칸스(CAWS)의 수용성 추출물에 의해 유발된 혈관염 모델도 인간 가와사키병의 병리학적 특징과 높은 유사성으로 인해 많은 주목을 받고 있습니다^12,13. 여러 연구팀의 체계적인 최적화 및 개선 끝에 CAWS 유도 모델은 가와사키병 연구의 중요한 도구로 발전했습니다¹⁴. CAWS는 복강내 주사를 통해 관상동맥 염증을 유발할 수 있지만 인간 KD 혈관염의 정확한 병리학적 과정을 완전히 재현할 수 없다는 한계가 있습니다. 예를 들어, 인간 KD¹⁵의 후기 병리학에서 호중구는 발견되지 않았지만, CAWS 주사¹⁶ 후 최대 16주까지 이 모델에서 호중구 침윤이 여전히 발생했습니다. 더욱이 CAWS로 인한 혈관염의 기전은 현재 완전히 밝혀지지 않았기 때문에 모델⁹에 대한 심층적인 이해와 적용이 제한됩니다. 본 연구는 KAWAS의 유도 프로토콜을 최적화하고, 질병 기전을 밝히고, 표적 치료제 개발을 촉진함으로써 KD의 표준화된 동물 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다.

이 연구는 CAWS를 활용하여 가와사키병의 보다 표준화된 동물 모델을 구축했습니다. 체계적인 용량 최적화 실험을 통해 연속 5일 동안 매일 8mg을 복강내 주사하는 것이 최적의 투여 요법이라고 판단되었습니다. 이 요법은 동물에서 높은 생존율을 유지하면서 관상 동맥 병변을 안정적으로 유도할 수 있습니다. 또한, 염증에서 섬유증으로의 전환 과정에서 미토콘드리아 세포사멸을 조절하는 핵심 단백질인 전압 의존성 음이온 채널 1(VDAC1)의 가능한 메커니즘에 초점을 맞춰 KD의 만성기 동안 섬유증 형성에서 미토콘드리아 기능 장애의 역할을 추가로 조사했습니다¹⁷. 본 연구에서 자가포식체/리소좀 공국소화 분석을 통해 본 모델에서 비정상적인 자가포식 기능이 관찰되었다는 점은 주목할 가치가 있다. 이 최적화된 모델은 가와사키병에서 관상동맥 병변의 병인을 체계적으로 연구하고 새로운 치료 전략을 평가하는 데 중요한 도구를 제공합니다.

동물 데이터와 관련된 모든 연구 실험은 난징 의과대학 부속 화이안 제1 인민병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(KY-2024-250-01). 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. CAWS 준비

1. Duong et ^al.18에 의해 확립된 프로토콜에 따라 Sabouraud 포도당 국물에 Candida albicans를 접종합니다. 그런 다음 접종된 국물을 가스 혼합물이 있는 밀봉된 혐기성 챔버에서 37°C에서 48시간 동안 혐기적으로 배양합니다.
   참고: 배양 배지의 멸균성을 보장하려면 37°C의 혐기성 배양 조건을 엄격하게 제어하여 기타 박테리아에 의한 오염을 방지해야 합니다.
2. C-제한 배지로 반복적으로 헹구고 37°C에서 4.5 x g의 회전 속도로 48시간 동안 배양합니다.
3. 같은 부피의 무수 에탄올을 넣고 4°C에서 밤새 그대로 둡니다.
4. 4.5 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 침전물에 같은 부피의 무수 에탄올을 첨가하고, 4°C에서 하룻밤 동안 그대로 두는다.
5. 원심분리 후 상청액을 버리고 침전물에 아세톤 50mL를 첨가하고 원심분리하여 침전물을 건조시킵니다. 나중에 사용할 수 있도록 침전물을 멸균 생리 식염수에 녹입니다.

2. 가와사키병의 마우스 모델 구축

1. 4-6주 된 80마리의 SPF 등급 수컷 C57BL/6 마우스를 선택하여 음식과 물을 자유롭게 접근할 수 있는 통제된 조건에서 사육합니다.
   참고: 면역 및 염증 반응에 대한 에스트로겐 수준 변동의 잠재적 간섭을 최소화하기 위해 이 예비 모델 구축 및 특성화 연구¹⁹에서 수컷 마우스만 사용되었습니다.
2. 마우스를 난수표 방법으로 3개의 서로 다른 용량의 CAWS 주사군(4mg, 8mg, 12mg)과 1개의 생리 식염수 대조군을 포함하여 각 그룹에 20마리의 마우스를 포함하여 4개 그룹으로 균등하게 나눕니다.
3. 멸균 생리 식염수(0.9% NaCl)를 사용하여 CAWS 분말을 40mg/mL, 80mg/mL 및 120mg/mL의 세 가지 농도로 준비합니다. 실험군은 실험 1일부터 5일까지 아침에 CAWS 0.1mL를 주입하고, 대조군에는 동일한 일정으로 같은 양의 생리 식염수를 투여한다.
   참고: 복강내 주사는 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 수행되었습니다. 작동 시 마우스를 머리는 낮고 꼬리는 높게 위치시켜 주사기를 삽입할 때 대장, 소장 등의 장기가 손상되는 것을 방지하세요.
4. 매일 오전 9시에 전자 저울을 사용하여 피더에 남아 있는 사료의 무게를 동시에 측정하고 각 생쥐 케이지에 대한 24시간 식품 소비량을 계산합니다.
5. 마지막 주사 후 3일, 7일, 14일, 28일에 각 시점에서 각 그룹에서 3마리의 마우스를 무작위로 선택하여 희생합니다.
6. 실내 공기로 미리 채워진 밀폐된 챔버에 마우스를 놓습니다. 분당 챔버 부피의 30%의 유속으로 압축된_{CO 2} 를 도입합니다. 5분 후 사망을 확인하기 위해 자궁경부 탈구를 시행하였다.
7. 심장 표본을 수집하고 무게를 측정합니다. HE 염색으로 심장과 혈관의 염증성 병변을 관찰합니다.

3. HE 염색 및 등급 표준

1. 심장과 대동맥궁(약 3mm × 3mm)이 빠르게 분리되었습니다. 설명된 방법⁽²⁰)에 따라 정중 흉골 절개술을 수행한다. 대동맥궁에서 심장을 빠르게 분리합니다(약 3mm × 3mm). 수집된 조직을 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정했습니다.
2. 고정 후, 등급이 매겨진 에탄올 시리즈(1시간 동안 70% 에탄올, 1시간 동안 80% 에탄올, 1시간 동안 95% 에탄올, 1시간 동안 100% 에탄올)를 통해 조직을 탈수하고 자일렌에서 투명하게 하고 파라핀에 포매합니다. 마지막으로 블록을 5μm 연속 슬라이스로 분할합니다.
3. H&E 염색의 경우 헤마톡실린으로 절편을 5분 동안 염색하고 흐르는 물에 10분 동안 헹구고 에오신으로 2분 동안 대변염색한 후 탈수 및 마운팅을 진행합니다²¹.
   참고: 혈관 내막 손상의 정도에 따라 세 가지 등급으로 분류됩니다. 등급 I은 주로 내피 부종 및 호중구 응집을 특징으로 합니다. 등급 II는 평활근 변성, 염증 세포 침윤 및 소기관 손상으로 나타납니다. 등급 III은 내피 괴사 및 탈락, 피브린 침착과 같은 심각한 병변을 나타냅니다.

4. 마슨 삼색 염색

1. 고정 후, 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 조직 샘플을 탈수하고 자일렌에서 투명하게 하고 파라핀에 포매합니다.
2. 탈랍 후, 염색을 준비하기 위해 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 증류수로 절편을 수화시킵니다.
3. Weigert의 철 헤마톡실린으로 핵을 5분 동안 염색하고 흐르는 물에 완전히 헹구고 세포질을 Lichun Red acid fuchsin으로 5분 동안 염색합니다.
4. 1% 포스포몰리브드산으로 1분 동안 감별한 다음 콜라겐 섬유를 아닐린 블루로 3분 동안 직접 염색합니다. 1% 빙초산으로 빠르게 헹굽니다.
   참고: 염색 특이성을 보장하기 위해 분화 단계의 시기를 엄격하게 제어하십시오.
5. 에탄올과 자일렌으로 탈수하여 투명해진 후 중성 필름을 밀봉합니다.
6. 흐르는 물에 얼룩진 부분을 헹구어 여분의 염료를 제거합니다.
7. 자일렌으로 투명한 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 절편을 탈수하고 중성 검으로 장착합니다.
8. 광학 현미경으로 일정한 배율로 절편을 관찰합니다. 콜라겐 섬유는 파란색, 근육 섬유와 세포질은 빨간색, 핵은 짙은 파란색으로 나타나야 합니다.

5. 면역형광염색

1. 세포 또는 조직 절편을 고정하고 5% BSA로 1시간 동안 차단하여 비특이적 결합을 줄입니다.
2. 2차 항체와 동일한 종 기원의 정상 혈청을 사용하여 PBS로 1:10 비율로 희석한 후 샘플에 떨어뜨립니다. 실온에서 30분 동안 밀봉합니다. 밀봉 후 PBS로 부드럽게 두 번 헹굽니다.
3. 절편을 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다. PBS로 세척한 후 형광 2차 항체를 첨가하고 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다.
4. DAPI로 코어를 염색하고 담금질 방지 설치제로 밀봉하고 공초점 현미경으로 관찰합니다.

6. 면역조직화학

1. 파라핀 절편의 탈랍 및 수화 후 항원 복구를 수행하고 내인성 과산화효소를 차단합니다.
2. 항체 배양 및 발색: 먼저 정상 혈청으로 차단한 다음 1차 항체와 HRP 표지 2차 항체를 순서대로 배양하고 마지막으로 DAB 발색을 합니다. 현미경으로 반응도를 조절합니다.
3. 세포핵을 헤마톡실린으로 다시 염색합니다. 탈수 및 투명화 후 플레이트를 밀봉하고 현미경으로 갈색을 띤 노란색 양성 신호를 관찰합니다.
   참고: 실험은 대조군을 설정하고 복원 및 발색 조건을 엄격하게 제어해야 합니다.

7. 자가용소좀 검출

1. RAW264.7 대식세포를 칸디다 알비칸스 포자와 적절한 비율(10:1)으로 공동 배양하고 37°C 및 5%_CO2 에서 4시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 28시간, 32시간, 36시간, 40시간, 44시간 및 48시간 동안 배양하여 식세포 모델을 확립합니다.
2. 비식세포 포자를 제거하기 위해 예식된 PBS로 세 번 세척합니다.
3. 먼저 5% BSA로 샘플을 30분 동안 차단합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 LC3에 대한 1차 항체(1:200 희석)와 연속적으로 배양한 다음 Alexa Fluor 488 표지 2차 항체를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. Lyso-Tracker Red 리소좀 프로브를 세포에 직접 추가하여 리소좀 국소화를 시각화합니다. 마지막으로, DAPI(1μg/mL)로 핵을 5분 동안 대조염색합니다.
   참고: 항체의 배양 시간과 농도가 정확하게 제어되도록 전체 작업 과정은 어둠 속에서 수행되어야 합니다.

처음에 우리는 생쥐에서 다양한 용량의 CAWS에 의해 유도된 심근 병리학적 변화를 체계적으로 평가했습니다. PBS 대조군, 4mg CAWS 그룹 및 8mg CAWS 그룹(각 그룹에서 n=20)에서 사망은 관찰되지 않았습니다. 대조적으로, 4mg 그룹의 염증 반응은 경미했으며 모델링 요구 사항을 충족하지 못했습니다. 사망률은 12mg CAWS군(9/20, 45%)에서 높았고, 주사 후 3일째부터 10일째까지 사망이 발생했다. 이러한 결과는 12mg의 용량이 과도한 국소 염증 손상 및 전신 독성을 유발할 수 있음을 시사합니다. 따라서 이 용량은 후속 연구에서 제외되었습니다. 8mg 용량은 허용 가능한 생존율과 최소한의 국소 이상반응을 유지하면서 심각한 관상동맥염을 효과적으로 유도할 수 있기 때문에 최종적으로 최적의 투여 요법으로 선택되었습니다. (그림 1A). 결국 8mg CAWS의 복강내 주사가 최적의 모델링 용량이라고 결정되었습니다. 실험군의 HE 염색 결과는 염증과 섬유증의 전형적인 동적 과정을 보여주었습니다. 셋째 날에는 주로 혈관주위 호중구와 단핵구로 구성된 국소 염증 침윤이 발생하였다. 7일째에는 염증 범위가 심근 간질로 확장되었고 상당한 심근 세포 부종과 간질 부종이 동반되었습니다. 14일째에는 염증이 최고조에 달했고, 심근섬유 배열 장애와 국소괴사가 발생하였다. 28일째에는 염증이 완화되었지만 초기 섬유증이 형성되었습니다(그림 1B 및 그림 2A). 대조적으로, 심근 구조는 대조군의 모든 시점에서 정상을 유지했습니다. 모든 결과는 이중 맹검 평가를 통해 확인되었으며, 8mg CAWS 용량이 가와사키병의 특성과 일치하는 심근 손상 모델을 안정적으로 유도할 수 있음을 확인했습니다.

그 후, MASSON 삼색 염색 방법을 사용하여 CAWS로 유발된 가와사키병 유사 혈관염이 관상동맥(CA) 주변의 지속적인 섬유증을 초래하는지 여부를 조사했습니다. 실험 결과, 생쥐의 CAWS 주사 그룹에서 염증이 있는 관상 동맥과 대동맥의 벽 주변에서 명백한 콜라겐 섬유 침착물이 발견되었으며, 이러한 섬유화 영역은 염증 세포 침윤의 분포 위치와 매우 일치하는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, PBS 대조군의 마우스는 혈관벽의 정상적인 구조 범위 내에 국한된 약한 콜라겐 염색만 나타났습니다(그림 2A). 정량 분석 결과 14일째에 상당한 콜라겐 섬유 침착이 발생했으며, 섬유화 정도는 대조군과 통계적으로 차이가 있는 것으로 나타났다(그림 2C).

가와사키병의 중심 병리학적 변화는 여러 면역 세포의 조화로운 작용을 포함하는 혈관벽의 면역 염증 반응이라는 점을 감안할 때22,23, 다음으로 면역형광(IF) 염색을 통해 CAWS 모델에서 면역 미세 환경의 특징적인 변화를 탐색했습니다. CAWS 주사 후 14일째에 CAWS를 주사한 마우스의 심장 조직에 면역 세포 마커의 IF 염색을 시행하였다. 실험 결과, CAWS 치료군의 생쥐를 모델링한 지 14일째에 관상동맥 및 심근조직에서 CD3+ T 세포, CD8+ 세포독성 T 세포, CD86+ M1형 대식세포, F4/80+ 대식세포 및 NK1.1+ 자연 살해 세포의 침윤이 PBS 대조군에 비해 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2B,D)를 사용합니다. 이러한 면역 마커의 발현 변화를 체계적으로 분석함으로써 CAWS 모델이 인간 가와사키병의 면역학적 특성을 정확하게 시뮬레이션할 수 있음을 검증했을 뿐만 아니라 더 중요한 것은 질병의 발생 및 발달에서 다양한 면역 세포 하위 집합의 가능한 메커니즘을 밝혀 표적 면역 개입 전략의 후속 개발을 위한 이론적 기초를 제공했습니다.

연구에 따르면 미토콘드리아 기능 장애는 심근 섬유증의 기본 메커니즘입니다 24,25,26. 염증 스트레스 하에서 미토콘드리아 품질 관리에 중요한 단백질인 전압 의존성 음이온 채널 1(VDAC1)은 발현이 상향 조절될 때 미토콘드리아 투과성 전이 기공(mPTP)의 비정상적인 개방을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 이것은 차례로 세포사멸을 유도하고 섬유아세포를 활성화합니다17,27. 이 메커니즘을 탐색하기 위해 우리는 면역조직화학을 사용하여 만성기에서 VDAC1 발현을 평가했습니다. 우리의 연구 결과, PBS 대조군과 비교하여 CAWS 처리군 마우스의 심근 조직에서 VDAC1 단백질 발현이 모델링 후 28일에 유의하게 상승한 것으로 나타났습니다(그림 3). 양성 신호는 주로 섬유화 부위와 혈관 주변에 국한되어 있으며, 이는 VDAC1 매개 미토콘드리아 기능 장애가 가와사키병 모델에서 심근 섬유증에 기여할 수 있음을 나타냅니다. 이러한 데이터는 CAWS로 인한 심근 손상의 분자 메커니즘에 관한 실험적 증거를 제공합니다.

이전 연구에서는 VDAC1 매개 미토콘드리아 기능 장애가 가와사키병의 심근 섬유증 과정에 관여한다는 사실을 발견했지만 그 구체적인 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 미토콘드리아 항상성의 유지는 자가포식-리소좀 시스템의 정상적인 기능에 달려 있다는 점을 감안할 때. 우리는 VDAC1이 자가포식리소좀의 형성이나 기능에 영향을 미쳐 비정상적인 미토콘드리아 축적을 유발함으로써 섬유증을 악화시킬 수 있다고 추측합니다. 이 가설을 검증하기 위해 먼저 대식세포(RAW264.7)에서 칸디다 알비칸스 포자 감염 모델을 확립하고(그림 4) 모델에서 자가포식 흐름과 리소좀 활성의 동적 변화를 검출했습니다. 실험 결과, 자가포식 리소좀의 형성은 초기 단계(세포 감염 후 2-3시간 이내)에 증가하는 반면, 자가포식 흐름은 후기 단계(세포 감염 후 3-4시간 이내)에 차단되는 것으로 나타났습니다. 자가포식 흐름의 변화는 자가포식체 및 리소좀 공동 국소화 후 병합 염색의 변화로 평가할 수 있습니다. 이 결과는 자가포식리소좀의 기능 장애가 실제로 세포 제거 장애로 이어질 수 있음을 확인합니다.

그림 1: 심장 및 관상 동맥의 조직병리학적 분석. (A) PBS 또는 다른 용량의 CAWS(4mg, 8mg 및 12mg; 그룹당 n = 20)를 주사한 마우스의 생존 곡선. (B) CAWS 치료군(8mg)에서 서로 다른 시점(3일, 7일, 14일, 28일)에서 심장의 HE 염색 결과를 제시하였다. 스케일 바: 1500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 콜라겐 섬유증 및 면역 세포 침윤 분석. (A) CAWS 8 mg 그룹과 대조군의 Masson 염색 결과. 콜라겐 섬유는 특징적인 파란색을 나타내고 근육 섬유와 세포질은 빨간색이며 세포핵은 진한 파란색입니다. 화살표는 곰팡이 포자를 나타냅니다. 스케일 바: 1500 μm. (B) CAWS 8 mg 그룹 및 대조군(CD3 표지 CD3+ T 세포, CD8 표지 CD8+ 세포독성 T 세포, CD86 표지 CD86+ M1 유형 대식세포, F4/80 표지 F4/80+ 대식세포 및 NK1.1 표지 NK1.1+ 자연 살해 세포)의 면역형광 염색 결과. 스케일 바: 200μm. (C) 심장 섬유증의 정도를 평가합니다. 심장 섬유증의 정도는 800배 배율에서 시야 심장 조직의 삼색 염색 면적 비율을 기준으로 평가되었습니다. 구체적인 방법은 다음과 같습니다. 콜라겐 섬유는 고분자 음이온 염료로 밝은 녹색으로 염색되기 때문에 800배 배율에서 100개의 시야(두께 5μm의 모든 슬라이스)를 관찰하고 전체 면적에서 녹색 면적의 비율로 심장 섬유증의 정도를 결정했습니다. 비율이 높을수록 섬유증이 더 심각합니다. (D) 면역형광염색 결과에 따라 면역세포의 비율을 통계적으로 분석하였고, ****p < 0.001을 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 28일째 PBS 그룹 및 CAWS 그룹에서 VDAC1 발현의 면역조직화학적 분석. (A) VDAC1 발현의 면역조직화학적 분석. 스케일 바: 800μm. 갈색 검은색 입자는 긍정적인 결과입니다. (B) VDAC1 면역조직화학적으로 양성 세포의 백분율에 대한 통계 분석, p < 0.001. (C) VDAC1 면역조직화학의 H-점수에 대한 통계 분석. 데이터는 여러 생물학적 복제(그룹당 n = 20마리의 마우스)에서 파생되었으며, 그 결과는 평균 ± 표준 편차로 표현되고 통계적으로 분석되었습니다(***p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 마우스 RAW264.7 세포에 의한 칸디다 알비칸스 의 식균작용 후 자가리소좀의 검출. (A) 화살표는 진균 포자를 나타냅니다. 스케일 바: 25μm. 자가포식 흐름의 변화는 자가포식체 및 리소좀 공동 국소화 후 병합 염색의 변화로 평가할 수 있습니다. (B) 자가리소좀 형성 속도의 시간 경과 분석은 관련 매개변수를 정량화합니다. 결과는 평균± 표준편차로 표현하고 통계적으로 분석하였다(***p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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