칸 디다 알비칸스 수용성 추출물 유발 가와사키병 관련 관상동맥염 쥐 모델의 확립 및 평가

요약

CAWS 유도 마우스 모델은 급성 염증에서 만성 섬유증으로의 가와사키병의 진행을 효과적으로 시뮬레이션하여 주요 병리학적 및 면역병리학적 특징을 밝히고 가와사키병에 대한 표적 치료 전략의 개발을 촉진할 수 있습니다.

초록

가와사키병(KD)은 주로 어린이에게 영향을 미치는 전신성 혈관염으로, 관상동맥 병변이 가장 심각한 합병증입니다. 본 연구에서는 칸디다 알비칸스 (CAWS)의 수용성 추출물을 이용하여 최적화된 마우스 KD 모델을 구축하였다. 심근 염증 및 관련 병리학적 변화는 HE 염색 및 Masson trichrome 염색을 사용하여 평가되었습니다. 면역형광 기술은 심장 조직에서 면역 세포의 침윤을 감지했습니다. 심근 조직에서 VDAC1 단백질의 발현 및 국소화는 면역조직화학에 의해 검출되었습니다. 시험관 내에서 RAW264.7 대식세포와 칸디다 알비칸스 포자를 공동 배양하여 식세포 모델을 확립하고, LC3 면역형광 염색과 Lyso-Tracker Red 프로브를 사용하여 자가포식리소좀의 형성 및 기능을 평가하였다. 용량 스크리닝을 통해 8mg이 관상동맥 염증 유발을 위한 최적의 모델링 용량이며 이 용량에서 중간 정도의 사망률을 보이는 것으로 결정되었습니다. HE 염색은 CAWS 주사가 마우스에서 인간 가와사키병의 특성과 일치하는 관상 동맥 병변을 안정적으로 유도하는 것으로 나타났습니다. Masson 염색은 CAWS 그룹의 마우스에서 관상 동맥 및 대동맥 주위에 상당한 콜라겐 섬유 침착이 있었고 이는 염증 부위와 밀접하게 일치하는 것을 확인했으며 14일에 대조군과 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었습니다(p < 0.001). 면역형광 검사에서 모델링 14일째에 CAWS 그룹의 심장 조직에서 다중 면역 세포의 침윤이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(p < 0.001). 면역조직화학적 결과는 모델링 28일째에 CAWS 그룹의 심근 조직에서 VDAC1 단백질의 발현이 유의하게 상향 조절된 것으로 나타났습니다(p < 0.001). 시험관 내 실험에 따르면 칸디다 알비칸스 포자에 감염된 대식세포에서는 초기에는 자가포식리소좀의 형성이 증가하는 반면, 후기에는 자가포식의 흐름이 차단되어 기능 장애를 시사하는 것으로 나타났습니다.

서론

피부 점막 림프절 증후군의 일종인 가와사키병(KD)은 5세 미만의 어린이에게 발생하는 자가면역 질환으로 열성 혈관염을 동반합니다 ^1,2,3. 연구에 따르면 치료되지 않았거나 10일을 초과하는 중증 KD는 주로 관상동맥류 및 관상동맥 협착증을 포함한 심각한 심혈관 합병증을 유발하기 쉽습니다 ^4,5. 관상동맥류의 파열은 심인성 쇼크 또는 급사로 이어질 수 있으며, 이는 소아 후천성 심장병의 주요 원인입니다 ^6,7. 정맥 면역글로불린의 적용으로 예후가 크게 개선되었지만 그 병인과 병인은 불분명하여 표적 치료 전략의 개발이 제한됩니다 ^8,9. 따라서 인간 질병의 특성을 정확하게 시뮬레이션할 수 있는 동물 모델을 구축하는 것이 현재 연구의 시급한 과제가 되었습니다.

현재 가와사키병 연구의 주요 장애물은 인간의 질병 병리를 완전히 요약하는 잘 특성화된 동물 모델이 없다는 것입니다. 현재 개발된 다양한 모델 중 락토바실러스 카제이 세포벽 추출물(LCWE)에 의해 유도된 혈관염 모델은 비교적 성숙한 시스템이며, 이 모델은 관상동맥염을 유발할 수 있습니다. KD 유사 혈관염에서 면역 조절 장애 및 특정 사이토카인의 메커니즘을 연구하는 데 널리 사용됩니다^10,11. 칸디다 알비칸스(CAWS)의 수용성 추출물에 의해 유발된 혈관염 모델도 인간 가와사키병의 병리학적 특징과 높은 유사성으로 인해 많은 주목을 받고 있습니다^12,13. 여러 연구팀의 체계적인 최적화 및 개선 끝에 CAWS 유도 모델은 가와사키병 연구의 중요한 도구로 발전했습니다¹⁴. CAWS는 복강내 주사를 통해 관상동맥 염증을 유발할 수 있지만 인간 KD 혈관염의 정확한 병리학적 과정을 완전히 재현할 수 없다는 한계가 있습니다. 예를 들어, 인간 KD¹⁵의 후기 병리학에서 호중구는 발견되지 않았지만, CAWS 주사¹⁶ 후 최대 16주까지 이 모델에서 호중구 침윤이 여전히 발생했습니다. 더욱이 CAWS로 인한 혈관염의 기전은 현재 완전히 밝혀지지 않았기 때문에 모델⁹에 대한 심층적인 이해와 적용이 제한됩니다. 본 연구는 KAWAS의 유도 프로토콜을 최적화하고, 질병 기전을 밝히고, 표적 치료제 개발을 촉진함으로써 KD의 표준화된 동물 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다.

이 연구는 CAWS를 활용하여 가와사키병의 보다 표준화된 동물 모델을 구축했습니다. 체계적인 용량 최적화 실험을 통해 연속 5일 동안 매일 8mg을 복강내 주사하는 것이 최적의 투여 요법이라고 판단되었습니다. 이 요법은 동물에서 높은 생존율을 유지하면서 관상 동맥 병변을 안정적으로 유도할 수 있습니다. 또한, 염증에서 섬유증으로의 전환 과정에서 미토콘드리아 세포사멸을 조절하는 핵심 단백질인 전압 의존성 음이온 채널 1(VDAC1)의 가능한 메커니즘에 초점을 맞춰 KD의 만성기 동안 섬유증 형성에서 미토콘드리아 기능 장애의 역할을 추가로 조사했습니다¹⁷. 본 연구에서 자가포식체/리소좀 공국소화 분석을 통해 본 모델에서 비정상적인 자가포식 기능이 관찰되었다는 점은 주목할 가치가 있다. 이 최적화된 모델은 가와사키병에서 관상동맥 병변의 병인을 체계적으로 연구하고 새로운 치료 전략을 평가하는 데 중요한 도구를 제공합니다.

프로토콜

동물 데이터와 관련된 모든 연구 실험은 난징 의과대학 부속 화이안 제1 인민병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(KY-2024-250-01). 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. CAWS 준비

1. Duong et ^al.18에 의해 확립된 프로토콜에 따라 Sabouraud 포도당 국물에 Candida albicans를 접종합니다. 그런 다음 접종된 국물을 가스 혼합물이 있는 밀봉된 혐기성 챔버에서 37°C에서 48시간 동안 혐기적으로 배양합니다.
   참고: 배양 배지의 멸균성을 보장하려면 37°C의 혐기성 배양 조건을 엄격하게 제어하여 기타 박테리아에 의한 오염을 방지해야 합니다.
2. C-제한 배지로 반복적으로 헹구고 37°C에서 4.5 x g의 회전 속도로 48시간 동안 배양합니다.
3. 같은 부피의 무수 에탄올을 넣고 4°C에서 밤새 그대로 둡니다.
4. 4.5 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 침전물에 같은 부피의 무수 에탄올을 첨가하고, 4°C에서 하룻밤 동안 그대로 두는다.
5. 원심분리 후 상청액을 버리고 침전물에 아세톤 50mL를 첨가하고 원심분리하여 침전물을 건조시킵니다. 나중에 사용할 수 있도록 침전물을 멸균 생리 식염수에 녹입니다.

2. 가와사키병의 마우스 모델 구축

1. 4-6주 된 80마리의 SPF 등급 수컷 C57BL/6 마우스를 선택하여 음식과 물을 자유롭게 접근할 수 있는 통제된 조건에서 사육합니다.
   참고: 면역 및 염증 반응에 대한 에스트로겐 수준 변동의 잠재적 간섭을 최소화하기 위해 이 예비 모델 구축 및 특성화 연구¹⁹에서 수컷 마우스만 사용되었습니다.
2. 마우스를 난수표 방법으로 3개의 서로 다른 용량의 CAWS 주사군(4mg, 8mg, 12mg)과 1개의 생리 식염수 대조군을 포함하여 각 그룹에 20마리의 마우스를 포함하여 4개 그룹으로 균등하게 나눕니다.
3. 멸균 생리 식염수(0.9% NaCl)를 사용하여 CAWS 분말을 40mg/mL, 80mg/mL 및 120mg/mL의 세 가지 농도로 준비합니다. 실험군은 실험 1일부터 5일까지 아침에 CAWS 0.1mL를 주입하고, 대조군에는 동일한 일정으로 같은 양의 생리 식염수를 투여한다.
   참고: 복강내 주사는 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 수행되었습니다. 작동 시 마우스를 머리는 낮고 꼬리는 높게 위치시켜 주사기를 삽입할 때 대장, 소장 등의 장기가 손상되는 것을 방지하세요.
4. 매일 오전 9시에 전자 저울을 사용하여 피더에 남아 있는 사료의 무게를 동시에 측정하고 각 생쥐 케이지에 대한 24시간 식품 소비량을 계산합니다.
5. 마지막 주사 후 3일, 7일, 14일, 28일에 각 시점에서 각 그룹에서 3마리의 마우스를 무작위로 선택하여 희생합니다.
6. 실내 공기로 미리 채워진 밀폐된 챔버에 마우스를 놓습니다. 분당 챔버 부피의 30%의 유속으로 압축된_{CO 2} 를 도입합니다. 5분 후 사망을 확인하기 위해 자궁경부 탈구를 시행하였다.
7. 심장 표본을 수집하고 무게를 측정합니다. HE 염색으로 심장과 혈관의 염증성 병변을 관찰합니다.

3. HE 염색 및 등급 표준

1. 심장과 대동맥궁(약 3mm × 3mm)이 빠르게 분리되었습니다. 설명된 방법⁽²⁰)에 따라 정중 흉골 절개술을 수행한다. 대동맥궁에서 심장을 빠르게 분리합니다(약 3mm × 3mm). 수집된 조직을 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정했습니다.
2. 고정 후, 등급이 매겨진 에탄올 시리즈(1시간 동안 70% 에탄올, 1시간 동안 80% 에탄올, 1시간 동안 95% 에탄올, 1시간 동안 100% 에탄올)를 통해 조직을 탈수하고 자일렌에서 투명하게 하고 파라핀에 포매합니다. 마지막으로 블록을 5μm 연속 슬라이스로 분할합니다.
3. H&E 염색의 경우 헤마톡실린으로 절편을 5분 동안 염색하고 흐르는 물에 10분 동안 헹구고 에오신으로 2분 동안 대변염색한 후 탈수 및 마운팅을 진행합니다²¹.
   참고: 혈관 내막 손상의 정도에 따라 세 가지 등급으로 분류됩니다. 등급 I은 주로 내피 부종 및 호중구 응집을 특징으로 합니다. 등급 II는 평활근 변성, 염증 세포 침윤 및 소기관 손상으로 나타납니다. 등급 III은 내피 괴사 및 탈락, 피브린 침착과 같은 심각한 병변을 나타냅니다.

4. 마슨 삼색 염색

1. 고정 후, 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 조직 샘플을 탈수하고 자일렌에서 투명하게 하고 파라핀에 포매합니다.
2. 탈랍 후, 염색을 준비하기 위해 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 증류수로 절편을 수화시킵니다.
3. Weigert의 철 헤마톡실린으로 핵을 5분 동안 염색하고 흐르는 물에 완전히 헹구고 세포질을 Lichun Red acid fuchsin으로 5분 동안 염색합니다.
4. 1% 포스포몰리브드산으로 1분 동안 감별한 다음 콜라겐 섬유를 아닐린 블루로 3분 동안 직접 염색합니다. 1% 빙초산으로 빠르게 헹굽니다.
   참고: 염색 특이성을 보장하기 위해 분화 단계의 시기를 엄격하게 제어하십시오.
5. 에탄올과 자일렌으로 탈수하여 투명해진 후 중성 필름을 밀봉합니다.
6. 흐르는 물에 얼룩진 부분을 헹구어 여분의 염료를 제거합니다.
7. 자일렌으로 투명한 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 절편을 탈수하고 중성 검으로 장착합니다.
8. 광학 현미경으로 일정한 배율로 절편을 관찰합니다. 콜라겐 섬유는 파란색, 근육 섬유와 세포질은 빨간색, 핵은 짙은 파란색으로 나타나야 합니다.

5. 면역형광염색

1. 세포 또는 조직 절편을 고정하고 5% BSA로 1시간 동안 차단하여 비특이적 결합을 줄입니다.
2. 2차 항체와 동일한 종 기원의 정상 혈청을 사용하여 PBS로 1:10 비율로 희석한 후 샘플에 떨어뜨립니다. 실온에서 30분 동안 밀봉합니다. 밀봉 후 PBS로 부드럽게 두 번 헹굽니다.
3. 절편을 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다. PBS로 세척한 후 형광 2차 항체를 첨가하고 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다.
4. DAPI로 코어를 염색하고 담금질 방지 설치제로 밀봉하고 공초점 현미경으로 관찰합니다.

6. 면역조직화학

1. 파라핀 절편의 탈랍 및 수화 후 항원 복구를 수행하고 내인성 과산화효소를 차단합니다.
2. 항체 배양 및 발색: 먼저 정상 혈청으로 차단한 다음 1차 항체와 HRP 표지 2차 항체를 순서대로 배양하고 마지막으로 DAB 발색을 합니다. 현미경으로 반응도를 조절합니다.
3. 세포핵을 헤마톡실린으로 다시 염색합니다. 탈수 및 투명화 후 플레이트를 밀봉하고 현미경으로 갈색을 띤 노란색 양성 신호를 관찰합니다.
   참고: 실험은 대조군을 설정하고 복원 및 발색 조건을 엄격하게 제어해야 합니다.

7. 자가용소좀 검출

1. RAW264.7 대식세포를 칸디다 알비칸스 포자와 적절한 비율(10:1)으로 공동 배양하고 37°C 및 5%_CO2 에서 4시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 28시간, 32시간, 36시간, 40시간, 44시간 및 48시간 동안 배양하여 식세포 모델을 확립합니다.
2. 비식세포 포자를 제거하기 위해 예식된 PBS로 세 번 세척합니다.
3. 먼저 5% BSA로 샘플을 30분 동안 차단합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 LC3에 대한 1차 항체(1:200 희석)와 연속적으로 배양한 다음 Alexa Fluor 488 표지 2차 항체를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. Lyso-Tracker Red 리소좀 프로브를 세포에 직접 추가하여 리소좀 국소화를 시각화합니다. 마지막으로, DAPI(1μg/mL)로 핵을 5분 동안 대조염색합니다.
   참고: 항체의 배양 시간과 농도가 정확하게 제어되도록 전체 작업 과정은 어둠 속에서 수행되어야 합니다.

결과

처음에 우리는 생쥐에서 다양한 용량의 CAWS에 의해 유도된 심근 병리학적 변화를 체계적으로 평가했습니다. PBS 대조군, 4mg CAWS 그룹 및 8mg CAWS 그룹(각 그룹에서 n=20)에서 사망은 관찰되지 않았습니다. 대조적으로, 4mg 그룹의 염증 반응은 경미했으며 모델링 요구 사항을 충족하지 못했습니다. 사망률은 12mg CAWS군(9/20, 45%)에서 높았고, 주사 후 3일째부터 10일째까지 사망이 발생했다. 이러한 결과는 12mg의 용량이 과도한 국소 염증 손상 및 전신 독성을 유발할 수 있음을 시사합니다. 따라서 이 용량은 후속 연구에서 제외되었습니다. 8mg 용량은 허용 가능한 생존율과 최소한의 국소 이상반응을 유지하면서 심각한 관상동맥염을 효과적으로 유도할 수 있기 때문에 최종적으로 최적의 투여 요법으로 선택되었습니다. (그림 1A). ...

토론

KD의 관상동맥류(CAA)와 심근섬유증은 장기적인 심혈관 사건의 주요 원인입니다. 급성기 치료의 진전에도 불구하고 환자의 약 5%는 여전히 지속적인 CAA가 발생합니다^28,29. 이러한 지연된 병리학적 변화의 메커니즘은 아직 불분명하며, 동물 모델이 그 동적 과정을 밝히는 것이 시급합니다³⁰. 인간 KD 환자의 심장 조직 샘플이 극히 제한되어 있고 관상 동맥과 심근의 장기적인 변화를 동적으로 추적하는 임상 연구의 어려움으로 인해 급성 혈관염에서 만성 섬유증에 이르기까지 KD의 전체 과정을 시뮬레이션하여 기본 메커니즘을 밝히고 개입 전략을 탐색할 수 있는 동물 모델이 시급히 필요합니다^{16, 30}.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
토끼 IgG 알렉사 플루오 488에 대한 염소 2차 항체	ABCAM	AB15081	토끼 IgG 알렉사 플루오 488에 대한 염소 2차 항체
혐기성 챔버	써모 사이언티픽	써모 사이언티픽	혐기성 챔버
아닐린 블루	솔라비오	G3668	아닐린 블루
안티-LC3	ABCAM	AB192890	LC3에 대한 1차 항체입니다
생물학적 안전 캐비닛	써모 사이언티픽	1500	생물학적 안전 캐비닛
BSA	솔라비오	A8020	BSA
칸디다 알비칸스 (균주)	NBRC	1385	칸디다 알비칸스 (균주)
CD3e	BD 생명과학	561827	FITC 햄스터 안티마우스 CD3e(145-2C11)
CD86	BD 생명과학	105013	CD86
CD8a	BD 생명과학	100713	CD8a
세포 배양 인큐베이터	써모 사이언티픽	311	세포 배양 인큐베이터
원심 분리기	써모 사이언티픽	ST4R 플러스	원심 분리기
공초점 현미경	올림푸스	IX73	공초점 현미경
다피	비요타임 바이오테크놀로지	P0131-25ml	다피
DMEM	깁코	11965126	DMEM
임베딩 머신	P.S.J 메디컬	BM450A	임베딩 머신
이오신	솔라비오	그리고 nbsp; G1100	이오신
F4/80	BD 생명과학	123109	F4/80
FBS	깁코	16000044	FBS
포름알데히드	솔라비오	그리고 nbsp; P1110	포름알데히드
완전 자동 조직 탈수기	라이카 바이오시스템	ASP3005	완전 자동 조직 탈수기
유리 현미경 슬라이드	시토테스트	250124A1	유리 현미경 슬라이드
H& E 염료	비요타임 바이오테크놀로지	C0105M	H& E 염료
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LC3 프로브	비요타임 바이오테크놀로지	C3018M	LC3 프로브
로우 프로파일 미크토름 블레이드	써모피셔	3052835	로우 프로파일 미크토름 블레이드
리소좀 프로브	비요타임 바이오테크놀로지	C1046	리소좀 프로브
마커 펜	델리	SK109	마커 펜
마송 염료	비요타임 바이오테크놀로지	C0189M	마송 염료
미세토름	라이카 바이오시스템	히스토코어 바이오컷	미세토름
중성 검	솔라르비	그리고 nbsp; G8590	중성 검
NK1.1	BD 생명과학	561117	NK1.1
광학 현미경	니콘	니콘	광학 현미경
파라핀	솔라비오	그리고 nbsp; YA0012	파라핀
석랍	솔라비오	YA0012	석랍
PBS	솔라비오	P1020	PBS
인산몰리브딘산	솔라비오	G3472	인산몰리브딘산
VDAC1	앱캠	AB34726	안티-VDAC1