염색질 및 후생유전학적 노화의 영상 기반 바이오마커를 이용한 단일 세포 노화 측정

요약

프로토콜은 영상 기반 염색질 및 후생유전학적 연령(ImAge)을 추출하고 검증하기 위한 영상 및 계산 워크플로우를 제시합니다.

초록

개인 맞춤형 의료 발전과 잠재적 회춘 전략 평가를 위해서는 생물학적 나이를 반영하는 바이오마커가 매우 중요합니다. 우리는 단일 핵 내 염색질과 후생유전학적 표식의 공간적 조직에서 유도된 영상 기반 바이오마커인 영상 기반 염색질 및 후생유전학적 연령(ImAge)을 도입하여 내재적 연령 관련 변화를 포착합니다. ImAge는 생물학적 연령 조절 중재의 효과를 효과적으로 포착하고 정량화하며, 회춘 전략(예: 칼로리 제한 및 일시적 Oct4, Sox2, Klf4, Myc(OSKM) 발현을 통한 부분적 재프로그래밍) 후 유의미한 감소와 화학요법 같은 치료 후 증가하는 민감도를 보여줍니다. 더불어, 낮은 ImAge는 운동 활동 증가와 상관관계가 있어, 기능적 개선과 생물학적 연령 역전을 함께 포착함을 시사하며, 장수 개입을 평가할 수 있는 유망한 단일 세포 도구를 제공합니다. ImAge는 고품질 영상과 세밀한 계산 분석이 필요한 통합 방법이므로, 이를 추출하고 검증하는 데 대한 철저한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 종합 프로토콜은 습식 실험실 절차(샘플 준비 및 영상 검사)와 오픈소스 계산 파이프라인(환경 설정 및 영상 처리 등)을 적절히 활용하여 ImAge를 추출하고 검증하는 워크플로우를 상세히 설명합니다.

서론

평균 수명 증가와 전 세계 인구 고령화는 기능적 또는 생물학적 연령의 효과적인 바이오마커의 필요성을 강조합니다^{. 1,2,3}. 이 바이오마커들은 질병 위험과 수명을 정확히 예측하는 데 필수적이며, 이는 노인 치료를 크게 향상시키고 관련 비용을 줄일 수 있습니다. DNA 메틸화(DNAm) 시계는 생물학적 노화^정량화에 주목할 만한 진전을 이루^었지만, 종종 선형 회귀에 의존하며 대규모 코호트를 필요로 하므로, 개인에 특화된 미묘하고 맥락 의존적인 생물학적 구성 요소를 간과할 수 있습니다 ^7,8. 더불어, 이러한 시퀀싱 기반 기법은 세포 분해, 복잡한 샘플 준비, 각 세포마다 고가의 시약을 필요로 하여, 샘플 파괴가^불리한 고처리량, 대규모 또는 종단 연구에서 비용이 더 많이 들고 도전적입니다.

이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 단일 세포 해상도로 노화와 재생을 정량화하는 새로운 기법인 영상 기반 염색질 및 후생유전학적 연령(ImAge)을 개발했습니다. 이 기술은 Alvarez-Kuglen 등에 의해 설명된 대로 쥐의 말초혈액과 다양한 고형 장기에서 적용되고 검증^{되었습니다.} 이 출판물은 최적화된 프로토콜을 자세히 설명하여 다른 연구자들이 다양한 응용 분야에 맞게 적응하고 채택할 수 있도록 합니다.

이 접근법은 단일 핵¹ 내 염색질과 후생유전학적 표시의 공간적 조직을 기반으로 고유한 연령 관련 궤적을 포착한다는 점에서 전통적인 DNAm 시계와 근본적으로 다릅니다. 영상 기반 방법은 고유한 장점을 제공합니다: 본질적으로 비파괴적이어서 시퀀싱 기반 방법과 달리 세포가 처리 과정에서 파괴되지 않습니다. 이러한 비파괴적 특성은 단일 세포 수준에서 크로마틴과 후생유전학적 표식의 공간 구조를 보존할 수 있게 해주며, 조직 내 세포의 공간적 맥락을 유지할 수 있게 해줍니다. 이는 기존 시퀀싱 워크플로우에서 종종 간과되는 관점입니다. 더불어, 영상 기술은 대규모 또는 종단 연구에 비용 효율적이며, 고가의 시약이나 세포당 복잡한 라이브러리 준비가 필요 없어 시간에 따른 반복 관찰에 적합하다^10,11.

ImAge의 주요 장점 중 하나는 연대적 연령에 따른 회귀 없이도 연령 관련 궤적을 데이터의 본질적 주요 특징으로 드러낼 수 있다는 점입니다. ImAge는 쥐의 말초혈, 단핵세포, 다양한 고형 장기에서 연대적 연령과 강한 상관관계를 입증^{했습니다.} 중요한 점은, ImAge가 생물학적 연령에 대한 예상 교란을 효과적으로 포착하며, 화학요법 치료 후 증가와 간 및 골격근에서 일시적인 OSKM 발현에 의한 칼로리 제한과 부분 재프로그래밍 시 감소를 보여준다는 점입니다. 더불어, ImAge 측정값은 동일 시간대의 쥐에서 운동 활동과 역상관관계를 보이며, 이는 생물학적 및 기능적 연령의 측면을 측정하는 데 유용함을 나타냅니다.

ImAge 방법론을 구현하려면 습식 실험실 실험 절차¹² 와 계산 분석¹ (그림 1)에 대한 전문성이 필요합니다; 따라서 본 논문은 두 측면에 대한 포괄적이고 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 최적화된 프로토콜은 ImAge의 광범위한 채택을 촉진하여 연구자들이 다양한 세포 유형과 조직에서 단일 세포 해상도로 염색질과 후생유전학적 조직의 연령 관련 변화를 조사할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜에서는 ImAge 판별에 충분한 대비와 해상도를 제공하는 두 마커인 H3K27ac와 H3K27me3가 대표적인 마크로 선택되었습니다. 연구자들은 이 프로토콜을 복제하여 생물학적 노화를 정량화하고, 장수 개입의 영향을 평가하며, 개별 유기체 수준에서 노화 및 재생 과정 내재적 이질성을 탐구할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 스크립스 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 지침과 프로토콜(프로토콜 09-0004-6)에 따라 수행됩니다. 이 원고에 제시된 데이터는 2개월에서 14개월 사이의 수컷 i4F 마우스를 대상으로 수집되었습니다. 관심 장기(간과 골격근)는 13.8개월 된 i4F 및 형제 대조군 쥐로부터 1주일간 저용량 독시사이클린(0.2 mg/ml)으로 투여된 쥐에서 채취하였다¹⁴. 핵은 젊은 개체(3.2개월), 연령(13.8개월), 그리고 OSKM 인자 과발현을 위해 독시사이클린으로 처리된 연령 상태(연령 조절 대상)에서 분리되었습니다.

1. 샘플의 이미징

1. 샘플 준비
   1. 신선히 해부한 쥐(또는 관심 있는 다른 종)에서 관심 있는 장기(간과 골격근)를 채취하여 액체 질소로 급속 냉동하세요. 샘플을 -80 °C에서 보관하여 사용 준비가 될 때까지 보관하세요.
   2. 장기와 조직을 미리 냉각된 모르타르에 옮겨 드라이아이스 위에 올려놓으세요. 액체 질소를 얼린 조직 위에 부고 미리 차갑게 해둔 공으로 갈아줍니다. 미리 냉각된 모르타르와 공을 사용해 균일하게 미세한 가루를 얻을 때까지 샘플을 분쇄합니다.
   3. 미리 냉각된 금속 주걱을 사용해 다루는 조직을 여러 관에 나누어 사용하지 않은 샘플을 -80°C에 보관합니다.
      참고: 튜브 내 지상 조직 샘플은 -80 °C에서 보관하거나 핵 분리를 진행할 수 있습니다.
   4. 제조사 지침에 따라 시판된 핵 용해 완충 키트를 사용하여 냉동 알리코트에서 핵을 추출합니다.
   5. Trypan Blue를 사용해 핵을 세세요. 핵과 트라이판 블루를 같은 비율로 별도의 튜브에 섞으세요. 핵-트리판 블루 용액 10 μl을 혈구계 또는 자동 세포 계수기에 옮깁니다.
   6. PBS + 0.5% BSA로 희석하여 10,000개의 핵을 20-30 μL/웰 부피에 도금할 수 있도록 합니다.
2. 도금 준비
   1. 도금 준비 및 계산 분석에 필요한 모든 관련 메타데이터를 Platemap( 보조 파일 1에 제공)에 입력하세요. 샘플 식별자(예: 숫자나 문자)를 실제 웰 플레이트와 동일한 레이아웃으로 샘플ID 탭에 기록하세요. 시료의 연식을 포함한 실험 조건을 실제 웰 플레이트와 동일한 레이아웃으로 상태 탭에 기록하세요.
      참고: 상태 탭에 제공된 정보는 각 샘플의 연령대(즉, 젊은이인지 노인인지)를 식별하는 데 사용됩니다. 이 확인된 연령대는 이후 노화 예측 모델(ImAge) 구축의 참고 자료로 활용될 것입니다. 따라서 조건 탭에는 나이와 연관될 수 있는 데이터와 필요에 따라 다른 관련 실험 조건도 포함되어야 합니다.
   2. 채널#(#은 숫자로 대체됨) 탭의 실제 웰 플레이트와 동일한 레이아웃으로 표적 바이오마커(예: H3K27me3)를 기록하세요. 모든 메타데이터 조합이 일치하고 플레이트맵 탭의 연속된 표 형식에 올바르게 반영되는지 확인하세요.
      참고: 테이블의 각 열은 지정된 탭 이름(예: "sampleID")에 대응해야 합니다. 프로젝트 목표를 문서화하고 세부 사항을 염색하기 위해 "메타데이터"라는 추가 탭이 제공됩니다; 이 정보는 데이터 분석에 활용되지 않습니다. 필요하다고 판단되면 이 탭을 활용하세요.
   3. 탭 플레이트맵을 짧고 설명적인 프로젝트 이름(예: project.csv)이 포함된 CSV 파일 형식으로 내보내세요.
      참고: 메타데이터 탭은 프로젝트 목표와 면역 염색 정보를 요약하는 템플릿을 제공합니다. 플레이트맵 템플릿의 메타데이터 탭 사용은 도금 과정 자체에 대해 선택 사항입니다. 하지만 계산 분석을 위해서는 sampleID, channel#(#는 숫자로 대체됨) 등 다른 탭들이 필요합니다.
3. 웰 플레이트(예: 384웰 플레이트)에서 20-30 μL 부피에 10,000개의 핵을 플레이트링합니다. 1,000 x g(가속도 9, 감속 4)에서 4°C에서 10분간 회전판을 사용한다.
4. 8% 파라포름알데히드(PFA) 1:1 부피를 PBS에 넣어 상온에서 10분간 정착합니다.
   주의: 배기함 구역에서 PFA 절차를 수행하고 기관 안전 절차에 따라 폐기물을 처리하십시오.
5. 용액을 제거하세요. 0.1M 글리신 30 μL 액체를 PBS에 실온에서 5분간 첨가합니다. 용액을 제거하세요. PBS 100 μL 2배로 세척하고 저장 시 PBS 30 μL를 추가하세요.
   참고: 세포는 4°C에 보관하거나 즉시 면역표지로 진행할 수 있습니다.
6. 면역 표지
   1. PBS를 제거하세요. 30 μL 블로킹 용액(2% BSA 및 0.5% Triton X-100 in PBS)을 추가하고 상온에서 1시간 배큐합니다. 차단액을 제거하세요.
   2. 1차 항체 25 μL을 첨가합니다: 마우스 항-H3K27ac(1:250)와 토끼 항-H3K27me3(1:250)을 차단 버퍼(0.4 - 2 μg/mL)에 희석한 상태입니다. 4°C에서 하룻밤 부양하세요.
   3. 1차 항체 용액을 제거하세요. 100 μL PBS로 3회 실온에서 3분간 세척하세요.
   4. 2차 항체 25 μL을 첨가합니다: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse(1:250)와 Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250)을 차단 완충제(1 - 10 μg/mL)에 희석한 상태입니다. 4 °C에서 2시간 또는 상온에서 1시간 배양하세요.
   5. 100 μL PBS로 3회 실온에서 3분간 세척하세요. 30 μL, 농도 0.01 mg/mL에 DAPI/Hoechst 염색. PBS 100 μL로 세척하세요.
      참고: 플레이트는 4°C에 호일에 보관하거나 즉시 영상 촬영을 진행하세요. 핵 분할 단계에는 DAPI/Hoechst가 필요합니다.
7. 영상
   1. 최대 해상도를 위해 고함량 이미저의 이미지 셀(이 데이터 세트에서는 20배 사용, 63배 권장).
      참고: 이미징은 모든 고콘텐츠 이미저로 수행할 수 있지만, 이 프로토콜은 획득한 이미지의 평면 폴더 구조와 획득된 이미지 출력으로 일반적인 이미지 형식(예: .tiff)을 가정합니다(그림 2).
   2. 웰당 여러 필드와 여러 개의 z-스택을 수집하여, 이상적으로는 셀 핵의 위에서 아래까지 모두 덮어야 합니다. 10 μm 범위와 z축(예: 0.5 μm z-스텝에서 20개의 z-슬라이스)은 일반적으로 대부분의 마우스 세포 핵을 덮습니다. 크기와 필요한 커버리는 관심 있는 종과 세포 유형에 따라 다릅니다. 대표적인 영상은 그림 3에 나와 있습니다.
   3. 이미지 데이터를 컴퓨터로 전송하여 계산 분석이 수행되며, 이는 그림 2에 제시된 폴더 구조에 따라 수행됩니다.
   4. 위 1.2.2단계에서 정의한 프로젝트 이름의 대괄호 주석 접두사를 이미지 데이터 폴더(예: [project]original_folder_name)에 추가하세요.

2. 영상 데이터의 계산 분석

1. 시스템 소프트웨어 요구사항 준비 (초기 설정에만 필요)
   1. Windows 컴퓨터에서 동작할 경우 https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install 의 지침을 따라 Windows Subsystem for Linux(WSL)를 설치하세요. https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main 의 지침을 따라 Anaconda 또는 Miniconda를 설치하세요
2. 계산 환경 준비 (초기 설정에만 필요)
   1. github 저장소 https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow 에서 워크플로우 스크립트를 다운로드하세요. 다운로드한 파일을 압축 해제하세요.
      참고: 데이터 저장 위치는 임의로 지정할 수 있습니다; 하지만 시스템 파일 저장 위치와 별개의 디렉터리(예: Windows의 C 드라이브)를 선택하는 것이 권장됩니다.
   2. 복제된 ImAge 저장소를 적절한 스크립트 실행을 위해 가정된 폴더 구조에 맞게 조직하세요(그림 2).
   3. 리눅스나 macOS에서 작동한다면 터미널 앱을 열어보세요. Windows에서 작동한다면 WSL 앱을 열어보세요.
   4. 복제된 저장소 파일로 폴더를 변경하세요. 따라서 Command: 용어는 후속 코드를 터미널 애플리케이션에 복사하여 붙여넣은 후 Enter 키를 누르는 명령어를 의미합니다.
      명령: CD /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      참고: "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY"를 사용자 전용 설정으로 대체하세요. 예를 들어, 저장소가 D 드라이브의 "analysis" 폴더에서 압축을 해제하고 WSL에서 접근할 때는 "/mnt/d/analysis"가 됩니다.
   5. Anaconda/miniconda로 설치된 명령줄 애플리케이션인 conda를 사용해 Python 버전 3.10으로 새로운 계산 환경을 만듭니다.
      명령어: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
   6. 새로 만들어진 환경을 활성화하세요.
      명령: 콘다 활성화 ImAge_workflow
   7. pip installer(ImAge_workflow 환경 생성 시 설치된 파이썬 패키지 설치 프로그램)를 사용해 poetry(파이썬 패키지 관리자)를 설치하세요.
      명령: pip install poetry
   8. poetry를 사용해 필수 Python 패키지를 설치하세요.
      명령어: 시 설치
      주의: 현재 폴더가 ImAge_workflow 폴더인지 확인하세요. pwd 명령어를 실행하면 확인할 수 있습니다.
   9. Conda 환경 내에서 CUDA를 세그멘테이션 단계에서 그래픽 처리 장치(GPU) 기능을 활성화하도록 설정하여 더 빠른 계산을 가능하게 합니다(이는 Nvidia GPU가 탑재된 리눅스 또는 Windows PC에만 적용됨).
      명령어: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      에코 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(이름명 $(파이썬 -c "Nvidia를 가져오기; print(nvidia.__file__)")' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      에코 '$NVIDIA_PACKAGE_DIR/*의 DIR에 대해 말한다; [ -d "$dir/lib" ]를 선택하면 do; 그 다음 내보내기 LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; Fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      참고: 스크립트는 서버의 GPU 가용성을 자동으로 감지합니다. GPU가 없으면 기본적으로 CPU에서 실행됩니다.
3. 아래에 설명된 계산을 실행하세요.
   참고: 계산 분석은 핵 분할, 이미지 특징 추출, 노화(ImAge) 축 구축, 그리고 ImAge 예측의 네 단계로 구성됩니다. 각 프로세스는 파이썬 스크립트를 사용해 수행됩니다; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features, 그리고 o4_ImAge_validation. 이 모든 단계는 하나의 파이썬 스크립트, main.py 에 포함되어 있습니다. 추출된 ImAge 판독값은 다음과 같이 박스 및 바이올린 플롯을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 그림 4. ImAge 읽기구는 샘플을 행으로 표현하고, 해당 판독값과 메타데이터를 열로 나타내는 간단한 테이블 형식(표준 .csv 파일 포맷으로도 추출할 수 있습니다. 사용자는 필요에 따라 ImAge 판독값에 대해 추가 수치 분석을 수행할 수 있는 유연성을 가집니다. 이 그래프들과 CSV 파일은 파이썬 스크립트 visualization.py 를 사용해 얻을 수 있습니다. ImAge 예측 과정은 동일 조직 내 개별 세포에서 얻은 부트스트랩 신호를 활용합니다. 이 부트스트랩 신호들은 무작위 샘플링과 반복 반복에서 도출된 평균화된 신호입니다. 이 접근법은 분석이 가장 신뢰할 수 있고 대표성 있는 측정값을 포착하도록 하는 것을 목표로 하며, 분석의 불확실성은 조직의 고유한 이질성에 비례합니다.
   1. 리눅스나 macOS에서 작동한다면 터미널 앱을 열어보세요. Windows에서 작동한다면 WSL 앱을 열어보세요.
      명령: CD /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      주의: 현재 폴더가 ImAge_workflow 폴더인지 확인하세요. pwd 명령어를 실행하면 확인할 수 있습니다.
   2. 환경을 활성화하세요.
      명령: 콘다 활성화 ImAge_workflow
   3. 코드 또는 텍스트 편집기(예: 노트패드 앱, Microsoft Visual Studio Code 등)에서 워크플로우/main.py 파일의 분석 매개변수를 설정하세요.
      1. 변수 p의 프로젝트 이름을 출력을 정리하는 데 사용되는 짧고 파일 시스템에 안전한 식별자로 설정하세요(예: p = brain_3ages_k27me3).
      2. chs에서 특징 추출을 위한 채널 목록을 설정하세요. 분석에 해당 채널의 특징이 필요하다면 분할 채널을 포함하세요 (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. imageIndex를 사용하여 파일 이름에서 플레이트 맵 열로 이미지 채널 식별자를 매핑합니다. 영상 시스템이 이미지 데이터를 획득할 때 사용하는 채널 라벨 형식을 결정하고 그 라벨을 키로 사용합니다. 각 라벨을 1.2.2 단계에서 저장된 플레이트맵의 정확한 대문자 구분 열 헤더에 매핑하세요(예: imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
         주의: 열명은 대문자에 구분되며, 번호판 지도 파일에 반드시 일치해야 합니다.
      4. 데이터 위치를 설정하세요: orgDataLoadPath를 데이터셋 루트에, orgDataSubFolder를 이미지 하위 폴더에 배치하고, resultsSavePath를 출력 루트로 설정하세요.
      5. imageFileFormat에서 파일 확장자를 확인하고, imageFileRegEx를 편집하여 필요한 모든 부분(row, col, field, zposition, channel)에 대해 Python 이름 캡처 그룹을 사용하세요. 다음 문법을 사용하세요: (? 여기서 P\d+), 여기서 GROUP은 행, 콜, 필드, zposition, 채널로 대체됩니다.
         참고: 파일명이 다를 경우 정규식을 업데이트하세요; 모든 명명된 그룹은 올바르게 구문 처리해야 합니다. 예를 들어, 파일 이름r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff 다음과 같이 변환해야 합니다: r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. segmentation_ch의 분할 채널을 물체 탐지에 사용되는 핵 채널(예: segmentation_ch = 'DAPI')로 설정하세요.
      7. illumiCorrection을 설정하여 조명 보정 사용 여부를 결정하세요. True로 설정하여 BaSiC 모델을 계산하고 적용하세요; 원본 이미지를 처리하려면 False로 설정하세요.
         참고: 25개의 웰을 가진 플레이트의 경우, 체계적 편향을 줄이기 위해 조명 보정≥ 권장됩니다.
      8. 물리적 복셀 크기를 마이크로미터 단위로 설정하세요 voxel_dim [z, y, x]. 현미경 메타데이터를 사용하여 간격을 결정합니다(예: voxel_dim = [1.0, 0.6, 0.6]). 파일을 저장하고 각 매개변수를 검증한 후 편집기를 닫으세요
   4. ImAge 판독값을 얻고 검증을 수행하기 위해 스크립트를 실행하세요. 스크립트를 실행할 때는 터미널이나 WSL 앱을 닫지 마세요.
      명령: 파이썬 워크플로우/main.py
      참고: 스크립트(main.py)는 기본적으로 세분화, 특징 추출, ImAge 축 생성, 예측 등 모든 단계를 포함합니다. 스크립트는 각 단계(예: 핵 분할)에 대해 예상 완료 시간을 생성합니다. 각 프로세스(예: o1_illumination_correction)는 각 프로세스의 결과를 담은 .pickle 형식의 중간 파일을 생성합니다. 하지만 이는 프로세스 간 데이터 전송을 위한 표준화된 처리를 위한 것이며, 이 글에서 사용자 조작을 위한 것은 아닙니다. 그럼에도 불구하고, 사용자가 이 파일들을 조작하거나 채택해야 한다면, 각 Python 함수에 포함된 데이터 형태와 타입¹³에 관한 문서를 참고하세요.
   5. 결과를 시각화하고 원시 ImAge 판독값을 내보내 외부 소프트웨어에서 추가 분석을 할 수 있습니다. 명령어: 파이썬 워크플로우/visualization.py
      참고: 이 단계는 ImAge 판독값의 도표와 표를 생성하며, 파일들은 각각 fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN와 export_o4_ImAge_validation에 위치해 있습니다(그림 2).

결과

대표적인 이미지는 단일 세포를 얻기 위해 충분히 채워야 하지만, 개별 핵이 서로 접촉하면 세포 핵 분할의 품질이 저하될 수 있으므로 피해야 합니다. 그림 3 은 견고한 계산 분석 결과를 얻기 위한 대표적인 영상을 보여줍니다.

이 방법 원고에 제시된 결과는 Alvarez-Kuglen 등의 ImAge 원고를 차용한 ^{것입니다.} ImAge는 생체 내에서 OSKM에 의해 유도된 부분적 재프로그래밍을 통해 노화 역전을 성공적으로 탐지했습니다(그림 4). OSKM 인자의 유도 발현을 가능하게 하는 유전공학 마우스 모델인 i4F 마우스의 간 및 골격근 조직을 분석하였다. 이 쥐들은 i4F 마우스에서 OSKM 발현을 촉진하는 저용량 독시사이클린으로 처리

토론

샘플 준비
샘플 준비를 위해 관심 있는 조직을 즉시 채취하여 즉시 액체 질소에 급속 냉동하세요. 절구와 공자로 조직을 갈아낼 때는 모르타르에 실리콘 덮개를 씌워 샘플 손실을 방지할 수 있습니다. 조직이 분쇄하기 어렵다면 액체질소를 더 추가하세요. 더 취약한 조직의 경우, 기계적 손상이나 손상을 줄이기 위해 샘플을 냉동 대신 신선하게 처리할 수도 있습니다. 핵 분리 프로토콜은 조직 유형에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다; 제조사 가이드라인을 참고하세요. 핵을 분리하고 계수 후, 384웰 플레이트에서 우물당 최소 20 μL 도금 부피를 확보하여 바닥을 완전히 덮고 균등한 분포를 보장합니다.

도금 준비
핵은 0.5% BSA로 PBS에 현탁 상태로 유지; 세포의 경우, 생존력을 높이기 위해 배지를 사용하세요. 샘플을 얼음 위에 보관하고, 각 웰 중앙에 현...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 혈청 알부민	시그마-올드리치	A9647
당나귀 항마우스 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa 488	인비트로젠	A-21202
당나귀 항토끼 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa 555	인비트로젠	A-31572
글리신	바이오-래드	161-0718
히스톤 H3K27ac 항체 (mAb)	액티브 모티프	39685
히스톤 H3K27me3 항체 (pAb)	액티브 모티프	39155
호에슈트 33342	인비트로젠	H3570
핵 분리 키트: 핵 EZ 준비	시그마-올드리치	NUC101
오페레타 CLS 고콘텐츠 이미저	리비티	https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
파라포름알데히드 16% 수용액 EM 등급	전자현미경 과학	15710-S
PBS	써모피셔	AM9624
페노플레이트 384-웰 마이크로플레이트	리비티	6057302
트리톤-X	시그마	T8787
트라이판 블루 솔루션, 0.4%	깁코와 nbsp;	15250061