체감각 뉴런에서 신경막 프로테아좀의 세포 아형 특이적 분석

Summary

신경 막 프로테아좀(NMP)은 최근 체감각 뉴런의 하위 집합에서 촉각, 통증 및 가려움증 인식의 주요 조절자로 확인되었습니다. 이 기사에서는 세포 분류, 전사체 프로파일링 및 배양 기반 면역형광 분석을 사용하여 세포 유형 특이적 NMP 발현 및 기능을 분석하기 위한 강력한 워크플로우를 제시합니다.

Abstract

감각 뉴런 신호 전달은 기능적 프로테아좀에 의존하며 세포내 국소화는 기능에 영향을 미칩니다. 특수한 프로테아좀 복합체인 신경막 프로테아좀(NMP)은 최근 말초 체감각 뉴런의 하위 집단에서 확인되었습니다. NMP는 체세포의 원형질막과 근위 및 원위 축삭 모두에만 국한됩니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 정상적인 조건에서 NMP가 기계적, 가려움증 및 통증 감각을 매개하는 MrgprA3⁺ 및 Cysltr2⁺ 뉴런에서 주로 발현되는 것으로 나타났습니다. 생쥐의 발 피부에서 급성, 선택적 NMP 억제는 열 감각에 영향을 주지 않고 기계적 및 통증 민감도를 감소시켰습니다. 특히, 전반적인 프로테아좀 억제와 달리 선택적 NMP 억제는 신경병증을 일으키지 않습니다. 시험관 내 연구에 따르면 NMP는 잠재적으로 신호 펩타이드의 방출을 통해 뉴런 간 통신을 촉진하고 자극에 대한 정상적인 뉴런 반응에 필수적입니다. 이러한 발견은 NMP가 정상적인 촉각, 통증 및 가려움증에 필요한 감각 뉴런 누화의 핵심 조절자임을 식별합니다. 따라서 NMP는 통증 관리의 잠재적 대상을 나타냅니다. 이 기사에서는 항체 공급 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 NMP 발현 및 비NMP 발현 뉴런 집단을 모두 분리하는 방법을 제시합니다. 이러한 집단은 scRNA-seq 또는 NMP 발현 역학의 배양 기반 분석을 통한 세포 유형 특이적 발현 프로파일링에 적합합니다. 이러한 방법은 NMP 발현 역학과 통증 관련 질병 상태에 대한 기여도를 조사하기 위한 강력한 워크플로를 제공합니다.

Introduction

프로테아좀 기능은 말초 신경계(PNS)^1,2,3,4,5,6의 최적 발달 및 유지에 필수적입니다. 프로테아좀 억제제를 사용한 시험관 내 및 생체 내 연구는 프로테아좀 활성이 신경 발달, 수초화, 흥분성 및 신경교 세포 기능에 중요하다는 것을 보여줍니다 ^7,8,9,10. 또한, 프로테아좀 억제제 기반 화학 요법은 환자의 30-60%에서 고통스러운 신경병증을 유발하며, 종종 사지의 만성 통증 및 감각 변화를 특징으로 합니다 8,9,11,12,13. 흥미롭게도, 이러한 동일한 억제제의 저용량 투여는 고통스러운 자극에 대한 민감도를 감소시켜 감각 처리에서 프로테아좀의 복잡한 역할을 시사합니다 ^6,14,15. 그러나 이러한 광범위한 연구에도 불구하고 PNS에서 프로테아좀의 특정 기능은 잘 이해되지 않았습니다.

프로테아좀은 생명의 모든 영역에서 주요 단백질 분해 기계이며 단백질 항상성을 유지하는 데 필수적입니다¹⁶. 20S 코어 프로테아좀은 α, β, β α 서브유닛의 4개의 칠량체 고리로 구성되며 유비퀴틴 독립적 단백질 분해를 매개합니다^17,18. 조절 입자와의 결합은 유비퀴틴 의존성 단백질 분해를 매개하는 26S 및 30S 캡 프로테아좀을 형성합니다 ^4,17. 뉴런에서 프로테아좀은 모든 세포 구획에서 확인되었으며, 이들의 세포 내 국소화는 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져^{있습니다 19}. 그러나 일반적으로 사용되는 많은 프로테아좀 억제제는 차등적으로 국소화된 프로테아좀 집단을 선택적으로 표적으로 삼는 특이성이 부족합니다.

실제로, 막 불투과성 프로테아좀 억제제 및 비투과성 세포에서 항체 표지를 사용하여 뉴런 특이적 프로테아좀 복합체가 체감각 뉴런의 하위 집합에서 원형질막에 국한되는 것으로 밝혀졌습니다²⁰. 프로테아좀 서브유닛에 대한 항체 공급 및 FACS 분류를 통해 NMP⁺ 및 NMP^- 집단으로 분리된 일차 후근 신경절(DRG) 뉴런의 scRNA-seq 분석은 20개의 전사적으로 구별되는 세포 클러스터²⁰을 초래했습니다. 추가 분석 결과 NMP⁺ 세포는 20개 클러스터 중 3개에만 클러스터링된 것으로 나타났습니다. 특정 뉴런 아형에 대한 유전자 마커 세트를 사용하여 13개의 서로 다른 체감각 뉴런 아형이 확인되었습니다²⁰. 대부분의 NMP⁺ 뉴런은 MrgprA3⁺ 및 Cysltr2⁺ 감각 뉴런으로 클러스터링되었습니다²⁰. 최소한의 NMP⁺ 세포가 특정 유전자 세트가 확인되지 않은 세 번째 클러스터로 클러스터링되었으므로 이 클러스터는 할당되지 않은 상태로 남았습니다²⁰. MrgprA3⁺ 및 Cysltr2⁺ 뉴런은 각각 CGRP-θ 및 SST 뉴런 하위 유형에 해당하는 열, 기계적 및 소양증 유발 자극에 민감한 C형 통각 수용체입니다^21,22. 확인된 20개의 세포 클러스터 중 7개의 NMP^-클러스터는 슈완 세포, 위성 아교세포 및 면역 세포를 포함하여 비신경 세포와 일치하는 유전자 마커를 발현했으며 할당되지 않은 상태로 남아 있었습니다²⁰. DRG 뉴런 배양 중에 비뉴런과 뉴런 세포를 분리하는 것이 불가능하기 때문에 이러한 세포 집단이 예상되었습니다²⁰.

그 기능을 조사하면, NMP의 시험관 내 억제는 KCl, 히스타민 및 αβ-메틸렌아데노신 5'-삼인산 자극에 대한 신경 흥분성을 변경했습니다²⁰. 생체 내에서 NMP 억제는 열 감각에 영향을 미치지 않으면서 기계적 및 통증 자극에 대한 민감도를 감소시켰습니다²⁰. 이러한 발견은 NMP가 기계적, 통증 및 가려움증 감각의 핵심 조절자이자 통증 관리를 위한 잠재적인 치료 표적임을 보여줍니다²⁰. 그러나 NMP 활동을 다양한 질병 맥락에서 통증 발달과 연결하는 특정 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. 따라서 통증 및 신경병증 관련 상태에서 NMP 발현 역학 및 기능에 대한 추가 조사가 필요합니다.

여기에서는 NMP⁺ DRG 뉴런 집단을 식별하고 분리하기 위한 강력한 워크플로(그림 1)에 대해 설명합니다. 이 접근법은 FACS 분류, scRNA-seq 및 면역염색을 사용하여 NMP 발현 역학에 대한 세포 유형 특이적 조사를 가능하게 합니다. 이러한 접근법은 세포 유형별 방식으로 NMP 발현의 고해상도 분석을 가능하게 하며, 이는 정상 및 다양한 통증 관련 상태에서 NMP의 역할을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

실험 동물을 사용하여 설명된 모든 방법은 시카고 로욜라 대학교 스트리치 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 소화액, DRG 배지 및 FACS 배지 준비

1. 137 mM NaCl, 5.3 mM KCl, 1 mM MgCl₂·6H₂O, 25 mM 소르비톨, 10 mM HEPES 및 3 mM CaCl₂·2H₂O를 함유한 완전 식염수(CSS)를 준비합니다. NaOH로 pH를 7.2로 조정하고 여과하여 멸균합니다.
2. 190μL의 스톡(H₂O에서 5mg/mL), 84μL의 50mM EDTA 및 6.5mL의 CSS를 결합하여 조직 해리 효소 혼합물 작업 용액(적당도 분쇄)을 준비합니다. 사용하기 전에 신선하게 준비하고 필터 멸균하십시오.
3. 190μL의 효소 혼합 원액, 150μL의 파파인, 84μL의 50mM EDTA 및 6.5mL의 CSS를 포함하는 조직 해리 효소 혼합물(저분쇄)-파파인 용액을 준비합니다. 사용하기 전에 신선하게 준비하고 필터 멸균하십시오.
4. DMEM/F12 배지 5mL에 트립신 억제제 7.5mg과 BSA 7.5mg을 결합하여 BSA/TI/DMEM 용액을 준비합니다. 신선하게 준비하고 필터 멸균하십시오.
5. DMEM/F12 430mL에 소 태아 혈청(FBS) 10%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, 글루타민 1%, 글루타민 2%, B27 보충제 2%, DRG 뉴런 배지를 준비합니다.
6. 고압멸균수에 1% FBS, 1x PBS, 25mM HEPES 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 혼합하여 FACS 완충액을 준비합니다. 신선하게 준비하고 필터 멸균하십시오.
7. 프로토콜 시작 24시간 전에, 2개의 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브를 FACS 완충액으로 채우고 4°C에 두어 코팅합니다.

2. 단세포 DRG 뉴런 현탁액의 제조

1. 앞서 설명한 방법^20,23에 따라 4-6마리의 P20-P23 마우스로부터 모든 DRG를 수확합니다.
2. DRG를 15mL 원추형 튜브로 옮기고 7mL의 조직 해리 효소 혼합물(적당한 분쇄) 작업 용액을 추가합니다. 37°C에서 20분 동안 부드럽게 교반(회전)하면서 배양합니다.
3. 신경절을 120× g 에서 2분 동안 회전시킵니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 신경절을 조직 해리 효소 혼합물(저분쇄)-파파인 작업 용액 7mL에 재현탁합니다. 37°C에서 15분 동안 부드럽게 교반(회전)하면서 배양합니다.
4. 120 × g 에서 2분 동안 회전시킵니다. 상청액을 제거하고 신경절을 500μL의 BSA/TI/DMEM 용액에 재현탁합니다.
5. 1mL 플러그형 불 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 신경절을 12-16배 분쇄합니다.
6. 세포를 40μm 세포 여과기를 통과시켜 세포 파편을 걸러냅니다. 모든 DRG 뉴런을 수집하기 위해 1mL의 BSA/TI/DMEM 용액으로 스트레이너를 세척합니다. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
7. 120 × g 에서 2분 동안 회전시킵니다. 상청액을 제거하고 펠릿을 DRG 배지 1mL에 부드럽게 재현탁합니다.
   참고: 이것은 단일 세포 DRG 뉴런 현탁액입니다.

3. NMP 양성 뉴런을 표지하기 위한 항체 공급

1. DRG 뉴런 현탁액을 각각 500μL를 포함하는 두 개의 1.5mL 튜브로 나누고 두 개의 튜브에 "1차" 및 "1차 없음"으로 라벨을 붙입니다.
2. 염소 항프로테아좀 20S 서브유닛 알파 2(PSMA2) 항체 20μL를 "1차" 표지 튜브(1:25 희석)에 추가합니다.
   1. 선택 사항: PSMA2 항체의 막 무결성 및 특이성을 테스트하기 위해, 닭 항-신경필라멘트 중쇄(NF-H)(1:1,000)와 함께 배양된 1차 DRG의 추가 샘플을 포함하고, 그 다음에는 항-닭(예: 488-접합) 2차(1:250)(단계 3.10).
      참고: 항-NF-H 표지 대조군은 신경막이 온전한 경우 세포 표지를 초래하지 않아야 합니다.
3. 37°C에서 30분 동안 부드럽게 교반하면서 세포를 배양합니다.
4. 1차 항체 배양 중 따뜻하게 여과되고 멸균된 1x PBS.
5. 튜브를 200× g 에서 2분 동안 원심분리하고 상청액의 90%를 제거합니다(폐기).
6. 뉴런을 500μL의 따뜻한 1x PBS에 재현탁합니다. 37°C에서 3분 동안 부드럽게 교반하면서 튜브를 배양합니다.
7. 3.5-3.6단계를 반복하여 총 3회 세척합니다.
8. 세척 단계가 진행되는 동안 4μL의 항염소 IgG(555nm 형광단)를 1,000μL의 따뜻한 DRG 배지(1:250 희석)에 희석하여 2차 항체를 준비합니다.
9. 세 번째 세척 후, "1차" 및 "1차 없음" 튜브를 모두 2차 항체 용액 500μL에 재현탁합니다.
   알림: 이 시점부터 튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 보호하십시오.
10. 37°C에서 40분 동안 부드럽게 교반하면서 튜브를 배양합니다.
11. 총 3.5-3.6단계를 반복하여 세포를 세척합니다.
12. 세 번째 세척 후, 뉴런을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 분리된 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮기고 빛으로부터 보호하기 위해 뚜껑이 있는 얼음통에 얼음 위에 놓습니다.
13. 전날의 FACS 완충액이 들어 있는 전처리된 둥근 바닥 튜브를 세포가 들어 있는 튜브와 함께 얼음통에 넣고 FACS 분류 단계를 진행합니다.

4. FACS 분류를 통한 NMP 양성(NMP⁺) 및 NMP 음성(NMP^-) 뉴런의 분리

1. 항체 공급 및 DRG 뉴런의 라벨링 직후 세포와 코팅된 튜브를 FACS 분류기로 가져갑니다.
2. 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)(1:1,000)를 "1차" 및 "1차 없음" 튜브 모두에 추가합니다. 얼음 위에서 10-30분 동안 배양합니다.
   참고: 7-AAD는 분류 과정에서 죽은 세포를 제외하는 데 사용됩니다.
3. 밤새 코팅된 튜브에서 FACS 완충액을 제거하고 신선한 FACS 완충액 1mL로 교체합니다. 이 튜브는 분류된 뉴런의 수집 튜브 역할을 합니다.
4. "1차 없음" 라벨이 붙은 튜브를 사용하여 라벨이 붙지 않은 뉴런에 대한 매개변수 및 게이팅을 설정합니다.
5. FSC(Forward Scatter) 게이팅을 적용하여 감각 뉴런의 크기와 일치하는 세포를 분리합니다. 감각 뉴런 직경의 범위는 10에서 50μm입니다.
6. 측 산란(SSC) 게이팅을 적용하여 죽은 세포 및 파편(하부 측 산란)을 제외하고 DRG 뉴런의 세분성과 일치하는 이벤트(더 큰 측면 산란)를 분리합니다.
7. "1차" 튜브를 로드하고 "1차 없음" 샘플로 설정된 대로 게이팅 매개변수를 설정하여 표지되지 않은(NMP^-) 및 555 양성(NMP⁺) 뉴런 집단을 검출합니다.
8. 100μm 노즐과 15-20psi의 분류 압력을 사용하여 뉴런을 555⁺ 및 555^-로 분류합니다.
9. 분류된 뉴런의 다운스트림 분석을 진행합니다.

5. NMP⁺ 및 NMP^- 뉴런의 단세포 RNA 시퀀싱

1. 분류된 세포를 1.5mL 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 세포를 단일 세포 시퀀싱 코어로 운반합니다.
2. NMP⁺ 및 ^{NMP 분류} 뉴런에 대해 세포당 30,000 내지 100,000 읽기의 깊이에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 수행합니다.
3. 무료로 제공되는 다양한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 scRNA-seq 데이터를 분석하여 특정 유전자 발현 프로파일에 따라 세포 클러스터를 생성합니다. 이전에 사용된 분석 단계 및 프로그램에 대한 자세한 내용은 Villalón Landeros et ^al.20을 참조하십시오.
4. https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ 또는 https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all 와 같은 사용 가능한 데이터베이스를 사용하여 개별 신경 집단을 식별하기 위해 특정 유전자 마커 목록을 구성합니다.
5. 특정 유전자 마커 목록을 사용하여 결과 세포 클러스터를 식별합니다.
   참고: 이전에 수행된 scRNA-seq 분석은 독립 컨설팅 회사(www.cmcherryconsulting.com)에서 수행되었습니다.

6. 농축된 NMP⁺ 및 NMP^- 뉴런의 일차 배양

1. 실험 전날, 12mm 원형 커버슬립을 24웰 배양 플레이트(1 커버슬립/웰)에 넣고 70% 에탄올로 15분 동안 세척합니다. 그런 다음 멸균수로 3회 헹구고 멸균 조직 배양 후드에서 자연 건조합니다.
2. 커버슬립이 건조되면 0.1 mg/mL 폴리-L-라이신 브롬화수소화물(PLL)로 코팅하고 밤새 4°C에 두십시오.
3. 실험 당일 PLL을 제거하고 커버슬립을 멸균수로 3회 헹구고 조직 배양 후드에서 건조시킵니다.
   참고: PLL을 저장하고 재사용할 수 있습니다.
4. 10 μL의 1 mg/mL 라미닌을 125 μL의 DRG 배지에 희석하고 각 커버슬립의 중앙에 20-30 μL를 점적으로 만듭니다.
5. 사용하기 전에 커버슬립을 라미닌으로 최소 40분 동안 코팅하십시오.
6. FACS로 분류된 세포를 1.5mL 튜브로 옮기고 200× g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 상청액을 제거하고 뉴런을 50μL의 따뜻한 DRG 배지에 재현탁합니다.
7. 커버슬립에서 라미닌을 흡인하고 커버슬립을 건조시킵니다.
8. 각 커버슬립에 재현탁된 뉴런 15-20μL를 시드합니다. 시드된 커버슬립이 있는 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 세포가 부착될 수 있도록 최소 30분(1시간 이내) 동안 배양합니다.
9. 플레이트를 조직 배양 후드로 다시 옮기고 커버슬립에 세포가 들어 있는 각 웰에 멸균 따뜻한 DRG 배지 1mL를 추가합니다.
   참고: 피펫 팁을 웰의 하단 모서리로 내리고 커버슬립에 닿거나 세포가 손상되지 않도록 천천히 분배합니다. 배지를 너무 빨리 추가하면 난류가 발생하고 세포가 빠질 수 있습니다.
10. 배양액을 37°C, 습도 5% CO₂/95%로 유지하며 2-3일마다 75% 배지를 교체합니다.

7. 세포형 특이적 NMP 발현 분석

1. 140mm 배양 플레이트 또는 면역형광 염색 트레이에 큰 파라필름 조각을 깔아 준비합니다.
2. 멸균 5/45 집게를 사용하여 조직 배양 접시에서 염색 트레이의 파라필름으로 커버슬립을 옮기고 DRG 뉴런이 포함된 면이 위를 향하도록 합니다.
3. 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 파라필름의 각 커버슬립에 100μL의 DRG 배지를 추가합니다.
   알림: 커버슬립 가장자리 바로 위로 천천히 피펫팅하여 액체를 추가합니다.
4. 염소 항-PSMA2 1차 항체를 따뜻한 DRG 배지에서 1:20 희석으로 희석합니다.
5. P10 여과되지 않은 팁이 장착된 흡인기를 사용하여 가장자리에서 흡인하여 커버슬립에서 매체를 천천히 제거합니다. 100μL의 염소 항-PSMA2 항체 용액을 커버슬립에 첨가하고 실온에서 40분 동안 배양합니다.
6. 커버슬립에서 1차 항체 용액을 조심스럽게 흡인합니다. 100μL의 PBS(실온에서)를 첨가하고 실온에서 3분 동안 배양하여 세척합니다.
7. 커버슬립에서 PBS를 흡인하고 총 3회 세척 동안 PBS의 첨가 및 흡인을 반복합니다.
8. 따뜻한 DRG 배지에서 1:250 희석으로 항염소(예: 555-접합) 2차 항체를 준비합니다.
9. 세 번째 세척 후, 희석된 2차 항체 100μL를 커버슬립에 첨가하고 실온에서 40분 동안 배양합니다.
   참고: 이 단계부터 셀을 빛으로부터 보호하십시오.
10. 커버슬립에서 2차 항체 용액을 흡인하고 7.6-7.7단계에 설명된 대로 3회 세척합니다.
11. 마지막 PBS 세척을 제거하고 1x PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA), 4% 자당을 함유한 고정액 100μL를 첨가하여 세포를 고정합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
12. 고정액을 흡인하고 7.6-7.7단계를 반복하여 3회 세척합니다.
13. 1x PBS에 100μL의 0.1% 비이온성 세제(예: Triton X-100)를 첨가하여 세포를 투과화하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
14. 투과성 용액을 흡인하고 7.6-7.7단계를 반복하여 3회 세척합니다.
15. 1x PBS에 5% FBS, 5% 당나귀 혈청으로 구성된 차단 용액 100μL를 넣고 실온에서 40분 동안 배양합니다.
16. 차단 용액에서 다음 희석액에 따라 DRG 뉴런 세포 유형 특이적 1차 항체 혼합물을 준비합니다: 토끼 항-칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)(1:500); 이솔렉틴 B4, 비오틴 접합체(IB4)(1:50); 치킨 안티 NF-H (1 : 1000).
    참고: 이러한 항체는 서로 간섭하지 않으며 동일한 용액에 함께 첨가할 수 있습니다.
17. 차단 용액을 제거하고 1차 항체 혼합물을 커버슬립에 추가합니다. 실온에서 45분 동안 배양합니다.
18. 항체 용액을 제거하고 7.6-7.7단계를 반복하여 3회 세척합니다.
19. 스트렙타비딘(예를 들어, 647-접합), 당나귀 항토끼(예를 들어, 488-접합) 및 당나귀 항닭(예를 들어, 405-접합)을 각각 1:500으로 희석하여 2차 항체 혼합 용액을 제조한다.
20. 마지막 PBS 세척을 제거하고 커버슬립에 100μL의 2차 항체 용액을 추가합니다. 실온에서 45분 동안 배양합니다.
21. 7.6-7.7단계를 반복하여 3회 세탁합니다.
22. 선택 사항: 1-10 μg/mL에서 핵 염색을 준비합니다. 핵 염색액 100μL를 첨가하고 실온에서 30초 동안 배양한 다음 7.6-7.7단계를 반복하여 탈이온수(diH₂O)로 2회 세척합니다.
23. 커버슬립에서 마지막 세척액을 흡인하고 가는 팁 집게를 사용하여 파라필름에서 커버슬립을 들어 올립니다. 보푸라기가 없는 티슈에 커버슬립의 가장자리를 부드럽게 닿혀 여분의 액체를 닦아냅니다.
24. 7μL의 마운팅 매체 방울을 현미경 슬라이드에 놓습니다. 커버슬립을 마운팅 배지 방울 위에 부드럽게 놓고 세포가 아래를 향하고 배지와 접촉하도록 합니다.
25. 커버슬립이 있는 현미경 슬라이드를 어둡고 건조한 서랍이나 상자에 최소 1시간 동안 넣어 커버슬립의 가장자리를 건조시키고 밀봉합니다. 속건성 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉하고 이미징하기 전에 10-15분 동안 기다립니다.
26. 청색, 녹색, 적색 및 원적외선 형광을 시각화하기 위해 적절한 광 필터가 장착된 형광 또는 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지화합니다.

Results

NMP와 세포내 프로테아좀을 구별하는 능력은 막 불투과성 표지 접근법에 의존합니다. 항체 공급을 통해 살아있는 뉴런에 프로테아좀 서브유닛 특이적 항체를 사용하여 세포 외부에서만 접근할 수 있는 프로테아좀을 표지할 수 있습니다. 크기와 친수성으로 인해 항체는 온전한 세포막을 통과할 수 없습니다²⁴. 살아있는 뉴런은 막 무결성을 유지하여 항체가 세포에 들어가는 것을 방지합니다. 이 접근법을 사용하면 NMP를 안정적으로 라벨링하고 이를 발현하는 뉴런(NMP⁺)과 발현하지 않는 뉴런(NMP^-)을 구별할 수 있습니다(그림 2A). 2차 항체 표지만 받는 대조군 세포는 NMP 표지를 나타내지 않습니다(그림 2B). 또한, 이 방법은 DRG 뉴런의 하위 집단만이 NMP를 발현한다는 것을 보여줍니다...

Discussion

프로테아좀은 모든 세포에서 필수적이며 세포 전체의 모든 구획에서 발견될 수 있다(¹⁹). 중추 25,26,27 및 말초²⁰ 신경계의 뉴런에서 특수한 프로테아좀 복합체인 NMP가 최근 발견되면서 프로테아좀의 기능에 대한 현재의 이해가 바뀌었습니다. 이전 연구에서는 NMP가 감각 뉴런 사이의 누화를 매개하여 기계적, 통증 및 가려움증에 대한 민감도를 조절하는 신호 전달 프로테아좀으로 기능한다는 것을 보여주었습니다²⁰. NMP는 세포질 20S 프로테아좀과 구조적으로 동일한 것으로 보이며, 이는 기능적 고유성이 막 국소화에서 발생함을 시사합니다²⁰

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M HEPES 완충액, pH 7.3	품질 생물학	118-089-721	FACS 버퍼
PBS 10배	써모 피셔 사이언티픽	70011-044	FACS 버퍼
16% 파라포름알데히드(PFA) 원액; EM 등급	EMS	15710	고정액
1x 인산염 완충 식염수(PBS)	피셔 사이언티픽	10-010-023	FACS 세척
5 mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브	피셔 사이언티픽	14-959-6	FACS 튜브
7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)	인비트로젠	A1310	죽은 세포에 라벨을 붙입니다.
B27 보충	써모 피셔 사이언티픽	17504044	배양 배지
소 혈청 알부민	밀리포어시그마	A9647; CAS : 9048-46-8	BSA/TI/DMEM
염화칼슘 이수화물(CaCl?-2H? O)	밀리포어시그마	C7902	완전한 식염수 용액
닭 항신경필라멘트 중쇄(NF-H)	밀리포어시그마	AB5539	항체
DMEM/F12 1:1	써모 피셔 사이언티픽	11320033	배양 배지; BSA/TI/DMEM
당나귀 안티 염소 IgG (H + L) Alexa Fluor Plus 555	써모 피셔 사이언티픽	A32816	항체
당나귀 안티 토끼 IgG (H + L) Alexa Fluor Plus 488	써모 피셔 사이언티픽	A32790	항체
다이라이트 405 당나귀 안티 치킨	잭슨 면역 연구	703-475-155	항체
EDTA	밀리포어시그마	E5134; CAS : 6381-92-6	Liberase TM/Liberase TL-파파인 작업 솔루션
태아 소 혈청(FBS)	밀리포어시그마	A9647	배양 배지/FACS 완충액/차단 용액
유리 파스퇴르 피펫, 9인치	피셔 사이언티픽	1367820D	적정
염소 항 PSMA2	자체 제작	NA	항체
HEPES 분말	밀리포어시그마	H4034	완전한 식염수 용액
회크스트	써모 피셔 사이언티픽	H21492	핵 염색
말 세럼	써모 피셔 사이언티픽	26050070	차단 솔루션
IB4, 비오틴 접합체	밀리포어시그마	L2140	항체
라미닌	시그마-알드리치	L2020-1MG	문화 요리
L-글루타민	써모 피셔 사이언티픽	25030081	배양 배지
Liberase 분쇄 낮음(TL)	밀리포어시그마	54010200001	Liberase TL 원액
자유효소 분쇄 보통(TM)	밀리포어시그마	5401119001	Liberase TM 원액
염화마그네슘 육수화물(MgCl?-6H? O)	밀리포어시그마	M2393	완전한 식염수 용액
마운팅 미디어	남부 바이오 텍	0100-01	플루오로마운트-G
파파인	워 딩 턴	카탈로그 # : 9001-73-4	Liberase TL-파파인 작업 솔루션
페니실린/스트렙토마이신	밀리포어시그마	15140122	배양 배지/FACS 완충액
폴리-L-라이신 브롬화수소화물(PLL)	밀리포어시그마	P4707	문화 요리
염화칼륨(KCl)	밀리포어시그마	P5405	완전한 식염수 용액
토끼 안티 CGRP	면역스타	24112	항체
염화나트륨(NaCl)	밀리포어시그마	S9888; CAS : 7647-14-5	완전한 식염수 용액
소르비톨	밀리포어시그마	56755-엠	완전한 식염수 용액
스트렙타비딘 Alexa Fluor 647 접합체	써모 피셔 사이언티픽	S21374	항체
자당	시그마-알드리치	S0389-500G	고정액
트립신 억제제	밀리포어시그마	T9253; CAS : 9035-91-8	BSA/TI/DMEM