방법 논문

인플루엔자 감염 후 이형성 및 기능적 폐포 복구 모델링

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DOI:

10.3791/69062

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2025년 9월 19일

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1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 IAV의 비강내 투여 및 마우스 폐 손상 및 폐 세포 유형에 대한 관련 전사 변화의 다운스트림 분석에 대한 지침을 제공합니다.

초록

바이러스 감염은 심혈관계와 외부 환경 사이의 가스 교환을 담당하는 특수 조직 구조인 폐포에 급성 및 장기 손상을 일으킵니다. 생쥐의 인플루엔자 A 바이러스(IAV) 감염은 바이러스 감염에 대한 인간 폐의 반응에 대한 번역 모델을 나타내며 폐포에서 일시적이고 지속적인 세포 상태 변화를 모두 유도합니다. 어떤 경우에는 시간이 지나도 해결되지 않는 바이러스 손상에 의해 유발된 비정상적인 세포 상태가 폐의 중요한 가스 교환 기능을 영구적으로 손상시킬 수 있습니다. 이 기사에서는 A/PR/8/34 IAV로 마우스의 비강내 감염 방법과 손상된 폐의 세포 구성 및 조직 구조에 대한 일시적이고 오래 지속되는 변화의 특성을 보여줍니다. 이 모델을 통해 폐 복구 및 만성 기능 장애의 기초가 되는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 자세한 조사가 가능합니다. 이 접근법은 또한 효과적인 폐 재생을 촉진하고 바이러스 손상 후 호흡 기능을 회복하는 것을 목표로 하는 치료 개입을 평가하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

서론

폐는 국소 조직에 산소와 영양분을 공급하는 데 중요한 역할을 합니다. 폐의 작은 모세혈관에 채워지는 내피 세포(EC)는 폐 조직의 적절한 기능, 혈관 무결성 유지 및 효율적인 가스 교환에 필수적입니다1. EC는 혈관 틈새를 형성하고 상피 세포, 면역 세포 및 중간엽 세포와 같은 다른 세포와 상호 누화합니다. 이것은 부상이나 질병에 대한 반응으로 폐 발달 및 조직 복구의 조절에 기여합니다2.

H1N1 인플루엔자 A 바이러스 감염은 세계적인 문제입니다3. H1N1 감염 환자는 종종 삼출성 미만성 폐포 손상(DAD)으로 진단됩니다.4. H1N1 감염은 폐렴, 중증 급성 폐 손상(ALI) 및 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 포함한 심각한 폐 손상 및 심각한 결과를 초래할 수 있습니다5. 손상은 주로 폐 상피 세포를 감염시키는 바이러스에서 발생하며, 이는 과도한 면역 반응을 유발하여 염증, 조직 손상 및 폐에 체액 축적을 초래합니다. 따라서 가스 교환을 담당하는 기도와 폐포를 둘러싸고 있는 상피 세포는 H1N1 바이러스에 의해 직접적인 피해를 입어 폐의 정상적인 구조를 파괴합니다 6,7. IAV에 의해 직접 감염되지는 않지만 다른 세포 유형이 감염에 대한 반응으로 손상될 수 있음이 분명해졌습니다 8,9. 따라서 인플루엔자 감염 후 조직 손상은 폐의 모든 세포 구획에 영향을 미치며, 최근 IAV 감염이 여러 세포 구획에서 세포 상태에 일시적이고 지속적인 변화를 유발하는 것으로 나타났습니다9. 질병에 대한 반응의 이러한 세포 가소성은 성공적인 조직 복구에 도움이 될 수도 있고 해로울 수도 있으며 추가 연구가 필요합니다.

인플루엔자 및 그 병인을 연구하기 위해 가장 많이 채택된 실험 모델은 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34에 의한 마우스의 비강내 감염입니다10. 질병의 중증도, 사망률 및 바이러스 감염성을 연구할 수 있는 중요한 기술입니다. 생쥐의 비강내 감염은 인간의 자연 감염 경로를 모방하며 바이러스에 대한 적응 및 선천적 면역 반응을 모두 연구할 수 있습니다. 1934년 푸에르토리코의 한 환자로부터 인플루엔자 A 바이러스 "A/PR/8/34"의 특정 변종이 분리되었습니다11. 이 인플루엔자 바이러스 변종은 이제 쥐에 적응했으며 더 이상 인간을 생산적으로 감염시키지 않습니다. 마우스와 인간 면역 체계의 유사성으로 인해 마우스는 IAV 연구에서 가장 인기 있는 동물 모델입니다12. 이 방법에서는 A/PR/8/34 H1N1 균주를 콧구멍을 통해 마우스에게 직접 투여하여 자연 감염을 모방합니다13. 야생형(WT) 및 녹아웃(KO) 조건에서 바이러스 감염이 숙주 폐 조직에 미치는 영향을 연구하는 쉽고 비용 효율적이며 편리한 방법입니다. 대체 기술은 비강내 모델에 비해 장점과 단점이 있습니다. 기관내(IT) 접종을 통해 바이러스를 폐로 정확하게 전달할 수 있지만 이 기술은 흡입에 의한 감염을 완전히 모방하지 못하며 상기도의 독성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. IT 접종은 또한 기관 손상의 위험을 줄이기 위해 훌륭한 기술이 필요합니다13,14. 에어로졸 흡입(AR) 접종은 자연적인 감염 경로를 모방하여 비강내 감염에 비해 보다 균일한 폐 병리를 생성하지만 에어로졸에서 균일한 바이러스 농도를 유지하고 바이러스 에어로졸의 정확한 전달을 달성하기 어려울 수 있습니다. 안전성은 AR 접종 방법(10)의 중요한 관심사이기도 하다. 따라서 IAV 투여의 비강내 접종 기술은 조직 손상 및 복구에서 바이러스 감염의 다운스트림 효과에 대한 폐 중심 연구에 대한 중요한 접근 방식입니다. 화학적 또는 기계적 모델과 달리 인플루엔자로 인한 폐 손상 및 숙주-병원체 상호 작용을 연구하는 보다 현실적이고 덜 침습적인 방법을 제공합니다.

여기에서는 인플루엔자 A 바이러스(A/PR/8/34)에 의한 마우스의 비강내 감염과 바이러스 손상으로 인한 폐포의 단기 및 장기 세포 및 구조적 변화를 모두 특성화하기 위한 재현 가능한 방법을 확립합니다. 이 방법을 사용한 연구는 폐 질환에 대한 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 폐 조직 손상 및 복구 메커니즘을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델에서 인플루엔자 A 바이러스를 다루는 것은 생물안전성 레벨 2(BSL2) 및 동물 생물안전성 레벨 2(ABSL2)로 간주됩니다. 이 데이터를 생성하는 데 사용된 모든 동물 절차는 국립 보건원 국립 암 연구소 암 연구 센터의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다(프로토콜 #24-452). 이 프로토콜은 또한 국립 보건원, 국립 암 연구소 암 연구 센터의 기관 생물 안전 위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜을 시작하기 전에 사용자는 기관 동물 관리 및 사용 위원회와 기관 생물 안전 위원회의 승인을 구하는 것이 좋습니다.

1. 작업 재고 준비

알림: 인플루엔자 바이러스에 대한 모든 작업은 생물 안전 캐비닛의 얼음 위에서 수행해야 합니다. 팁과 바이러스와 접촉하는 기타 모든 것을 10% 표백제 용기에 배출하십시오. 얼음통, 피펫, 팁 박스는 담그지 말고 10% 표백제 용액을 뿌려야 합니다. 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. 고형 폐기물은 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리고 액체 폐기물은 싱크대 아래로 버리고 물로 씻어냅니다.

  1. 생물 안전 캐비닛의 얼음 위에 냉동 바이러스 스톡(0.5mL)을 해동합니다.
  2. 수돗물에 표백제 10%가 들어 있는 폐기물 용기를 설치하십시오. 최대 100개의 샘플 튜브를 담을 수 있는 플라스틱 또는 판지 냉동 상자 2개를 -80°C 냉동고에 넣어 미리 식힙니다.
  3. 바이러스 분취량을 위해 160 1.5mL 튜브를 미리 라벨링합니다. 스크류 탑 튜브는 바이러스 스톡 튜브를 열어 사용할 때 에어로졸이 생성되는 것을 방지하기 위해 플립 캡 튜브보다 바람직합니다. 바이러스를 분취하기 전에 튜브를 얼음 위에 올려 미리 식히십시오.
  4. 보정된 P20 피펫과 팁을 사용하여 바이러스 3μL 분취량을 만들고 바이러스를 미리 냉각된 튜브에만 넣고 분취량을 항상 얼음 위에 보관합니다.
  5. 분취량을 만든 후 "A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스(IAV)", 카탈로그 번호, 로트 번호 및 만료 날짜가 표시된 사전 냉장 냉동 상자에 보관하십시오.
    참고: 다른 로트의 바이러스는 전염성이 다르므로 혼합해서는 안 됩니다.
  6. 상자를 -80°C 냉동실에 넣습니다. 동결/해동 주기마다 바이러스 역가가 감소하므로 모든 것을 가능한 한 차갑게 유지하십시오.

2. 비강내 감염 실험에 사용하기 위한 바이러스의 분취량 희석

  1. 생물 안전 캐비닛의 얼음 위에 바이러스 스톡의 3 μL 분취량 1개를 해동합니다.
  2. 3 μL 분취량 2 μL를 198 μL의 차가운 D-PBS가 들어 있는 사전 냉각된 1.5 mL 튜브에 옮겨 1:100 희석액(희석 A)을 만듭니다.
  3. 사용된 마우스의 균주 배경에서 0.5-1 LD50 에 대한 적절한 농도에 도달할 때까지 바이러스 스톡을 계속 희석합니다. 바이러스가 과도하게 따뜻해지지 않도록 모든 것을 얼음 위에 보관하고 미리 냉장된 튜브를 사용하십시오.
    참고: 예를 들어, VR-95PQ, 로트 70063082의 경우, 1:500,000 희석액으로 12,600 내지 31,500 CEID50/μL 바이러스(체중 단위로 스케일링)로 마우스를 감염시킵니다.
  4. 희석액 A(1:100)에서 사전 냉각된 15mL 튜브에 10μL의 희석액 A를 4990μL의 차가운 D-PBS에 첨가하여 1:50,000 희석액(희석액 B)을 만듭니다. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다.
  5. 희석액 B에서 미리 냉각된 5mL 튜브에 200μL의 희석액 B를 1.8mL의 D-PBS에 첨가하여 1:500,000 희석액(희석액 C)을 만듭니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.
    참고: 새 로트를 구매할 때 동물을 감염시키는 데 사용할 바이러스의 이상적인 희석액을 결정하기 위해 제품 시트에 표시된 바이러스의 역가를 사용하여 추정하고 이전 로트의 역가를 기준으로 희석도를 조정할 수 있습니다. 이상적인 희석액을 결정하는 가장 좋은 방법은 야생형 C57BL/6 마우스를 사용하여 새로운 로트의 바이러스를 경험적으로 적가하는 것입니다. 1:50,000에서 1:500,000에 이르는 희석액 범위를 계획하고 테스트할 희석액당 C57BL/6 암컷 마우스 케이지 1-2개를 주문합니다. 다양한 농도로 쥐를 감염시키고 체중 감소를 모니터링합니다. 바이러스 역가를 테스트하기 위해 이 연구는 생쥐 간의 성별 또는 체중 차이로 인해 발생할 수 있는 변동성을 줄이기 위해 암컷 쥐만 사용할 것을 제안합니다. 암컷 마우스는 종종 수컷 마우스보다 더 아프게 되는데, 이는 아마도 더 작은 크기 또는 다른 형태의 마우스 폐 손상에서 발생하는 것처럼 인플루엔자 감염에 대한 반응의 성별 특이적 차이로 인해 발생합니다15. 이에 대한 자세한 연구는 없었지만, 수컷 마우스를 사용하여 역가를 결정하면 암컷 마우스가 결정된 용량에서 죽을 수 있기 때문에 역가 실험에 암컷 마우스를 사용했습니다. 그러나 수컷 마우스는 암컷 마우스만을 사용하여 결정된 바이러스 역가에 감염되면 눈에 띄게 아프고 눈에 띄는 폐 손상을 입는 것으로 밝혀졌습니다. 혼합 배경 또는 근친 교배 마우스를 사용하는 경우 이상적인 희석액은 야생형C57BL/6 마우스의 50%가 죽는 희석액인 "1 LD 50"입니다. 근친 교배 마우스는 감염에 더 강합니다16 이 희석에서 부상을 입고 잘 회복됩니다. 실험을 위한 마우스가 근친 교배 C57BL/6 배경에 있는 경우, 이상적인 용량은 이 "0.5 LD50"의 절반이 될 것입니다. 이러한 실험의 목표는 손상과 복구를 연구하는 것이기 때문에 마우스가 아프고 체중의 20-25%를 잃지만 대부분의 마우스는 궁극적으로 회복되는 용량을 정의하는 것이 이상적입니다(그림 1). 연구에 참여한 모든 마우스의 무게가 거의 같다면(~25g), 각 마우스에게 적절한 희석액 50μL로 인플루엔자 바이러스를 투여할 수 있습니다. 그러나 마우스의 무게는 15-35g입니다. 따라서 체중 그램당 2 μL의 바이러스 희석액을 투여합니다(예를 들어, 15g 마우스는 30 μL 인플루엔자를 받는 반면 35g 마우스는 70 μL를 받습니다). 이로 인해 다양한 크기의 동물에서 보다 일관된 수준의 감염 및 조직 손상이 발생합니다. 이 정보는 희석 C의 양을 계획하는 데 필요합니다.

3. 동물 시설로의 바이러스 분취량 운송

  1. 최종 바이러스 희석액이 담긴 5mL 튜브를 얼음에 넣고 용기에 생물학적 위험 스티커를 붙입니다. 플라스틱 샘플 캐리어 상자에 종이 타월을 깔아 유출 가능성을 흡수합니다.
  2. 비강내 감염에 필요한 재료를 생물학적 위험 라벨이 붙은 상자 안에 넣습니다: P200 피펫, 여과된 P200 피펫 팁이 담긴 개봉하지 않은 상자, 펜, 바이러스 폐기물을 위한 신선한 10% 표백제로 채워진 50mL 원뿔형 튜브. 감염 통제로 IAV를 희석하는 데 사용되는 것과 동일한 차가운 D-PBS로 1.5mL 튜브를 채웁니다.

4. 마우스에 대한 IAV 투여

참고: 동물 시설에서 인플루엔자 바이러스를 다루려면 ABSL2 안전 수준 시설이 필요합니다. 표준 PPE에는 수술복, 일회용 실험실 가운, 헤어 보닛 2개, 이중 니트릴 장갑, 이중 신발 커버, 보호 안경(보안경) 및 마스크가 포함됩니다. 희석된 인플루엔자 바이러스는 감염성 손실을 방지하기 위해 투여 프로토콜 내내 얼음 위에 보관해야 합니다.

  1. 바이러스에 대한 모든 작업은 생물 안전 캐비닛 내에서 이루어져야 합니다. A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스는 마우스에 적응한 변종이지만 인플루엔자 바이러스는 돌연변이가 발생하기 쉽기 때문에 바이러스를 인간에게 잠재적으로 전염시키는 것처럼 취급합니다.
  2. 기화기에서 2.5-3%의 유속으로 동물에게 한 번에 한 마리씩 이소플루란 마취를 투여합니다. 인플루엔자를 투여하기 전에 동물을 마취 상자에서 코뿔로 옮깁니다.
  3. 쥐가 마취 상태일 때 호흡을 확인하고 발가락을 꼬집어 반응하는지 확인합니다. 생쥐는 발가락 꼬집음에 작은 경련이나 "점프"로 반응할 때 IAV 감염에 대한 준비가 되어 있지만 머리를 움직일 수 있을 만큼 깨어 있는 경우에는 그렇지 않습니다.
  4. 50μL(또는 2μL/g 체중, 2.5단계 아래 참고 참조)로 설정된 P200 피펫을 사용하여 얼음 위의 바이알에서 희석된 IAV(또는 PBS 대조군)를 흡인하고 팁이 장갑이나 생물안전 캐비닛 표면에 닿지 않는 팁 상자 또는 종이 타월 위에 피펫을 놓습니다.
  5. 마취된 마우스를 목덜썩이면서 집어 들고 마우스를 45° 각도로 똑바로 세우도록 잡습니다. 더 나은 흡입을 위해 기관이 길어지도록 마우스를 꽉 쥐어짜되 호흡이 방해될 정도로 꽉 조이지는 마십시오. 마우스의 호흡이 얕지만 헐떡거리지 않고 일관성이 있는지 확인하십시오.
  6. IAV 희석액을 마우스의 콧구멍에 천천히 피펫팅합니다. 이 작업은 4.6.1 및 4.6.2단계에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 성공적으로 수행할 수 있습니다.
    1. 바이러스 희석액을 콧구멍에 적방적으로 떨어뜨리고, 바이러스가 코의 양쪽으로 들어가도록 콧구멍 사이를 번갈아 가며 떨어뜨립니다.
    2. 양쪽 콧구멍에 걸쳐 바이러스의 "거품"을 만들고 마우스가 액체를 흡입할 때 일관되고 천천히 피펫팅하여 유지합니다.
      참고: 이 연구는 보다 제어되고 재현 가능한 기포 주입 방법을 일관되게 사용했습니다. 이 방법을 사용하면 마취 하에 바이러스 현탁액을 콧구멍으로 쉽게 전달할 수 있으며 자연스러운 호흡을 촉진할 수 있습니다. 드롭와이즈 방법도 똑같이 유효하지만 어떤 방법을 사용하든 결과의 변동성을 줄이기 위해 실험 전반에 걸쳐 방법의 일관성을 적용해야 합니다.
  7. 피펫 팁을 코 가까이에 대되 코를 만지지 마십시오. 마우스가 깨어나면 용량의 절반을 투여하고 용량의 후반을 투여하기 전에 마우스를 이소플루란 코콘으로 되돌립니다.
  8. 쥐가 머리를 흔들거나 기침을 하거나 바이러스를 뱉어낼 수 있을 만큼 깨어 있는 경우 에어로졸화된 바이러스를 일으키지 않고 좋은 감염을 보장하기 위해 더 많은 마취가 필요합니다. 마우스가 깨어 있지 않으면 전체 용량을 투여합니다. 마우스를 노즈콘에 다시 놓은 경우, 4.6단계를 반복하여 나머지 IAV를 투여한다.
  9. 신선한 10% 표백제가 들어 있는 폐기물 용기에 팁을 꺼냅니다. 생쥐의 각 케이지에 대해 새로운 팁을 사용하십시오.
  10. 각 IAV 투여 후 마우스를 1-2분 동안 똑바로 세워 기도를 열어두고 독감이 폐로 적절하게 전달되었는지 확인합니다. 독감 바이러스가 쥐의 폐에 성공적으로 전달된 경우 쥐의 가슴 양쪽에 손가락 하나를 대면 딱딱거리는 소리를 느낄 수 있습니다.
  11. 마우스가 회복되기 시작한 후 마우스를 케이지에 다시 넣어 완전히 회복합니다. 생쥐는 이소플루란에서 빠르게 회복되지만 걸을 수 있을 때까지 모니터링해야 합니다.
  12. IAV가 잘 흡입되었음을 나타내는 가슴의 딱딱거리는 소리와 심호흡, 또는 쥐의 콧구멍에서 일부가 배출되었음을 나타내는 거품 및 비강 분사와 같은 이벤트를 기록합니다. 부상 기록 스프레드시트(보충 파일 1)와 실험실 노트북에서 이 정보를 추적하십시오.
  13. 감염될 각 마우스에 대해 4.2-4.12단계를 반복합니다.

5. 실험실로 돌아가는 교통편

  1. 표백제와 팁이 들어 있는 50mL 원뿔형을 남은 IAV 희석액(있는 경우) 및 독감 감염에 사용되는 실험실 품목과 함께 플라스틱 샘플 캐리어 상자에 다시 넣습니다.
  2. 실험실로 돌아오면 바이러스와 접촉한 모든 것을 10% 표백제와 함께 배양합니다. 얼음 양동이, 피펫 및 팁 상자에 담그지 말고 10% 표백제 용액을 뿌립니다. 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. 고형 폐기물은 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리고 액체 폐기물은 싱크대 아래로 버리고 물로 씻어냅니다.

6. 마우스 모니터링 및 추가 실험 절차

  1. 감염 다음날(1일) 또는 감염 후 3일(4일)부터 시작하여 인플루엔자 감염 후 매일 모든 대조군(PBS) 및 IAV 감염 마우스의 신체 상태 점수(BCS)17 및 체중을 모니터링합니다. IAV에 감염된 마우스는 감염 후 4일까지 상당한 체중 감소가 없을 것입니다(그림 1).
    참고: 체중의 30% 이상 감소하거나 신체 상태 점수 1에 도달한 쥐는 안락사시켜야 합니다.
  2. 원하는 경우 복강내(i.p.) 주사 또는 식수에 의해 마우스에게 EdU를 투여하여 인플루엔자 감염 후 세포 증식을 모니터링합니다.
    참고: 마우스 폐의 많은 세포 유형은 IAV 유도 손상 후 증식합니다9. 특정 실험 목적을 위해 원하는 대로 다른 약물, 특수 식품 또는 특수 물을 투여할 수 있습니다. 마우스는 인플루엔자에서 회복되는 동안 평소만큼 많이 먹거나 마시지 않으므로 주사 기반 투여 방법이 더 바람직할 수 있습니다. 반면에 BCS가 2-2.5인 마우스를 주사하는 것은 어려울 수 있습니다.

7. 다운스트림 접근법을 위한 폐 조직 채취

  1. 마우스 시설 또는 생물 안전 캐비닛의 실험실에서 면역형광 분석, 유세포 분석 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱을 포함한 다운스트림 응용 분야를 위해 폐 조직을 수확합니다.
  2. CO2를 사용하여 한 번에 한 마리씩 마우스를 안락사시킵니다. 기관 탈구를 방지하기 위해 경추 탈구를 하지 마십시오. 양측 개흉술은 일반적으로 승인된 2차 안락사 방법입니다.
    참고: 이 연구는 기관에서 승인한 동물 관리 지침과 CO2 안락사 프로토콜을 따르며 폐 손상이나 조직병리학적 결과에 상당한 변동성을 도입하지 않고 이전 인플루엔자 연구에서 이 방법을 일관되게 사용했습니다. 케타민/자일라진은 CO2 흡입으로 인한 손상을 방지하기 위해 쥐를 안락사시키는 데에도 사용할 수 있습니다. 그러나 케타민/자일라진 획득 비용이 너무 많이 들거나 DEA 면허 취득이 너무 어려운 경우 CO2 흡입이 허용되는 방법입니다.
  3. 흉강을 해부하고 흉곽과 기관을 노출시킵니다.
  4. 횡격막을 잘라서 폐에 구멍이 나지 않도록 흉곽에서 조심스럽게 해부합니다. 흉곽의 측면을 따라 자르고 상단의 흉곽을 제거합니다. 쇄골을 자르고 기관 앞쪽에서 뼈와 연조직을 해부합니다.
  5. 연골 고리가 보일 때까지 기관 주변의 근육과 조직을 해부하되 기관에 구멍을 뚫지 마십시오. 구부러진 겸자를 사용하여 기관 뒤에서 식도를 밀어내고 기관에서 멀리 해부합니다.
  6. 기관 뒤에 봉합사 조각을 끼우고 느슨한 봉합사 매듭을 묶습니다(한 집게의 한쪽 끝을 다른 집게로 이중 고리로 묶고 봉합사의 느슨한 끝을 잡고 느슨한 끝을 고리를 통해 당깁니다).
  7. D-PBS로 순환계를 관류합니다. 큰 혈관(앞다리 아래 또는 횡격막 바닥)을 클립하고 주사기 끝을 천천히 눌러 우심실(심장 바닥, 위를 향함)을 통해 D-PBS를 관류합니다. 바늘이 심장벽을 통해 보이지 않으면 좌심실에 있을 가능성이 높습니다. 이것은 폐에서 혈액을 제거합니다.
    알림: 거품을 밀지 마십시오. 라인에 기포가 있으면 주사기로 D-PBS를 밀기 전에 기포를 배출하십시오. 내피 세포 사멸이 우려되는 경우 PBS를 손으로 밀어내는 것보다 중력 관류를 사용하는 것이 더 부드럽습니다.
  8. 조직학 또는 면역형광만을 위해 조직을 수집하는 경우, 7.9단계로 진행한다. 단일 세포 현탁액만을 위해 수집하는 경우 모든 폐엽을 잘라내어 얼음 위의 PBS에 넣은 다음 7.11단계로 진행합니다.
  9. 다운스트림 면역형광 또는 조직학에 대한 폐 팽창:
    1. 2% 파라포름알데히드(PFA)로 폐를 팽창시키고 파라핀 포매를 위해 에탄올을 통해 탈수하거나 냉동절편을 위해 2% PFA를 팽창시키고 자당을 통해 탈수합니다.
    2. RNAscope 또는 혼성화 연쇄 반응(HCR)과 같은 RNA 검출 기술의 경우 폐를 4% PFA로 고정합니다. 최상의 고정을 위해 2% 초저융점 아가로스에서 폐를 팽창시키고 즉시 진동 마이크로톰에서 다운스트림 면역형광을 위해 조직 배양 플레이트에서 2% 또는 4% PFA로 절편합니다.
  10. 손으로 폐 팽창:
    1. 튜브 유무에 관계없이 주사기와 21-23G 바늘을 사용하여 손으로 폐를 팽창시키거나 벤치 표면에서 30cm 위의 링 스탠드에 PFA 튜브를 부착하여 중력을 사용합니다.
    2. 기관을 분리한 후 바늘을 기관 상단에 삽입하고 기관 바닥을 뚫지 않고 비스펙 업하고 기관과 바늘 주위에 봉합사를 조인 후 액체를 삽입합니다.
      참고: 날카로운 바늘을 사용하면 끝이 뭉툭한 바늘에 비해 기관 천자의 위험이 약간 있으므로 연구원은 손상을 방지하기 위해 시술 중에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 날카로운 바늘이 기관에 구멍을 뚫고 있는 경우 끝이 뭉툭한 바늘을 사용해야 합니다.
  11. 다운스트림 유세포 분석 또는 단일 세포 시퀀싱 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 생성하려면 D-PBS에서 폐 조직을 제거하고 가위로 폐 조직을 다진 다음 면도날로 2-3분 동안 잘게 썰어 더 미세한 조직 조각을 얻습니다.
  12. D-PBS에 480 U/mL 콜라게나제 I, 100 μL/mL 디스파아제 및 2 μL/mL DNase를 함유한 분해 완충액에서 37°C에서 30-35분 동안 해리합니다. 100μm 및 40μm 필터를 통해 여과하고, 암모늄-염화-칼륨(ACK) 용해 완충액을 사용하여 남은 적혈구를 용해하고, 다운스트림 처리 및 분석을 위해 PBS의 1% BSA에 재현탁합니다.
    참고: 폐에서 감염 후 바이러스 감염 및 제거를 검출하기 위해 바이러스 복제를 측정하기 위해 폐 균질체에서 qRT-PCR 또는 TCID50 분석을 사용하여 바이러스 부하를 평가할 수 있습니다. 뉴라미니다제 및 캡시드 염색은 바이러스 감염을 감지하는 데에도 사용할 수 있습니다. 바이러스 제거는 감염 후 8-9일까지 발생해야 하며18,19, 폐 조직의 복구 및 재생은 몇 주 동안 계속됩니다9.

결과

감염되지 않은 PBS 처리 마우스와 비교하여 IAV에 감염된 마우스는 이질적인 조직 손상을 나타냅니다(그림 1A). 조직 손상은 MATLAB20의 k-평균 클러스터링 알고리즘을 사용하여 정량화할 수 있습니다(그림 1B). IAV에 감염된 마우스는 감염 후 3-4일 사이에 체중이 감소하기 시작합니다. 이상적인 역가에서 마우스는 초기 체중의 20-30% 사이를 잃을 것이며 최대 체중 감소는 감염 후 8-10일(dpi)에 발생합니다(그림 1C). 11-12dpi까지 마우스는 체중이 증가하기 시작해야 하며 14dpi 초기 체중의 10-15% 이내로 돌아와야 합니다. 재생 연구의 경우 실험에 참여한 대부분의 쥐가 체중이 감소하고 조직 손상을 경험하지만 죽지 않는 경우 유용합니다. 그러나 조직 손상의 이질성(그림 1A,B)과 비강내 투여의 가능한 가변성으로 인해 실험에서 여러 마우스가 체중 감소 또는 조직 손상을 경험하지 않고 여러 마우스가 >30% 체중을 감소시켜 안락사를 초래하는 것이 정상입니다(그림 1D). 예를 들어, 특정 유전자의 KO를 가진 마우스와 WT 대조군 사이의 생존 및 체중 감소의 차이를 결정하려고 노력하는 실험은 IAV의 역가와 용량을 조정해야 할 수 있으며 이러한 두 매개변수에서 이러한 차이를 감지하는 데 필요한 샘플 크기를 결정하기 위해 검정력 계산을 수행해야 합니다.

전반적인 조직 구조와 마우스 건강의 변화 외에도, 모든 폐 세포 구획에 대한 전사 변화는 손상에 대한 조직의 반응 과정에서 발생합니다. 여기에는 이행 또는 중간 상피 세포 상태 및 골수 면역 세포 상태를 포함하여 조직이 복구됨에 따라 궁극적으로 해결되는 일시적인 세포 상태와 Krt5+ 상피 세포 및 TrkB+ 내피 세포를 포함하여 기능적 복구에 기여하지 않는 지속적인 세포 상태가 모두 포함됩니다9. 예를 들어, 마우스 폐의 모세혈관 내피에서, 인터페론 자극 유전자의 높은 발현을 특징으로 하는 일시적인 인터페론 자극 내피 세포 상태가 6dpi에서 발생합니다(그림 2A). 이 상태는 11-19dpi로 해결됩니다(그림 2A). 손상 유발 모세혈관 내피(iCAP) 상태는 11dpi에서 발생하며, 이는 Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 및 Bnip3 의 높은 발현을 특징으로 합니다(그림 2B). 인터페론 자극 내피 세포 상태와 달리 iCAP 내피 세포 상태는 심각하게 손상된 조직의 영역에서 지속되며 감염 후 1년이 지난 후에도 여전히 존재합니다(그림 2C). 폐포 이행 세포 및 미성숙 폐포 I형 상피(AT1) 세포 상태를 포함한 일시적인 폐포 상피 세포 상태도 감염 후에 발생합니다(그림 2D). 마지막으로, 감염은 많은 내인성 폐포 대식세포(aMAC_a)의 손실과 염증성 단핵구(iMON)와 내인성 aMAC 모두에서 재구성을 초래합니다. 감염 후 1년의 폐포 대식세포는 기원에 따라 다른 전사 상태(aMAC_a 및 aMAC_b)를 갖습니다(그림 2E)9. 급성 폐 손상 후 발생하는 일시적이고 지속적인 세포 상태는 틈새 시장 내에서 비정상적인 행동이 성공적인 조직 복구 및 후속 조직 기능에 생산적 또는 부정적으로 기여할 수 있기 때문에 추가 연구가 필요합니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터는 이전에 발표되었으며9 유전자 발현 옴니버스에 GEO: GSE262927로 기탁되었습니다.

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그림 1: 폐 손상 및 동물 건강 모니터링. (A) 왼쪽의 모의 감염된(PBS 처리된) 폐와 오른쪽의 IAV 감염 폐에서 폐 조직 절편의 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색. 손상되지 않은 폐에 비해 IAV에 감염된 폐는 이질적인 조직 손상을 보입니다. 스케일 바, 1mm. (B) MATLAB20의 k-평균 클러스터링 알고리즘을 사용하여 조직 손상을 심각(빨간색), 손상(녹색) 또는 정상(파란색)으로 특성화할 수 있습니다. 왼쪽의 PBS 처리된 폐엽에서 기도 구조는 기도 상피 세포의 밀도와 염색 강도로 인해 "중증"으로 분류된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 이 기준선이 주어지면 PBS 처리된 폐와 인플루엔자 감염된 폐 사이의 차이를 쉽게 식별할 수 있습니다. 저울봉, 1mm. (C) 감염 후 13일(dpi)에 마우스 폐를 수집한 대표적인 IAV 감염 실험의 체중 감소 곡선의 예. 곡선에는 6마리의 야생형 마우스의 데이터가 포함되어 있으며 점은 평균을 나타내고 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. (D) 감염 후 14일(dpi)에 마우스 폐를 수집한 대표적인 IAV 감염 실험의 생존 곡선의 예. 곡선에는 7마리의 야생형 생쥐의 데이터가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: IAV 감염 후 모세혈관 내피 세포 상태 변화 모니터링. (A) 인터페론 자극 EC 상태는 11-19dpi 사이에서 해결되는 6dpi에서 발생합니다. 인플루엔자 감염 후 여러 다른 시점에서 마우스 폐에서 발표된 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터를 재분석한 결과 모든 모세혈관 내피 세포 유형에서 인터페론 모듈 점수가 6dpi에서 가장 높다는 것을 알 수 있습니다. 데이터는 R을 사용하여 재분석되었으며 인터페론 모듈 점수는 각 세포 유형 내에서 87개의 인터페론 자극 유전자의 발현을 기반으로 합니다. CAP1, 모세혈관 유형 1 내피 세포; iCAP, 손상 유발 내피 세포; CAP2, 모세혈관 유형 2 내피 세포; EC, 내피 세포. (B) 대조적으로, Ntrk2(TRKB)의 발현을 특징으로 하는 손상 유발 EC 상태는 11dpi에서 발생하고 감염 후 최대 1년까지 지속됩니다. 스케일 바, 500μm. (C) 인플루엔자 감염 후 폐 모세혈관 내피 세포의 단일 세포 RNA 시퀀싱의 전사 데이터는 조직 복구 중 모세혈관 내피 세포 상태의 동적 특성을 보여줍니다. (D) 폐포 상피 세포는 또한 인플루엔자 감염 후 세포 가소성을 경험합니다. 폐포 이행 세포 유형은 6-11dpi 사이에서 발생하고 19dpi로 분해됩니다. 미성숙 AT1 세포 상태(AT1_c)는 11dpi에서 발생하고 90dpi까지 지속됩니다. (E) 감염 후 기존의 많은 폐포 대식세포(aMAC_a)가 손실되고 염증성 단핵구(iMON)의 유입이 6dpi에서 나타납니다. 폐포 대식세포 집단은 aMAC_a 집단을 재생하기 위해 기존 aMAC에 의해 재구성되고 염증성 단핵구에 의해 aMAC_b 집단을 생성합니다. 둘 다 폐포 대식세포 상태를 나타내지만 생성된 aMAC은 전사적으로 구별될 수 있습니다. (C-E)의 그래프는 종단 인플루엔자 감염 데이터 세트의 각 시점에서 각 집단의 세포 비율을 나타내며 R을 사용하여 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 인플루엔자 감염 후 동물을 모니터링하기 위한 샘플 부상 기록, 체중 기록 및 신체 상태 점수(BCS) 기록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에서 우리는 인플루엔자 바이러스를 마우스로 옮겨 마우스 폐에 빠르고 효과적인 손상을 시작하고 성공적인 재생 및 이형성 복구 메커니즘을 연구하는 편리한 방법을 보고했습니다. 우리는 A/PR/8/34 IAV의 비강내 접종이 스트레스 없는 기술이 될 수 있음을 보여줍니다. 이소플루란 마취 후 접종을 완료하는 데 마우스당 2분 미만이 소요됩니다. 이는 자연적인 감염 경로를 따르는 간단하고 비침습적인 바이러스 접종 기술이며 보다 생리학적으로 관련성이 높은 방식으로 조직과 면역 체계의 반응을 연구할 수 있습니다. 마우스 콧구멍을 통해 접종된 바이러스는 점막 및 전신 면역을 모두 유도할 수 있습니다21. 더 중요한 것은 바이러스 감염으로 인한 손상이 헤마트실린 및 에오신(HE) 염색으로 염색된 폐 조직 절편에서 명확하게 볼 수 있다는 것입니다22 (그림 1). 폐의 각 구획에서 폐 세포 유형에서 예상되는 전사 변화에 대한 완전한 타임라인은 이전에 발표되었습니다9. 여기에서, 우리는 이 데이터의 하위 집합을 재분석하여 마우스 폐의 모세혈관 내피, 폐포 상피 및 골수 면역 구획에서 감염되지 않은 마우스의 인플루엔자 감염에 대한 반응 과정에서 일시적이고 지속적인 전사 변화가 감염 후 최대 1년까지 발생한다는 것을 입증했습니다(그림 2).

이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있으며 이러한 단계를 적절하게 해결하면 성공적인 실험이 가능합니다. A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스는 인간을 생산적으로 감염시키지 않는 마우스 적응 인플루엔자 변종이지만23, 실험실 직원의 감염 가능성을 피하기 위해 실험 중에 표시된 모든 안전 절차를 따르는 것이 항상 중요합니다. 이소플루란 마취 투여는 생쥐가 깨어 있을 때 바이러스를 잘 흡입하지 못하기 때문에 바이러스의 성공적인 전달을 보장하는 중요한 단계입니다. 시술 중 호흡을 확인하고 마우스 머리의 움직임을 모니터링하여 바이러스가 양쪽 콧구멍에 접종되었는지 확인하십시오. 생쥐가 완전히 마취되지 않으면 기포가 생성되어 바이러스 흡입을 제한하고 에어로졸을 생성할 수 있습니다. 두 가지 결과를 모두 피해야 하며, 콧구멍에서 재채기나 거품이 관찰되면 마우스를 이소플루란 코콘에 다시 놓아야 합니다. 체중 감소, 신체 상태 점수, 건강 상태 측정, 회복 식품 보충제 제공 등 감염 후 모니터링도 이 실험의 중요한 구성 요소입니다. 마우스가 적절한 체중을 감량하지 않거나 예상되는 양의 조직 손상이 없는 것으로 관찰되면(그림 1), 용량이 너무 낮을 수 있습니다. 반면에 많은 마우스가 30%의 체중 감소 종점에 도달하면 용량이 너무 높을 수 있습니다. 두 경우 모두 여기에서 설명하는 것처럼 C57BL/6 마우스 코호트를 사용하여 로트 바이러스의 경험적 역가를 통해 적절한 용량을 결정하는 것이 가장 좋습니다.

인플루엔자 감염은 전 세계적으로 계속 만연하고 심각한 호흡기 질환을 유발하며 치명적일 수 있기 때문에 바이러스 감염 과정과 감염 및 폐 조직 손상에 대한 세포 반응을 이해하는 것이 가장 중요합니다. 따라서 이 연구에서 설명한 비강내 감염 방법은 중요한 조절 메커니즘을 식별하고 폐 질환에 대한 새로운 치료 접근법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 기술의 향후 적용에서는 반복적인 호흡기 감염의 경우 폐 조직 구조 및 기능에 미치는 영향을 결정하기 위해 X31과 같은 다른 쥐 적응 인플루엔자 바이러스 변종을 사용할 수 있습니다. 많은 사람들이 일생 동안 다발성 호흡기 감염에 걸리기 때문에 이 모델의 이러한 확장은 폐 조직 재생 연구와 공중 보건에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(NIH), 국립암연구소, 암연구센터의 교내 연구 프로그램의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 튜브 & nbsp;피셔 사이언티브02-682-557
100 & 마이크로; M 세포 체감기팔콘352360
15 mL 원뿔형 튜브팔콘352196
1배 PBSGibc010010-023
40 & 마이크로; M 세포 체감기팔콘352340
5 mL 튜브지구본6101C
50 mL 원뿔관팔콘352098
A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스 재고ATCC VR-95PQ각 로트마다 바이러스 역가가 다릅니다
ACK 용해 버퍼퀄리티 바이오컬118-156-101
항-TRKB 항체R& D 시스템즈AF1494
표백제클로록스표백제 10%
소 혈청 알부민시그마 올드리치A8022
CO2 마취 유도실어떤 것이든해당 없음
콜라게나제형 I깁코17100017
다피밀리포어 시그마28718-90-3
분산코닝CB-40235
해부 도구: 가위, 곡선 겸자, 직선 겸자어떤 것이든해당 없음
드나스시그마 올드리치4716728001
D-PBS코닝21-031-CM
에탄올파르코111000200
유리 바이알DWK 생명과학986562
아이스 버킷어떤 것이든해당 없음
이소플루란코베트루스29404
주사바늘, 21– 23 G어떤 것이든해당 없음
P20/P200 피펫  피펫맨F144056M/F144058M,
P20/P200 피펫 팁토마스 사이언티픽1159M43/1159M40
파라포름알데히드 (PFA)와 nbsp;써모 사이언티픽J19943-k22% PFA
피펫맨어떤 것이든해당 없음
플라스틱 또는 골판지 냉동실어떤 것이든해당 없음
면도날어떤 것이든해당 없음
링 스탠드어떤 것이든해당 없음
혈청학적 피펫, 5 mL팔콘357543
슬라이드 상단 유도 마우스 이소플루란 챔버솜니 사이언티픽
봉합사피셔 사이언티브NC9422522
주사기 튜브와 루어 락어떤 것이든해당 없음
주사기, 10 mL어떤 것이든해당 없음
탁상용 마취기 이소플루란오메다오메다 이소텍- 4유량은 2.5와 ndash여야 합니다; 3%
초저녹 아가로스시그마 올드리치A5030-1G
저울을 맞추기오하우스CS200

참고문헌

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