CD44는 PI3K/Akt 경로 활성화를 통해 염증 캐스케이드 및 파골세포 분화를 조율하여 질병 발병을 촉진합니다. 글리시테인은 CD44 매개 신호의 표적 감쇠를 통해 동반이환 골다공증(OP) + 치주염(PD) 증상에 치료 효과를 발휘합니다.
연구 논문
CD44는 PI3K/Akt 경로 활성화를 통해 염증 캐스케이드 및 파골세포 분화를 조율하여 질병 발병을 촉진합니다. 글리시테인은 CD44 매개 신호의 표적 감쇠를 통해 동반이환 골다공증(OP) + 치주염(PD) 증상에 치료 효과를 발휘합니다.
이 연구는 단백질체 프로파일링을 통해 골다공증(OP) 및 치주염(PD)의 동반이환과 관련된 중요한 분자 결정 요인을 밝히는 동시에 OP 쥐 모델의 실험적 치주염에서 CD44의 조절 기능을 설명합니다. 1상에는 비교 단백질체 분석을 위해 우리 기관에서 일상적인 건강 평가를 받는 OP+PD 환자(n = 3) 및 건강한 대조군(n = 6)으로부터 혈청 표본을 수집하는 것이 포함되었습니다. 차등적으로 발현된 유전자(DEG) 및 관련 신호 캐스케이드의 후속 번역 검증은 임상 표본 및 OP+PD 쥐 모델에서 수행되었습니다. 골다공증 상태에서 PD 진행에서 CD44의 역할을 기계적으로 특성화하기 위해 양측 난소 절제술을 통해 OP 쥐 모델을 생성한 후 결찰 배치를 통한 실험적 PD 유도를 수행했습니다. 포괄적인 평가에는 헤마톡실린-에오신 염색을 통한 조직형태학적 변화, 마이크로 CT를 사용한 상악 제1대구치 부위의 미세구조 뼈 분석, 포스포이노시티드-3-키나아제(PI3K)/Akt 경로 성분의 면역블로팅 평가가 포함되었습니다. 치료 가능성이 있는 Angelica sinensis의 생리 활성 성분을 식별하기 위해 분자 도킹 시뮬레이션과 결합된 병렬 네트워크 약리학적 스크리닝을 실행했습니다. 단백질체학 조사는 CST3, A2M, CD44, CDH13, CETP 및 VWF를 OP+PD 병인의 후보 병원성 매개체로 확인했습니다. 우리 손에서 유전자 세트 농축 분석을 통해 PI3K/Akt 신호 전달이 OP+PD 질병 진행의 주요 매개체로 기능한다는 것이 밝혀졌습니다. 정량적 역전사 PCR 기반 검증은 임상 및 실험적 OP+PD 코호트 모두에서 상당한 CD44 상향 조절을 확인했습니다. CD44 억제를 통한 생체 내 조절은 PI3K/Akt 경로 억제와 함께 OP 마우스에서 치주 조직 무결성을 유의하게 회복시키고, 염증 세포 침윤을 감소시키며, 치조골 미세 구조를 강화했습니다. 네트워크 약리학은 글리시테인이 안젤리카 시넨시스의 주요 생리 활성 식물 화학 물질로 밝혀졌으며 CD44가 중심 분자 표적으로 확인되었습니다. 글리시테인은 OP+PD 마우스의 치조골 구조를 개선하여 골 부피 분율(BV/TV), 섬유주 두께(Tb.Th), 골밀도(BMD)를 증가시키고 섬유주 수(Tb.N), 뼈 표면 대 뼈 부피 비율(BS/BV)을 감소시켜 기계적으로 CD44 신호 축 감쇠에 기인합니다.
치주염(PD)은 치은 고랑에 병리학적 생물막이 침착되어 발생하는 복잡하고 혼합된 미생물 질환입니다1. 이는 숙주 내에서 병리학적 염증 캐스케이드를 유발하는 미세생태학적 환경의 불균형을 특징으로 하며, 궁극적으로 치주 부착 시스템의 구성 요소인 백악질, 치주 인대 및 치조골에 돌이킬 수 없는 점진적인 손상을 초래합니다. 이로 인해 치아가 풀리거나 심지어 손실될 수도 있습니다2. 수량은 비교 가능성을 위해 표준화되었으며, 가장 최근의 역학 데이터3 에 따르면 전 세계적으로 10억 6,600만 명 이상의 개인이 중증 치주염을 앓고 있으며 연령 표준화된 유병률은 약 12.5%로 국제 인구 전반에 걸쳐 상당한 차이가 있음을 강조합니다.
전신 뼈 질환인 골다공증(OP)은 뼈 미세 구조의 실질적인 저하와 골량의 체계적인 손실을 특징으로 합니다 4,5. 골절의 위험은 특히 노인의 경우 이러한 구조적 약점으로 인해 크게 증가합니다. 특히 일본에서는 65세 이상 인구가 30세에서 64세 사이의 성인보다 치주 질환 유병률이 높았습니다. 폐경 후 여성은 치주 질환 발병률이 더 높으며 종종 다른 건강 문제를 경험합니다 6,7. 이 연구는 2005년부터 2025년까지 질병 부담이 50% 이상 증가할 것이며 경제적 비용은 170억 달러에서 250억 달러로 증가할 것으로 예상됩니다. 이 연구는 2005년부터 2025년까지 질병 부담이 50% 이상 증가할 것이며 경제적 비용은 170억 달러에서 250억 달러로 증가할 것으로 예상됩니다. 이러한 추세는 이러한 치주 질환이 사회경제적으로 미치는 중대한 영향을 강조합니다. 또한, 치주질환과 치은염이 있는 여성 환자의 경우 질병의 기간과 만성, 건강 위험 증가 사이에는 분명한 양의 상관관계가 있습니다8.
이전 연구에서는 OP가 노화, 흡연, 부적절한 칼슘 및 비타민 D 섭취와 같은 두 질병의 공통 위험 요소로 인해 PD의 발병을 촉진할 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지라고 밝혔습니다. 폐경 후 여성 인구에서 심각한 OP는 하악 미네랄 함량 감소를 동반할 수 있으며, 이는 치주 부착 수치 부족과 관련될 수 있습니다9. OP 관련 골밀도 감소는 PD 유발 치조골 흡수를 가속화하여 치주 병원균의 침입을 촉진할 수 있음이 입증되었습니다10. 연령 및 생리적 변화와 관련된 다양한 건강 문제 중에서 PD와 OP는 전 세계 인구 고령화가 가속화되고 폐경기 여성 수가 크게 증가함에 따라 특히 두드러집니다. 따라서 관련 지표와 이들의 연관성을 명확히 하는 것은 질병 예방, 치료 및 예후 평가에 매우 중요합니다. 이러한 측면에 동기를 부여받은 이 연구는 OP+PD 개발에서 CD44 매개 PI3K/Akt 신호 전달에 중점을 두고 단백질체학을 사용하여 주요 단백질을 스크리닝하고 OP 마우스에서 실험적 PD 모델을 사용하여 핵심 단백질의 조절 역할과 가능한 메커니즘을 탐색했습니다. 항염증 및 뼈 보호 특성으로 인해 임상 실습에서 널리 사용되는 중국 전통 약초 인 안젤리카 시넨시스에 존재하는 표적 치료제에 대한 추가 스크리닝은 이전에 골다공증 및 치주 질환에서 뼈 손실을 완화하고 염증 반응을 조절하는 것으로 보고되었습니다. 네트워크 약리학 및 분자 도킹에 따라 글리시테인은 주요 생리 활성 식물 화학 물질이자 OP+PD 개입을 위한 합리적인 후보로 확인되었습니다.
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모든 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 동물 윤리 위원회에서 검토하고 승인했습니다. 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
이 연구는 골다공증 및 치주염(OP+PD)을 동반하는 동안 파골세포 분화 및 염증 진행에서 PI3K/Akt 경로의 CD44 매개 조절의 역할을 평가하고 Angelica sinensis의 생리 활성 화합물인 글리시테인이 이러한 효과를 치료적으로 조절할 수 있는지 여부를 결정하는 것을 목표로 합니다. 이론적 근거는 CD44 과발현을 OP+PD의 병리학적 골 흡수 및 면역 조절 장애와 연결하는 새로운 증거에서 비롯됩니다 11,12,13. 단백질체학, 생체 내 모델링 및 네트워크 약리학을 통합함으로써 프로토콜은 질병 진행을 완화하기 위한 분자 메커니즘 및 치료 개입을 체계적으로 조사합니다14.
생체 내 실험의 표본 크기는 이전 연구 및 검정력 분석을 기반으로 하여 그룹당 n = 6을 가져와 치료 조건 전반에 걸쳐 유의미한 차이(P < 0.05)를 감지할 수 있는 적절한 통계적 검정력을 보장합니다. 글리시테인은 50mg/kg 및 100mg/kg 용량으로 투여되고 올리브 오일의 5% DMSO에 현탁되어 매일 경구 위관을 통해 전달되었습니다. 마우스는 PD 유도 후 8주 동안 모니터링되었습니다. 치주 염증을 유도하기 위한 결찰사 배치는 5-0 실크실을 사용하였고, 양측 난소 절제술은 0.3% 펜토바르비탈 나트륨 마취(0.5mL/100g)하에 수행되었습니다15. 또한, RT-qPCR, 웨스턴 블로팅 및 ELISA를 포함한 분자 분석은 검증된 프로토콜16을 사용하여 수행되었으며, 헤마트톡실린-에오신(H&E) 및 메틸렌 블루 염색과 같은 조직학적 평가는 확립된 일정 및 염색 기간을 따랐습니다.
화학 시약, 염색제 및 생물학적 표본과 관련된 모든 실험 절차는 건강 위험을 최소화하기 위해 표준 생물 안전 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 포르말린, EDTA, 메틸렌 블루, 산성 푹신과 같은 위험 물질은 장갑, 마스크, 보안경을 포함한 개인 보호 장비(PPE)로 취급되었습니다. 사용한 시약과 오염된 일회용품을 포함한 모든 폐기물은 지정된 생물학적 위험 용기에 수거되어 기관 및 환경 안전 지침에 따라 인증된 유해 폐기물 처리 서비스를 통해 폐기되었습니다. 그림 1 은 전체 실험 워크플로를 보여줍니다.
임상 데이터 수집
본 연구에서는 인구통계학적 및 생활 방식 요인, 해부학적 및 전이성 프로필을 포함하여 3명의 OP+PD 환자와 6명의 대조군 피험자의 기본 임상 데이터와 상세한 병력을 체계적으로 수집하고 종합적으로 분석했습니다. 또한 HPV 감염 검사 결과(양성 또는 음성)에 대한 엄격한 확인이 이루어졌습니다. 전이성 병변의 진행 단계 또는 재발 패턴을 자세히 기록했습니다. 면역요법 첫 7일 동안 환자의 혈액 샘플을 체계적으로 수집하고 혈액 정기 검사와 같은 생화학적 지표를 포함하여 표준화했습니다. 혈소판, 림프구, 호중구 등 주요 매개변수를 정확하게 평가하기 위해 표준 절차에 따라 정기 혈액 검사를 엄격하게 수행했습니다. 혈청 알부민을 병행하여 측정하였고, 글로불린 농도 지수의 정량적 분석을 통해 간 기능을 평가하였다.
환자
골밀도 평가 및 참가자 계층화
요추 부위와 대퇴골 경부의 골밀도 측정을 체계적으로 비교했습니다. 모든 검사는 우리 부서의 숙련된 방사선 전문의가 정밀 장비를 사용하여 골밀도 값을 정확하게 정량화하여 수행했습니다. 표준화된 샘플 수집을 보장하기 위해 참가자는 샘플링 전에 최소 8시간 동안 금식해야 했습니다. 골밀도 데이터와 종합 치주 평가 데이터를 통합하여 피험자를 치주염을 동반한 골다공증(OP+PD) 그룹과 건강한 대조군(HC)으로 엄격하게 분류하여 두 그룹 간의 성비가 완벽하게 일치하도록 했습니다. 성별 매칭은 OP+PD와 건강한 대조군 사이에 여성이 균등하게 분포되는 것을 의미합니다. 그러나 폐경 후 골다공증에 초점을 맞추기 위해 이 연구에는 여성 참가자만 포함되었습니다. 두 그룹 모두 남성 피험자가 없었습니다. 이 연구는 헬싱키 선언의 윤리적 지침을 준수했으며 모든 참가자는 공식 정보에 입각한 동의서에 서명하여 자신의 권리를 완전히 보호했습니다.
진단 매개변수
골다공증은 원발성 골다공증의 진단 및 관리를 위한 중국 지침(2022)17에 따라 정의되었으며, 요추(L1-L4) 또는 고관절 BMD에 대한 진단 역치는 T-점수 ≤ -2.5 표준 편차(SD)로 설정되었습니다. 치주염 병기는 2018년 세계 치주 질환 워크숍 분류18에 따라 포함되며 포함은 A등급, II-III기 사례로 제한되었습니다. 포함 기준: 50-65세의 폐경 후 여성, 위의 기준을 충족하는 OP 및 PD의 이중 진단, 자가면역 질환의 부재, 악성 신생물의 병력 없음, 정상적인 심폐, 간 및 신장 기능. 제외 기준: 환자 또는 가족의 참여 거부, OP 또는 PD에 대한 최근(≤6개월) 약물 요법.
혈청 샘플의 단백질체 프로파일링
단백질체 분석을 위해 3명의 OP+PD 환자와 6명의 대조군 피험자로부터 혈청 샘플을 수집했습니다. 상대 단백질 정량화는 표준 절차를 통해 달성되었으며, 차등적으로 발현된 단백질은 P < 0.05 및 배수 변화 > 1.519인 단백질로 정의되었습니다.
유전자 세트 농축 분석(GSEA)
GSEA는 대조군과 OP+PD 코호트 사이에서 조절 장애가 있는 주요 신호 전달 경로를 식별하는 데 사용되었습니다. 원시 전사체 데이터는 먼저 log2 변환을 사용하여 변환되고 분위수 정규화를 통해 정규화되어 배치 효과를 제거했습니다. 여러 생물학적 기능을 가진 유전자 세트는 MSigDB(Molecular Signatures Database)에서 선별되었고 비모수 Wilcoxon 순위 합계 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 평가했습니다. 농축 결과는 정규화된 농축 점수와 잘못된 발견률(FDR < 0.25)을 사용하여 보고되었습니다.
가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석(WGCNA)
WGCNA는 OP+PD 표현형과 유의미하게 관련된 유전자 모듈을 식별하는 데 사용되었습니다. 스케일 프리 네트워크 토폴로지(R2 > 0.85)를 달성하기 위해 12의 소프트 임계값 검정력을 선택했으며, Pearson 상관 분석을 사용하여 모듈 고유유전자와 임상 특성 간의 관계를 평가했습니다. 강력한 상관 관계가 있는 모듈에서 관련 생물학적 경로를 밝히기 위해 기능적 농축 분석이 수행되었습니다.
난소 절제술 유도 골다공증 쥐 모델 확립
이 연구에는 116마리의 SPF 등급 암컷 마우스가 참여했습니다. 실험 전에 동물들은 7일간의 적응 단계 동안 통제된 온도와 습도 조건에서 사육되었으며, 그 동안 표준화된 설치류와 증류수를 제공했습니다. 모든 동물 취급 절차는 승인 ID 0609에 따라 Xi'an Jiaotong University Health Science Center의 윤리 위원회에서 승인한 윤리 프로토콜을 엄격히 따랐습니다. 이 연구는 프로젝트 번호 [2024-054]로 등록되었습니다.
양측 난소 절제술(OVX) 수술 프로토콜:
마우스는 0.3% 펜토바르비탈 나트륨(0.5mL/100g 체중)의 복강내 주사를 통해 마취되었습니다. 등쪽 털은 외과적으로 제모되었고 동물은 가열된 멸균 수술 플랫폼에서 등쪽 누운 자세로 배치되었습니다. 75% 에탄올로 무균 준비 후 신장 지방 패드 수준에서 양측 척추주위 절개(척추 측면 1cm)를 만들었습니다. 난소 활액낭을 외부화하고 난관을 5-0 실크 봉합사를 사용하여 난소 근위부에 결찰한 후 양측 난소, 관련 지방 조직 및 부분 난관 구조를 절제했습니다. 근막층과 피부층은 4-0 흡수성 봉합사로 순차적으로 봉합하였다. 수술 후 소독은 75% 에탄올로 수행되었습니다.
가짜 수술 통제:
가짜 수술 마우스는 난소 적출 없이 난소 노출 및 주위 지방 조직 절제를 포함한 동일한 절차 단계를 거쳤습니다.
수술 후 관리:
마취 후 회복은 완전히 보행할 때까지 순환 온수 패드를 사용하여 촉진되었습니다. 수술 후 72시간 동안 카프로펜 피하 투여(매일 5mg/kg)를 통해 진통을 유지하고, 수술 부위 감염을 예방하기 위해 48시간 동안 예방적 페니실린 G(50,000 IU/kg)를 보충했습니다. 체질량은 6주간의 골다공증 모델링 단계 동안 매주 모니터링되었으며, 제외 기준은 >20%의 체중 감소 또는 임상적 고통을 보이는 동물에 적용되었습니다.
실험용 OP+PD 동물 모델 구축
실험용 PD 모델은 이전에 확립된 OP 동물 모델을 기반으로 개발되었습니다. 실 파손을 방지하고 어금니 사이의 원활한 삽입을 보장하기 위해 결찰에 5-0 실크 봉합사를 사용했습니다. 시술 중 쥐의 입가를 부드럽게 집어넣고 집게로 실을 잡고 제1대구치와 제2대구치 사이의 경추 부위에 조심스럽게 배치했습니다. 협측 점막에 대한 외상을 최소화하기 위해 와이어와 겸자 끝을 수평으로 유지하여 출혈이나 사망 위험을 줄였습니다. 다른 손은 와이어의 반대쪽 끝을 부드럽게 당겨 어금니 사이의 치간 공간으로 점차적으로 안내했습니다. 실이 적절하게 배치되면 협측 근처의 부분을 겸자로 고정하고 동일한 기술을 사용하여 제2대구치와 제3대구치 사이를 조심스럽게 통과시켰습니다. 부드러운 아래쪽 견인력으로 실크가 원활하게 통과할 수 있었습니다. 마지막으로 실은 경추 중간 부위의 제2대구치 주위에 단단히 묶였습니다. 이후 생쥐는 회복할 수 있었습니다.
정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)
재료 표에는 CD44, CDH13, VWF 및 GAPDH를 포함하여 염증, 응고 및 세포 접착과 관련된 유전자를 표적으로 하는 RT-qPCR에 대한 특정 정방향 및 역방향 프라이머 서열이 나열되어 있습니다. RT-qPCR 분석에 사용되는 프라이머 서열은 표 1에 요약되어 있습니다.
웨스턴 블롯 분석
치주 조직에서 주요 신호 전달 경로 단백질의 발현 특성을 웨스턴 블로팅을 사용하여 체계적으로 연구했습니다. 치주 조직은 프로테아제와 포스파타제 억제제를 함유한 RIPA 완충액을 사용하여 동결-해동 균질화를 거쳐 총 단백질을 효율적으로 추출하였다. 용해물을 분리하기 위해 고속 원심분리(12,000× g, 4°C, 10분)한 후, 상청액을 사용하여 BCA 키트로 단백질 농도를 정확하게 측정하여 후속 실험에 신뢰할 수 있는 데이터를 제공했습니다.
각 실험군에 대해 총 단백질 30μg을 로딩하고 10% SDS-PAGE 시스템을 통해 분리했습니다. 그런 다음 분해된 단백질을 반건식 블로팅 방법을 사용하여 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. 배경 간섭을 최소화하기 위해 멤브레인은 주변 온도에서 h 동안 5% 무지방 분유로 차단되었습니다. 그 후, 멤브레인은 추가 처리를 위해 안정적인 환경에서 4°C로 유지되었습니다.
그런 다음 멤브레인을 특정 1차 항체( 재료 표 참조)와 함께 °C에서 2시간 동안 배양했습니다. 다음날 TBST 완충액을 사용하여 철저한 세척을 한 다음 멤브레인을 HRP 접합 2차 항체로 실온에서 1.5시간 동안 1:10,000 희석으로 처리했습니다. 모든 면역검출 단계는 신호 전달 경로 분석의 일관성과 타당성을 보장하기 위해 표준화된 프로토콜에 따라 엄격하게 수행되었습니다20.
증강화학발광(ECL) 기질을 사용하여 신호를 캡처하고 고해상도 이미징 장비를 사용하여 단백질 밴드를 정확하게 찾아 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드의 광학 밀도 값을 정량적으로 분석했습니다. 궁극적으로 각 그룹의 표적 단백질/β-액틴의 상대적 발현 수준을 대조군과 체계적으로 비교함으로써 다양한 개입 하에서 PI3K/Akt 경로의 활성화 정도와 동적 변화를 정확하게 평가했습니다.
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)
ELISA 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 이 연구는 혈청 샘플에서 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-4를 포함한 다양한 염증성 사이토카인의 정확한 정량화를 달성했습니다. 또한 파골세포 활동의 마커로서 TRAP5b, ALP 및 TGF-β의 농도를 평가했습니다. 포획 항체로 사전 코팅된 96웰 플레이트를 PBS에서 1:10으로 희석한 혈청 샘플과 함께 25°C에서 2시간 동안 배양하여 항원이 고정화된 포획 항체에 특이적으로 결합할 수 있도록 했습니다. 배양 후, PBS-T(Tween-20을 사용한 인산염 완충 식염수)를 사용하여 세 번의 세척을 통해 결합되지 않은 물질을 제거했습니다. 이어서, 비오틴 표지 검출 항체를 첨가하고 동일한 온도에서 1시간 동안 배양했습니다. 다음으로, 스트렙타비딘-HRP를 도입하여 비오티닐화된 항체에 결합하고, 혼합물을 빛 보호 조건에서 실온에서 추가로 20분 동안 배양했습니다. 그런 다음 정지 용액을 사용하여 효소 반응을 종료하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 사이토카인 농도를 결정했습니다.
헤마트실린 & 에오신(H&E) 염색
미세 구조 변화를 분석하기 위해 치주 조직의 파라핀 포매 절편에 H&E 염색을 수행하는 데 표준 방법을 사용했습니다. 샘플 준비 공정은 4% 파라포름알데히드 용액에 24시간 동안 초기 고정한 후 등급별 에탄올 탈수(70%, 80%, 95% 및 100%)를 수행하고 자일렌에서 투명화한 후 마지막으로 파라핀에 포획하여 4μm 두께의 절편을 생성하는 과정을 포함했습니다21. 자일렌에서 탈랍한 후, 샘플은 내강된 에탄올 농도(100% 내지 70%)를 통해 재수화되었습니다. 염색 과정은 헤마트톡실린(마이스너's)에 5분 동안 담근 후 흐르는 물에 헹구고 에탄올의 1% 산성 알코올로 분화한 후 다시 헹구는 것으로 시작되었습니다. 그런 다음 프로토콜을 완료하기 위해 10초 동안 절편을 0.5% 에오신으로 염색했습니다.
염색 후, 슬라이드를 등급이 매겨진 에탄올 시리즈에서 다시 탈수하고 자일렌에서 제거한 다음 마운팅 매체로 밀봉했습니다. 고해상도 이미지 획득을 위해 10x 및 40x 대물렌즈가 장착된 현미경에서 관찰이 이루어졌습니다. 조직학적 분석은 치주 결합 조직의 구조적 완전성, 염증 세포 침윤 및 치조골 흡수 형태를 평가했습니다. 염증 수준은 개선된 Loe-Silness 지수를 사용하여 점수를 매겼으며, 표본 정체성에 대해 눈이 먼 두 명의 병리학자가 객관성과 재현성을 보장하기 위해 반정량적 척도를 통해 샘플을 독립적으로 평가했습니다22.
메틸렌 블루 염색
이 연구는 뼈 흡수 정도를 정량화하기 위해 표준화되고 처리된 상악 치조골 절편에 메틸렌 블루 염색 방법을 사용했습니다. 실험 절차는 조직 고정으로 시작되었습니다: 치주 조직을 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 동안 고정한 후 10% EDTA(pH 7.4) 용액에서 21일 동안 석회질 제거 처리를 했습니다. 석회질 제거 후, 샘플을 파라핀 포매하고 4μm 두께의 조직 절편으로 준비한 다음 실란화된 슬라이드에 장착했습니다. 절편 전처리 공정에는 자일렌 탈랍, 그래디언트 에탄올 수화 및 60°C 수조에서의 배양이 포함되었습니다. 그런 다음 슬라이드를 0.1% 메틸렌 블루 용액으로 15분 동안 염색했습니다.
염색 후, 60°C로 예열된 증류수를 사용하여 절편을 1분 동안 세척하여 조직 구조를 손상시키지 않고 과도한 염료를 효과적으로 제거했습니다. 그런 다음 조직 구조 간의 대비를 향상시키기 위해 5분 동안 0.1% 산성 푹신으로 대조염색했습니다. 이 염색 프로토콜은 치조골 흡수의 정량적 분석을 위한 일관되고 신뢰할 수 있는 시각화를 제공했습니다23. 마지막으로, 슬라이드는 등급이 매겨진 에탄올을 사용하여 탈수되고 자일렌에서 제거되고 장착되었습니다. 염색된 뼈 조직을 광장 현미경으로 분석하고, 고해상도 이미지를 획득하여 후속 형태학적 평가를 위해 치조골 가장자리 흡수를 정밀하게 평가했습니다.
마이크로 컴퓨터 단층촬영(Micro-CT) 분석
특히 상악 제1대구치 부위를 표적으로 하는 OP+PD 모델 마우스의 치조골의 3D 미세 구조 변화를 평가하기 위해 Micro-CT 스캐닝을 수행했습니다. 수술 후 8주간의 모니터링 후, 악안면 구조를 보존하는 데 적합한 방법인 CO2 흡입을 통해 마우스를 인도적으로 안락사시켰습니다. 그런 다음 상악 표본을 채취하여 4°C에서 48시간동안 4% 파라포름알데히드에 고정했습니다.
Micro-CT 분석은 스캔된 표본에 해당하는 데이터 세트를 선택하여 소프트웨어로 가져온 상악 부위의 재구성된 DICOM 이미지로 수행되었습니다. 표준 관심 영역(ROI)은 시상 및 관상 보기에서 치조골 구조의 윤곽을 그려 상악 제1대구치 뿌리의 근심 협측 1/3 부분으로 수동으로 정의되었으며, 일반적으로 약 50개의 연속 슬라이스가 포함되어 해당 영역을 완전히 덮었습니다.
섬유주골을 주변 연조직 및 배경에서 분리하기 위해 180-220 mgHA/cm3 의 밀도 임계값을 적용했습니다. 그런 다음 분절을 수행하여 섬유주골만을 나타내는 이진 구조를 생성했습니다. 형태 측정 분석은 소프트웨어 내에서 Bone Morphometry Module을 사용하여 수행되었습니다. 골 부피 분율(BV/TV), 섬유주 두께(Tb.Th), 섬유주 수(Tb.N), 뼈 표면 대 뼈 부피 비율(BS/BV) 및 골밀도(BMD)를 포함한 매개변수가 자동으로 계산되었습니다. 분석 후 수치 결과를 스프레드시트로 내보냈습니다.
이러한 측정은 OP+PD 병리학적 상태와 관련된 치조골의 미세 구조 손상 정도를 평가하고 뼈의 질 회복에 있어 글리시테인의 치료 효능을 평가하는 데 사용되었습니다. 이 접근 방식을 통해 치주골 환경의 구조적 무결성에 대한 고해상도, 재현 가능, 정량적 평가가 가능해 치료 결과에 대한 주요 형태학적 통찰력을 제공할 수 있었습니다.
네트워크 약리학 프로파일링
동반이환 골다공증 및 치주염(OP+PD)과 관련된 주요 생물학적 경로를 조절할 수 있는 한의학(TCM)의 생리 활성 성분을 체계적으로 조사하기 위해 이 연구는 네트워크 약리학 접근 방식을 사용하여 안젤리카 시넨시스를 분석했습니다. 이 식물은 골다공증 및 만성 잇몸 질환과 관련된 증상을 포함하여 뼈 관련 장애 및 염증을 관리하기 위해 TCM에서 역사적으로 사용된 것을 기반으로 선택되었습니다. 화합물 스크리닝 단계에서 안젤리카 시넨시스의 활성 성분은 TCMSP 및 TCMID 데이터베이스[데이터베이스 세부 정보가 ToM으로 이동됨]를 사용하여 검색되었고 경구용 생체이용률(OB) ≥ 30% 및 약물 유사성(DL) ≥0.18 기준을 사용하여 필터링되었습니다. 화합물-표적 상호작용은 DisGeNET 및 OMIM을 통한 표적 부위 검증과 함께 STITCH를 사용하여 예측되었습니다. 경로 농축 분석은 선택된 화합물에 의해 잠재적으로 조절되는 KEGG 신호 전달 경로를 식별하기 위해 DAVID 2021 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 분자 상호 작용을 시각화하기 위해 위상 지수(차수 중심성, 중간 중심성)를 기반으로 "화합물-표적-경로" 네트워크를 구축했습니다. 분석 결과 천연 플라보노이드인 글리시테인이 유리한 약동학적 특성과 CD44에 대한 강한 결합성을 가진 화합물로 확인되어 OP+PD에 대한 잠재적인 치료 관련성을 시사합니다. 그러나 글리시테인은 골다공증이나 치주염 치료용으로 임상적으로 승인되지 않았습니다. 이러한 발견은 인실리코 예측을 기반으로 하며 후속 생체 내 검증 실험을 위한 이론적 틀을 제공합니다 25.
분자 도킹 검증
CD44(PDB ID: 1UUH) 및 PI3K(PDB ID: 4L23)의 단백질 구조는 RCSB 단백질 데이터 뱅크(https://www.rcsb.org)에서 검색되었습니다. 리간드 구조(글리시테인, 리구스틸리드)는 분자력장을 이용한 에너지 최소화를 통해 최적화되었습니다. 도킹 시뮬레이션은 100회 실행, 모집단 크기 150 및 25×106 회 에너지 평가 매개변수에서 유전 알고리즘으로 수행되었습니다. 결합 포켓은 결정학적 리간드 좌표(CD44: 20×20×20 Å3; PI3K: 25×25×25 Å3). 결과 도킹 포즈는 결합 에너지(ΔG, kcal/mol)에 따라 순위를 매겼고, 재현성은 <2.0 Å의 RMSD(Root-Mean-Square-Deviation) 임계값을 사용하여 검증되었습니다.
OP+PD 쥐 모델에서 gycitein의 치료 평가
글리시테인(순도 ≥ 98%)은 생체 내 실험을 위해 분석 등급의 인증된 생화학 공급업체로부터 얻은 항염증 및 골 보호 특성이 보고된 안 젤리카 시넨시스에 존재하는 것으로 알려진 천연 이소플라본입니다26. 골다공증성 치주염은 11주 된 암컷 C57BL/6 마우스에서 양측 난소 절제술(OVX)과 결찰 유발 치주 염증을 통해 유도되었습니다. 마우스는 4개의 코호트로 무작위 배정되었습니다(그룹당 n = 6).
가짜: 가짜 수술 + 비히클(올리브 오일에 5% 디메틸 설폭사이드[DMSO], 매일 경구 위관 시행)
OP+PD: 질병 모델 + 비히클
OP+PD + 저용량 글리시테인(50mg/kg): 질병 모델 + 비히클의 글리시테인 현탁액
OP+PD + 고용량 글리시테인(100mg/kg): 질병 모델 + 비히클의 글리시테인 현탁액
통계 분석
추론 통계 테스트를 수행하고 그래프 생성 및 데이터 시각화를 위한 시각적 데이터 표현을 생성했습니다. 수치 데이터는 평균 ± SD로 표현되었습니다. 그룹 비교는 &l 0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 양측 짝이 없는 t-테스트를 통해 평가되었습니다. 이러한 방법은 데이터의 견고성을 보장하고 후속 분석 결과의 신뢰성을 향상시켰습니다.
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OP+PD 코호트의 단백질체학 프로파일링
OP+PD 환자(n=3) 및 건강한 대조군(n=6)의 혈청에 대한 정량적 단백질체학 분석은 질병 병인과 관련된 조절 장애 단백질을 확인했습니다. 비교 분석 결과 OP+PD 혈청 대 대조군에서 9개의 하향 조절된 단백질(APOL1, CST3, IGLV3-27, IGHV3-33, PF4, CLEC3B, SRGN, C6, SELL)과 6개의 상향 조절된 단백질(IGLV9-49, A2M, VWF, CETP, CD44, CDH13)이 나타났습니다(그림 2A,B). WGCNA(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis)는 표현형 관련 전사 모듈을 묘사했습니다. 모듈 고유유전자의 계층적 클러스터링은 청록색 모듈과 OP+PD 표현형 사이에 강한 상관관계(Pearson's r > 0.85)를 보여주었습니다(...
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본 연구는 골다공증과 치주염(OP+PD)의 동반이환의 근간이 되는 분자 메커니즘을 탐구하기 위해 단백질체 프로파일링, 유전자 발현 검증, 생체 내 동물 모델링 및 네트워크 약리학을 결합한 중개 연구 프레임워크를 제안합니다. 중심 가설은 CD44가 PI3K/Akt 신호 전달 축을 조절하여 OP+PD 조건에서 염증성 골 손실을 악화시키고 Angelica sinensis의 플라보노이드인 글리시테인이 CD44를 억제하여 이 과정을 약화시킬 수 있다는 것입니다. 이 통합 접근법은 분자 병인과 약초 약리학을 연결하고 전신 골격 염증 장애에서 치료 발견을 위한 플랫폼을 구축합니다 27,28,29,30.
대부분의 기존 연구는 OP 또는...
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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
이 연구는 중국 간쑤성 의료 산업을 위한 과학 기술 재단(보조금 번호. GSWSKY2020-77), 간쑤성 자연과학재단(보조금 번호 25JRRA314 및 21JR7RA620), 간쑤성 인재 프로그램 및 간쑤성 병원의 청소년 인큐베이션 연구 프로그램(보조금 번호 23GSSYF-35).
저자 기여:
Jing Qi는 대부분의 실험 작업과 데이터 분석을 수행했습니다. Yunqing Pang은 샘플 수집, 데이터 큐레이션 및 통계 분석에 기여했습니다. Yu Wang은 실험 설계를 지원하고 기술 지원을 제공했습니다. Dawei Hou와 Jing Wang은 공동으로 프로젝트를 감독하고 중요한 지적 내용을 위해 원고를 비판적으로 수정했으며 최종 버전을 승인했습니다. 모든 저자는 최종 원고를 읽고 승인했습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ELISA 키트 | 상하이 효소 링크 생명 공학 | 염증성 사이토카인(TNF-&알파;, IL-6, IL-1&베타;, IL-4, ALP, TRAP5b, TGF-β, VWF, CD44)의 정량화 | |
| RNA 추출 키트 | 상하이 Yesheng 생명 공학 | 혈청 RNA 추출 | |
| cDNA 합성 키트 | 상하이 Yesheng 생명 공학 | 고활성 역전사 | |
| qPCR 키트 | 상하이 Yesheng 생명 공학 | 정량적 PCR 증폭 | |
| 항체(1차/2차) | 세포 신호 기술 / Abcam / 항저우 Xianli 생명 공학 / 베이징 중산 Jinqiao 생명 공학 | 특정 1차 항체; &베타;-액틴 내부 제어; 염소 항토끼 IgG 2차 항체 | |
| 조직학 시약 | 비요타임 바이오테크놀로지 / 상하이 상샹 | 헤마트실린– 에오신 및 메틸렌 블루 염색 | |
| 화학발광 기질 | 야켄 바이오테크놀로지 | 웨스턴 블롯 검출 | |
| Micro-CT 시스템 | 스캔코 메디컬 AG(비바 CT40) | 고해상도 미세 구조 분석 | |
| LC-MS/MS 시스템 | Thermo Scientific Q Exactive HF-X | 고분해능 단백질체 분석 | |
| 소프트웨어: MaxQuant(v2.1.0), Andromeda | 브로드 인스티튜트 | 단백질체학 데이터 전처리 | |
| 소프트웨어: GSEA(v4.3.2) | 브로드 인스티튜트 | 경로 농축 분석 | |
| 소프트웨어: R(v4.0.3), WGCNA(v1.73), pheatmap(v1.0.12) | R 재단 | 통계 컴퓨팅, 네트워크 분석, 클러스터링, 히트맵 | |
| 소프트웨어: AutoDock 4.2, AutoDockTools 1.5.7 | 스크립스 연구소 | 분자 도킹 및 그리드 정의 | |
| 소프트웨어: Open Babel 3.1.1 | Babel 프로젝트 열기 | 리간드 구조 최적화 | |
| 소프트웨어: PyMOL 2.5.2 | 슈&옴; 딩거, LLC | 분자 도킹 시각화 |
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