이 연구는 Yangjing Zhongyu 달인이 난모세포와 배아의 질을 개선하여 난소 예비력이 감소한 여성의 보조 생식 결과를 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 조기 난소 부전의 쥐 모델에서 달인은 호르몬 균형을 회복하고 난포 발달을 촉진하며 자가포식 및 지질 대사를 조절했습니다.
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이 연구는 Yangjing Zhongyu 달인이 난모세포와 배아의 질을 개선하여 난소 예비력이 감소한 여성의 보조 생식 결과를 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 조기 난소 부전의 쥐 모델에서 달인은 호르몬 균형을 회복하고 난포 발달을 촉진하며 자가포식 및 지질 대사를 조절했습니다.
중국 전통 약초 제형인 YZD(Yangjing Zhongyu Decoction)는 난소 기능과 생식력 결과를 개선하는 것으로 제안되었지만 표준화된 임상 증거는 여전히 제한적입니다. 이 연구는 조기 난소 부전(POF)의 쥐 모델에서 기계론적 검증과 함께 IVF/ICSI-ET를 받는 난소 예비력 감소(DOR) 여성에서 YZD의 효과를 평가했습니다. 임상 시험에서 DOR 환자는 표준 GnRH 길항제 프로토콜을 단독으로 또는 YZD와 병용하여 받았습니다. 그룹 간의 기본 특성은 비슷했으며 YZD 그룹은 회수된 난모세포와 고품질 배아의 수가 더 많았을 뿐만 아니라 중국 전통 의학 증후군 점수가 개선되었습니다. 이와 동시에, 쥐에서 POF가 유도되었고, YZD로 치료받은 동물은 발정 주기성 개선, 혈청 에스트라디올 수치 회복, 난포 자극 호르몬 감소 및 더 건강한 난소 조직학을 나타냈습니다. 전자현미경 검사에서 YZD가 난소세포의 과도한 자가포식체 형성과 지질 축적을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 자가포식-지질 대사 축의 조절을 시사합니다. 종합하면, 이러한 발견은 YZD가 난소 예비력 기능을 강화하고 배아 발달을 개선하며 DOR이 있는 여성의 임신 가능성을 증가시킬 수 있음을 나타냅니다. 이 표준화된 프로토콜은 YZD를 보조 생식 기술 주기에 통합하기 위한 재현 가능한 프레임워크를 제공하여 임상 생식 의학에서의 번역 잠재력을 지원합니다.
난소 예비력 감소(DOR)는 여성의 생식 건강을 손상시키는 임상 상태이며 난포의 수 또는 질의 감소를 특징으로 합니다1. 임상적으로 이는 전정부 난포 수 감소, 항뮬러관 호르몬(AMH) 수치 감소 또는 난포 자극 호르몬(FSH) 농도 상승으로 반영됩니다2. DOR은 불임 사례의 약 10%를 차지하며 성공적인 임신에 대한 주요 장벽을 나타냅니다3. 보조 생식 기술(ART)의 맥락에서 DOR의 유병률은 미국에서 19%-26%로 추정되며4, 임신율 감소, 자간전증 발병률 증가 및 재발성 유산 위험 증가와 관련이 있습니다5. 다양한 치료 접근법의 가용성에도 불구하고 DOR 환자의 ART 결과를 개선하는 것은 여전히 상당한 과제로 남아 있으며 새롭고 효과적인 개입의 필요성을 강조합니다6.
고전적인 다중 허브 한약(TCM) 제제인 YZD(Yangjing Zhongyu Decoction)는 오랫동안 생식 관행에 적용되어 왔습니다7. 내분비 균형을 강화하고 난소 기능을 지원하여 체외 수정 및 세포질 내 정자 주입-배아 이식(IVF/ICSI-ET) 주기의 결과를 개선하는 것으로 알려져 있습니다8. 예비 임상 데이터는 YZD가 난소 반응을 개선할 수 있음을 시사하지만 엄격한 기계론적 및 중개 연구는 여전히 제한적입니다. YZD가 DOR 환자에서 작용하는 정확한 생물학적 경로는 불분명합니다 9,10. 현재 문헌에 따르면 한약 화합물은 AMH 발현 조절, PI3K/AKT/mTOR를 포함한 난포 폐쇄증 관련 신호 전달 경로 억제, 산화 스트레스 손상 감소 등 여러 메커니즘을 통해 난소 미세 환경에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 이러한 기계론적 가설은 대체로 간접적이며 실험적 검증이 부족합니다.
이 연구는 임상 평가와 실험적 검증을 통합하여 이러한 격차를 해소합니다. 구체적으로, 우리는 ART를 받는 DOR 여성에서 YZD의 효과를 조사하고 tripterygium 배당체 유도 DOR 쥐 모델을 사용하여 그 기계론적 토대를 조사했습니다. 동물 실험에서 우리는 난소 조직의 내분비 마커(에스트라디올 및 FSH), 전정부 난포 수, 자가포식체 형성 및 지질 축적을 모니터링했습니다. 임상 결과와 실험적 기계론적 데이터를 결합함으로써 이 연구는 YZD를 IVF/ICSI-ET 주기에 통합하기 위한 표준화된 프로토콜을 제공하고 DOR 환자의 난소 예비력 및 생식 결과를 개선하기 위한 보조 요법으로서의 잠재력을 뒷받침하는 새로운 증거를 제공합니다. 이 연구의 참신함은 표준화된 임상 적용과 기계론적 통찰력을 연결하는 이중 접근 방식에 있으며, 이는 생식 의학에서 YZD의 임상 번역과 이론적 이해를 모두 발전시킵니다.
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모든 임상 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 상하이 창하이 병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호. CHEC2022-156)에 대해 설명했습니다. 모든 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 동물 실험은 Changhai Medical College 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호. CHEC2022-156)를 준수하고 국가 실험 동물 관리 표준을 준수했습니다.
임상 특징
환자 모집 및 그룹화
2022년 8월부터 2023년 3월까지 해군의과대학 제1부속병원 생식의학센터와 상하이중의과대학 웨양병원 외래에서 신음결혈증10 증후군 진단을 받고 ART를 원하는 불임 환자 78명을 모집했다. 참가자는 SPSS 23.0 난수 생성을 사용하여 대조군 또는 치료군(각각 39건)에 무작위로 배정되었습니다.
진단 기준
서양 의학 진단은 난소 예비력 지표에 대한 미국 생식 의학회(ASRM) 2020 위원회 의견에 따랐습니다11. 기준에는 FSH ≥ 10 IU/L, 에스트라디올 ≥ 80 pg/mL, 전정부 난포 수(AFC) < 7 및 AMH < 0.5-1.1 ng/mL가 포함되었습니다. 신음결핍증후군은 한의학부인과12 및 한의학 증후군 진단효능기준13에 따라 진단되었다.
포함 및 제외 기준
포함 기준은 길항제 프로토콜을 사용하여 IVF/ICSI-ET를 계획했습니다. 불량한 난소 반응의 병력(< 5개의 회수된 난모세포); 20-40세; DOR 및 TCM 증후군 기준을 모두 충족합니다. 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다. 제외 기준에는 자궁내막 병리(폴립, 결핵, 이형성증, 암), 자궁 기형, 동반 질환(당뇨병, 루푸스), 최근 호르몬 요법(3개월 <), 골반 수술 병력, 염색체 이상 또는 약물 알레르기가 포함되었습니다. 등록 후 2주 이내에 프로토콜 편차, 부작용, 철회 또는 자연 임신에 대해 제거 기준을 적용했습니다.
투약 방법
두 그룹 모두 월경 2-3일에 경질 초음파 및 호르몬 검사를 통해 기준선 평가를 받았습니다. 대조군은 길항제 요법인 재조합 FSH 또는 인간 갱년기 성선 자극 호르몬, 초기 용량 225 IU/일을 5일 동안 근육 주사한 후 난포 성장에 따라 용량 조정을 받았습니다. 주요 난포 직경이 12mm를 초과하면 GnRH 길항제(0.125mg/일 피하)를 시작하여 트리거될 때까지 계속했습니다. ≥ 1개의 난포가 18mm에 도달하고, ≥ 2개가 17mm에 도달하거나, ≥ 3개가 16mm에 도달했을 때 250μg의 재조합 hCG로 배란을 촉발한 후 34-36시간 후에 난자 채취를 수행했습니다.
치료군은 월경 주기 2-3일부터 유발일까지 하루에 1회 1회 달인을 경구 투여하는 Yangjing Zhongyu 달인(YZD)을 추가하여 동일한 프로토콜을 따랐습니다. 임상 공식에는 지포 12g, 작약 12g, 산수유 10g, 안젤리카 12g이 포함되어 있습니다.
관찰 지표
임상 결과에는 연령, BMI(체중(kg)/신장²(m²)로 계산), 불임 기간, FSH, 성선 자극 호르몬 용량/기간, 신음 결핍 증후군 점수, 전정부 난포 수(경질 초음파로 평가, 직경 2-9mm), 회수된 난모세포, 중기 II(MII) 난모세포(난자 채취 시 확인), 수정 배아, 분열, 고품질 배아(표준 발생학 실험실 기준에 의해 정의됨), 임신 6-7주에 초음파에서 임신낭의 존재로 정의되는 임상 임신율.
실험 동물
여기서, 30마리의 SPF 등급 암컷 Sprague-Dawley 쥐(8주령, 160-200g)를 통제된 조건(23± 2°C, 40%-45% 습도, 12시간 빛/암 주기)에서 자유 로운 음식과 물로 순응시켰습니다.
약물 준비
YZD는 지황 30g, 안젤리카 15g, 작약 15g, 산수유 15g으로 제조하였다. 허브를 물에 달여 200메쉬 필터를 통해 여과한 후 70°C의 감압 하에서 농축했습니다. 저용량, 중용량 및 고용량에 대한 최종 용액은 0.34g/mL, 0.68g/mL 및 1.35g/mL였으며, 이는 YZD의 임상 용량의 0.5배, 1.0배 및 1.2배에 해당합니다. 달인은 4°C에서 보관했습니다.
모델링 및 그룹화
DOR 모델은 tripterygium 배당체(15일 동안 매일 40mg/kg)의 복강내 주사에 의해 유도되었습니다. 쥐는 블랭크(n = 6), 모델(n = 6) 및 YZD 치료군(저용량, 중용량 및 고용량, n = 6)에 무작위로 배정되었습니다. 위관 투여(10mL/kg 체중)는 트립테리지움 배당체 주사 첫날부터 시작하여 15일 동안 계속되었습니다.
질 세포학
발정 주기 단계는 질 박리 세포검사로 평가되었습니다. 질 도말 검사는 멸균 면봉으로 1일 1회(08:00-10:00)로 채취하여 식염수 30μL에 희석한 후 광학 현미경으로 100배 배율로 검사했습니다. 관찰 기간은 연속 15일 동안 지속되었습니다. 정상적인 발정 주기 지수는 이 기간 동안 규칙적인 4-5일의 발정 주기를 나타내는 쥐의 비율로 정의되었습니다.
호르몬 분석
15일간의 치료 기간 종료 시 마취 하에 심장 천자에 의한 전혈을 채취하고, 실온에서 30분 동안 응고시킨 후, 4°C에서 15분 동안 1000× g 으로 원심분리하여 혈청을 얻었다. E2 및 FSH 수준은 제조업체의 지침에 따라 ELISA로 측정되었습니다.
난소 조직학
안락사 직후 양쪽 난소를 외과적으로 제거하여 난소 조직을 채취하고, 차가운 식염수로 헹구어 혈액을 제거한 후 4°C에서 4% 파라포름알데히드에 24-48시간 동안 고정시켰다. 조직을 등급 에탄올에서 탈수하고, 자일렌에서 제거하고, 파라핀에 포매하고, 4-5μm에서 절편했습니다. 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고, 탈수하고, 제거하고, 마운트했습니다.
통계 분석
데이터는 SPSS 26.0을 사용하여 분석되었습니다. 정규 변수는 평균 ± SD로 표현되고 t-테스트로 비교되었습니다. 비정규 변수를 중앙값(IQR)으로 사용하고 Mann-Whitney U 테스트로 비교합니다. 범주형 변수는 %로 표현하고 카이제곱 검정으로 비교하였다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 일관성을 위해 그림 분석에 동일한 통계적 방법이 적용되었습니다(별도의 스튜던트 t-테스트 설명 없음).
안전 및 폐기물 처리
파라포름알데히드, 자일렌 및 트립테리지움 배당체는 장갑, 고글 및 실험실 가운이 있는 인증된 연기에서 취급되었습니다. 유출 및 오염된 일회용품은 라벨이 붙은 유해 폐기물 용기에 수거되어 기관 생물안전 SOP에 따라 폐기되었습니다. 파라포름알데히드, 자일렌 및 트립테리기움 배당체와 관련된 모든 절차는 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험실 가운, 고글)를 갖춘 흄 후드에서 수행되었습니다. 화학 폐기물과 동물 사체는 기관의 생물안전 지침에 따라 처리되었습니다.
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임상 특징
연구 기간 동안 대조군 환자 3명은 코로나19 감염으로 인해 탈퇴했고, 1명은 간 기능 이상으로 인해 제외되어 35명의 환자가 남았다. 치료군에서는 4명이 코로나19로 인해 기권했고, 35명의 환자가 연구를 완료했다. 따라서 총 70명의 피험자가 최종 분석에 포함되었습니다. 연령, 체질량 지수(BMI), 불임 기간, 기초 FSH 수치, AFC 또는 성선 자극 호르몬(Gn) 사용 시간 및 용량(p > 0.05)에서 그룹 간에 유의미한 차이가 없었으며, 두 그룹이 기준선에서 비슷함을 확인했습니다(표 1).
TCM 증...
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이 연구에서 우리는 보조 생식 기술(ART)에서 난소 예비력 감소(DOR)에 대한 보조 요법으로서 Yangjing Zhongyu 달인(YZD)의 잠재적 역할을 조사했습니다. 임상 결과에 따르면 표준 길항제 프로토콜과 함께 YZD를 투여받은 환자는 회수된 난모세포와 고품질 배아의 수가 훨씬 더 많았습니다. 임신율은 그룹 간에 큰 차이가 없었지만 유리한 추세가 관찰되었습니다. 이러한 결과는 YZD가 난포의 질을 향상시켜 ART 결과를 개선할 수 있음을 시사합니다. 난소 예비력은 여성의 가임 잠재력과 ART 성공의 핵심 결정 요인입니다. 성장 호르몬(GH), 디하이드로에피안드로스테론(DHEA) 및 코엔자임 Q10과 같은 여러 약리학적 전략이 DOR 환자의 난모세포 능력을 향상시키기 위해 적용되었습니다. 그러나 이러한 제제는 종종 적당한 효능과 대사 장애 또는 피부과 반응을 포함한 잠재적인 부작용으로 인해 제한됩니다14,15...
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저자는 경쟁하는 이해관계가 존재하지 않는다고 선언했습니다.
이 작업에 대한 지원은 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(보조금 번호: 2018YFC1004900): 쥐의 난소 기능 개선을 위해 난포액 내 미생물 대사산물 에루카마이드 조절에 대한 Yangjing Zhongyu 달인의 효과 및 메커니즘에 관한 연구(보조금 번호: 2024QN027)
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 원심 분리기 | 세럼 분리 (1000 x g, 15분, 4 & deg; C) | 에펜도르프 5810R | 5811 000.012 |
| 면봉(멸균) | 질 세포학 샘플 수집 | 장쑤 강젠 의료 용품 | KJ-MW-01 |
| E2용 ELISA 키트 | 혈청 에스트라디올 정량 검사(쥐) | 엘라브사이언스 바이오테크놀로지 주식회사 | E-EL-0152 |
| FSH용 ELISA 키트 | 혈청 FSH 정량화 (쥐) | 엘라브사이언스 바이오테크놀로지 주식회사 | E-EL-R0391 |
| 에탄올(70– 100%) | 조직학을 위한 점진적 탈수 | 시노팜 화학 시약 회사, 중국 | 100092683 |
| 유리 슬라이드 & 커버슬립 | 샘플 마운팅 | 시토테스트 사이언티픽, 중국 | 7101/1812 |
| 헤마톡실린 & 이오신 | 조직학용 염색 용액 | 비오타임 바이오테크놀로지, 중국 | C0105S |
| 광학 현미경 | 조직학 및 세포학 관찰 | 올림푸스 (일반, 상표 없음) | CX23 |
| 파라핀 | 임베딩 매체 | 라이카 바이오시스템 | 39601095 |
| 파라포름알데히드 (4%) | 조직 준비를 위한 고정액 | 시그마-올드리치 | P6148 |
| 식염수 용액 (0.9%) | 질 도말 수술 준비 | 시노팜 화학 시약 회사, 중국 | 10019318 |
| 스프래그와 대시; 도울리 쥐 | 실험 동물(암컷, 8주, 160세 이상; 200g) | 베이징 웨이통 리화 실험동물기술유한회사. | SCXK(베이징) 2024-0011 |
| SPSS 소프트웨어 | 통계 분석 (버전 26.0) | IBM 주식회사 | RRID:SCR_002865 |
| 투과 전자현미경 | 초구조 관측 | JEOL 주식회사 | JEM-1400Plus |
| 트리프테리기움 글리코사이드 | DOR 쥐 모델 유도 | 제네릭 공급업체 (상표 없음) | TG-001 |
| 자일렌 | 조직학을 위한 클리어링 시약 | 시노팜 화학 시약 회사, 중국 | 10023418 |
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