방법 논문

근위 관 상피 세포에서 저산소증/재산소화 손상 모델링

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DOI:

10.3791/69077

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2025년 11월 21일

 ,  ,  , 
1Group of Metabolism and Gene Regulation, UCAM HiTech Sport & Health Innovation Hub, Universidad Católica de Murcia, 2Department of Internal Medicine (Nephrology) and Pathology, Leiden University Medical Center

이 논문에서

요약

여기서는 고대사성 근위 소관 상피 세포에서 저산소증/산소 재산화 손상을 모델링하는 시험관 내 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 대사 스트레스 유발 손상을 유도하도록 설계되었으며, 근위 세뇨관 손상 지표의 발현과 미토콘드리아 호흡 기능 평가를 통해 측정할 수 있습니다.

초록

신장 이식은 전체 이식된 고형 장기의 약 60%-65%를 차지합니다. 대부분의 기증 신장은 사망한 사람으로부터 얻어져 장기간 냉 보존이 필요하며, 이는 이식 결과가 좋지 않은 원인으로 알려져 있습니다. 현재의 보존 전략에도 불구하고, 허혈-재관류 손상(IRI)은 일시적인 혈류 중단으로 인한 불가피한 결과로 남아 있으며, 이는 산소와 영양 결핍을 초래합니다. 신연 내에서 S3 분절의 근위 관 상피세포(PTEC)는 높은 대사 요구와 미토콘드리아 산화성 인산화에 의존하기 때문에 IRI에 특히 취약합니다. 분자 수준에서 IRI는 미토콘드리아 대사를 방해하고 ATP 생성을 감소시켜 근위 관 상피세포(PTEC)의 에너지 요구량을 저하시키고 세포자멸사와 괴사를 촉진합니다. 이러한 기전을 조사하고 잠재적 치료 전략을 평가하기 위해, PTECs의 대사 취약성을 정확히 재현하는 신장 IRI의 견고하고 재현 가능한 시험 관 내 모델이 필수적입니다. 여기서는 마우스 불멸화 PTEC(IM-PTEC)에서 저산소증/재산소화(H/R) 손상의 유도 및 평가 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜에는 이러한 세포를 유지하는 데 필요한 배지 조성과 배양 조건에 대한 상세한 정보가 포함되어 있으며, 이어서 이식된 신장의 허혈과 재관류 사건을 매우 유사하게 모방하는 통제된 저산소 및 재산소화 단계를 통해 H/R 손상을 유도합니다. 이 모델은 H/R 손상에 노출된 신장 상피 세포에 대한 다양한 개입의 효과를 평가하는 데 귀중한 플랫폼을 제공합니다. 이러한 치료의 효과는 PT 손상과 관련된 표지자의 발현 분석과 미토콘드리아 호흡 기능 평가를 통해 평가할 수 있습니다. 이 결과들은 합성 효능과 세포 회복 과정에 대한 기전적 통찰을 제공하여 신장 IRI에 대한 표적 치료제 개발을 지원합니다.

서론

기증 및 이식 글로벌 관측소에 따르면, 신장 이식은 전 세계 모든 고형 장기 이식의 약 60%-65%를 차지하며, 2023년에 시행된 수술 건수는 간 이식의 거의 세 배에 달하며, 간이식이 두 번째로 흔한 유형입니다. 그 해 시행된 신장 이식의 61%에서 장기는 사망한 기증자로부터 유래했으며,이는 생존 기증자 이식에 비해 보존 기간이 더 길어집니다. 생존자 이식은 대기 시간이 현저히 짧습니다. 이 보존 기간 동안 신장은 보통 세포 대사를 늦추기 위해 정적 냉장 저장을 사용하여 보존되는데, 이는 산소와 에너지 요구량을 줄여 허혈성 손상을 제한합니다. 그러나 정적 냉장 저장은 세포 대사나 산소 공급을 완전히 유지하지 못해 보존 과정에서 점진적인 대사 기능 장애를 초래하므로 부분적인 보호만 제공합니다 4,5. 또는 체외 정상모혈 보존(ex vivo normalmothermic preservation)이 장기를 생리적 온도에 가까운 상태로 유지하여 세포 대사와 산소 공급을 지원하고, 결과적으로 허혈-재관류 손상(IRI)을 줄이는 효과적인 전략으로 등장했습니다6.

그러나 신장 이식 과정에서 IRI로 인한 급성 신장 손상(AKI)은 피할 수 없는 결과입니다. IRI는 장기를 통한 혈류가 중단되어 산소와 영양소의 공급과 수요 불균형을 초래하면서발생합니다. 이 과정은 이식된 신장의 기능에 직접적인 영향을 미치며, 급성 거부 반응 위험과 장기 이식편 기능 저하를 증가시킵니다 8,9.

특히 신장 피질에 풍부하게 존재하는 PTECS는 IRI에 특히 취약합니다. 이 세포들은 약 60%-70%의 소관 상피를 차지하며, 물, 이온, 포도당, 아미노산 등 대부분의 사구체 여과액의 재흡수를 담당합니다10. 이들의 높은 대사 활동은 ATP 의존적 운송 요구를 충족하기 위한 광범위한 미토콘드리아 네트워크에 의해 뒷받침됩니다11. 따라서 산소 부족과 미토콘드리아 기능 장애와 같은 대사 장애에 매우 민감하며, 이는 IRI12의 핵심 특징입니다.

IRI 과정에서 산소 결핍이 미토콘드리아의 산화적 인산화를 방해하여 ATP 고갈과 재흡수 기능 저하를 초래합니다13,14. 이로 인해 지방산 산화(FAO)에서 혐기성 당화와 펜토스 인산 경로의 활성화가 일시적으로 보호되긴 하지만, 이 세포들의 에너지 및 산화환원 요구를 완전히 충족시키기에는 부족하다15. 수리 단계에서 FAO 억제가 지속되면 지질 축적과 지방독성이발생하여 세포를 추가로 손상시키고 재생 능력을 저하시킵니다18. 이러한 부적응적 대사 상태는 궁극적으로 세뇨관 위축, 간질성 섬유증, 만성 신장 질환으로의 진행을 유발할 수 있습니다.

결함 있는 FAO에 의해 유발된 이 대사 장애는 신세뇨관의 높은 에너지 요구를 충족하는 능력을 저해합니다17,19. 이로 인해 ATP 소모와 지질 축적이 촉진되어 미토콘드리아 기능 장애와 활성 산소 종의 생성이 촉진되며, 이는 염증 유발 신호 전달과 백혈구 침윤을 활성화합니다20,21,22. 지속적인 염증과 산화 손상은 미토콘드리아의 완전성을 불안정하게 하여 에너지 손실을 증폭시키고 결국 세포자멸 및 괴사성 세포 사멸을 유발합니다23,24. 이 급성 손상 단계 동안, 신장 손상 분자 1(KIM-1)과 호중구 젤라티나제 관련 리포칼린(NGAL)과 같은 특정 바이오마커가 상향 조절되어, 근위 관 손상과 초기 AKI25의 민감한 지표 역할을 합니다.

급성 손상 후에는 부적응적 수리 기전이 과도한 세포외 기질 침착을 촉진하는데, 이는 신섬유증의 특징입니다26. 세포외 기질 구성 요소 중에서, 특히 Col1a1 유전자에 의해 암호화된 I형 콜라겐이 간질에 축적되어 관 위축과 기능성 실질의 손실에 기여합니다. 이 섬유화된 재형성은 주로 관 상피 세포 내 상피 노화와 부분 상피에서 중간엽 전환(pEMT)에 의해 촉진되며, 궁극적으로 신장 기능 저하로 이어집니다 28,29,30. 신장 pEMT와 섬유증의 발병은 AKI에서 만성 신장 질환(CKD)으로의 진행을 돕으며, 결국 신장 기능의 돌이킬 수 없는 상실과 이식편 생존율 저하로 이어집니다31,32.

이 프로토콜에서는 쥐 SV40 불멸화 근위 관 상피세포(IM-PTEC)를 이용한 시험관 내 H/R 손상 모델을 기술하며, 이를 조절된 H/R 조건에 노출시킵니다. 신장 IRI의 대부분 전임상 연구는 전통적으로 신장의 복잡한 혈관 및 면역 반응을 재현하는 동물 모델에 의존해 왔으나, 더 높은 비용, 윤리적 문제, 그리고 상당히 높은 생물학적 변이성을 수반합니다33,34. 이러한 한계는 상세한 기전적 및 고처리량 연구에 유효한 상보적 세포 기반 시스템 개발을 지연시켰습니다. 이 실험 장치는 이식된 신장에서 관찰되는 IRI의 주요 특징을 모방하여 산소 결핍 및 복원의 재현 가능한 시뮬레이션을 가능하게 합니다. 이 모델은 통제된 환경에서 관 손상, 바이오마커 발현, 섬유화 반응의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 더 나아가, 허혈성 손상 예방 또는 완화 및 이식 후 결과 개선을 위한 잠재적 치료 전략의 선별 및 평가에 적합한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 세포들은 본 연구 맥락에서 분리되지 않았습니다. 이들은 이전에 분리되어다른 연구자들에 의해 제공된 바 있습니다. 따라서 새로운 동물 실험은 수행되지 않았으며, 현재 연구에는 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다.

1. IM-PTEC 문화

  1. 표 1에 설명된 대로 L3 배지를 준비합니다.
  2. IM-PTEC 한 병을 해동하세요. 약 1 x 106 세포를 33 °C의 가습 인큐베이터에서 표준 조건(5%CO2, 대기 중 산소2)에서 80% 합류(보통 3일 후 도달)까지 배양합니다.
    참고: IM-PTEC는 Immorto 마우스에서 분리됩니다. IM-PTEC의 격리에 관한 자세한 프로토콜은35를 참조하시기 바랍니다.
  3. 아배양 세포는 주 2회 대략 1:10 분할 비율로 투여합니다. 통과 시에는 33°C에서 0.05% 트립신-EDTA를 사용해 2-3분간 부착 단일층을 제거하고, 완전한 배양 배지로 중화한 후 신선한 배양 플라스크에 다시 씨앗을 넣습니다.
구성 요소양/최종 매체 농도
DMEM/F12500 mL
태아 송아지 혈청(FCS)10%
페니실린10,000 U/mL
스트렙토마이신10,000 μg/mL
L-글루타민0.02 μM
인슐린5 μg/mL
트랜스페린5 μg/mL
셀레나이트 나트륨5 μg/mL
트리이오도티로닌40 pg/mL
하이드로코르티손36 ng/mL
표피 성장 인자20 ng/mL
인터페론 γ (IFN-γ)10 ng/mL

표 1: L3 중간 조성.

2. IM-PTEC의 제한적 문화

  1. 1.3단계에서 설명한 부분 배양을 사용하여 IM-PTEC가 담긴 T-25 플라스크 한 개에서 인터페론-γ 없는 약 10mL L3 배지(IFN-γ)가 포함된 T-75 플라스크로 전체 세포 현탁액을 옮깁니다. 표준 조건에서 37°C에서 80% 합류점(보통 3일 후 도달)까지 배양합니다.
  2. 1.3단계에서 설명한 대로 아브컬처를 진행하여 한 개의 T-75 플라스크에서 IFN-γ 없는 약 20mL의 L3 배지를 포함한 두 개의 T-175 플라스크로 전이합니다. 표준 조건에서 37°C에서 80% 합류점(보통 3일 후 도달)까지 배양합니다.
  3. 실험용 IM-PTEC는 0.05% 트립신-EDTA를 사용해 융합 배양에서 세포를 분리하고, 완전한 배지에 재현탁한 후 원하는 밀도(약 1 x 105)로 씨앗을 심습니다. 분자 표지 발현 분석에는 6웰 플레이트를, 미토콘드리아 호흡 연구에 적합한 96웰 세포 배양 마이크로플레이트를 사용하세요.
    참고: 다른 실험에서는 적절한 배양 형식을 사용하세요.
    1. 미토콘드리아 호흡 연구를 위해 96웰 세포 배양 마이크로플레이트에 세포를 도금할 때는 네 모서리의 웰을 비워 배경 보정용으로 사용하세요. 마이크로플레이트는 실온에서 1시간 동안 두었다가 인큐베이터에 넣어 세포가 가라앉도록 하세요.

3. 저산소증/산소 재산소화 절차 (그림 1)

  1. IM-PTEC를 새로 고치려면 배양지를 제거하고 IFN-γ가 없는 신선한 L3 배지를 추가합니다(96웰 플레이트는 0.1mL/웰, 6웰 플레이트는 2mL/웰). 세포를 1% 산소2, 5%CO2, 37 °C에서 저산소 인큐베이터에 48시간 동안 넣습니다.
  2. 저산소 인큐베이터에서 세포를 꺼내 IFN-γ 없는 L3 배지로 새롭게 재현하세요. 세포를 표준 산소2 조건과 5%CO2 , 37 °C에서 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.
    참고: 저산소 상태는 저산소 인큐베이터 또는 제어된 가스 공급에 연결된 모듈식 저산소 챔버를 사용하여 달성할 수 있습니다.

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그림 1: 인생화된 근위 관 상피세포(IM-PTEC)에서의 시험관 내 H/R 모델의 도식적 표현. H-2Kb-tsA58 형질전환(Immorto) 마우스에서 유래한 IM-PTEC는 정상 산소 상태에서 배양하고, 저산소증(1% 산소2, 48시간)에 노출된 후 재산소화(표준 산소2 조건, 24시간)하여 읽기 분석을 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 분자 표지자의 발현 분석

  1. RNA 분리
    1. 6웰 플레이트의 각 웰에 800 μL의 RNA 분리 시약을 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 샘플을 RNAse 프리 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
    2. 클로로포름 200 μL를 추가하고 피펫으로 15초간 잘 섞습니다. 실온에서 2-3분간 배양하세요.
    3. 원심분리기는 12,000 x g 압력, 4 °C에서 12분간 가동합니다. 수성 상상을 RNAse 무첨가 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
    4. 이소프로판올 500 μL을 추가하세요. 실온에서 10분간 배양하세요. 원심분리기는 12,000 x g 온도에서 4 °C에서 10분간 가열합니다.
    5. 상정액을 버리고 70% 에탄올 1mL로 펠릿을 세척합니다. 5,000 x g , 4 °C에서 5분간 원심분리기를 사용하세요. 상원액은 버리세요.
    6. 펠릿을 자연 건조시키세요. 이 펠릿을 RNAse 프리 물 12 μL에 녹입니다.
    7. 샘플을 56 °C에서 15분간 가열하세요. 마이크로볼륨 UV-VIS 분광광도계에서 RNA 농도를 측정합니다.
      참고: RNA 분해를 방지하기 위해 샘플을 배양 단계 사이에 항상 얼음 위에 보관하세요.
  2. 역전사
    1. 얼음 위에 다음 반응 성분을 RNAse 무첨가 0.2 mL 마이크로 원심분리관에 첨가합니다: 마스터 믹스 10 μL (2x), 효소 혼합물 2 μL , RNA 1-5 μg RNA, 그리고 최대 20 μL 무핵효소 H2O
    2. 부드럽게 섞어 25°C에서 10분간 배양한 후 50-55°C에서 10분간 배양하세요.
    3. 반응을 비활성화하여 85°C에서 5분간 가열한 후 얼음 위에 식힙니다. cDNA를 1:5 또는 1:10으로 희석하세요.
  3. 실시간 정량 PCR(RT-qPCR)
    1. 프라이머 세트는 최종 농도인 10 μM으로 혼합하여 준비합니다(표 2).
    2. 각 유전자를 측정할 때, 웰당 다음 시약을 포함하는 실시간 qPCR 혼합물을 준비합니다: 5 μL RT-qPCR 마스터 믹스; 10 μM 순방향 프라이머 0.4 μL, 10 μM 역방향 프라이머 0.4 μL, 뉴클레아제 프리 H2O 2.2 μL
    3. 384웰 PCR 플레이트의 각 웰에 8 μL RT-qPCR 혼합물을 추가합니다. 각 웰에 2 μL cDNA 샘플을 추가하여 웰 가장자리에 한 방울을 남깁니다.
    4. 모든 샘플을 넣은 후에는 플레이트를 부드럽게 두드려 모든 방울이 웰에 떨어질 때까지 두드리세요. 플레이트를 막으로 단단히 밀봉하세요. 384웰 PCR 플레이트를 회전시킵니다.
    5. RT qPCR 시스템에서 다음 프로그램으로 측정합니다: 98 °C에서 30초, 98 °C 40 사이클 동안 10초, 60 °C 30초, 그리고 녹는 곡선 95 °C.
유전자프라이머 서열
김-1F: 5' - TGGTTGCCTTCCGTGTCTCT
골: 5' - TCAGCTCGGGAATGCACAA
응갈F: 5' - ATGTCACCACCCATCCCTTGGTCAG
R: 5' - GCCACTTGCATTGTAGCTCTG
Acta2여자: 5' - GCCATCTTTCATTGGGATGGA
오른쪽: 5' - CCCCTGACAGGACGTTGTTA
Col1a1F: 5' - CCTCAGGGTATTGCTGGACAAC
R: 5' - 카가아아카트트카그카그

표 2: RT-qPCR에 사용되는 프라이머 서열.

5. 미토콘드리아 호흡 기능 평가

  1. 분석 전날
    1. 산소 소비율(OCR)/세포외산성화율(ECAR) 분석기를 켜고 실험 최소 5시간 전부터 가열하세요.
    2. 센서 카트리지를 37°C에서 비일산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 수분 공급하세요.
  2. 분석일
    1. 96웰 세포 배양 마이크로플레이트 1장에 대해 분석액을 준비하며, 여기에는 33.4mL의 DMEM 배양지(pH 7.4)가 포함되어 있습니다; 포도당 0.875 mL 1 M (최종 농도 25 mM); 피루브산 0.35 mL 100 mM (최종 농도 1 mM); 그리고 글루타민 0.35 mL 200 mM(최종 농도 2 mM)을 투여했습니다.
    2. 표 3에 따라 억제제 용액을 준비하세요.
    3. 조립된 센서 카트리지를 인큐베이터에서 꺼내세요. 멀티채널 피펫과 로딩 가이드를 사용해 각 억제제를 해당 포트에 25 μL씩 적재합니다.
    4. 세포 배양 마이크로플레이트에서 세포 배양 배지를 제거하세요. 각 웰에 다채널 피펫을 사용해 미리 가열된 37 °C 분석액 175 μL을 첨가합니다.
    5. 세포 배양 마이크로플레이트를 37°C 비CO2 인큐베이터에 45-60분 동안 넣어 분석합니다.
    6. 장착된 센서 카트리지가 장착된 보정판을 OCR/ECAR 분석기에 넣어 보정하세요.
    7. 세포 배양 마이크로플레이트를 측정을 위해 기기에 넣으세요.
    8. 실행 후에는 전체 단백질 정량화를 위해 세포 배양 마이크로플레이트를 보관하여 데이터 정규화를 진행하세요.
[탄환] (μM)[중판 분석] (μM)포트 A포트 B포트 C
올리고마이신121.58.4 μL
FCCP916.3 μL
안티마이신 A252.517.5 μL
로테논12.51.258.75 μL
분석용 매체3.5 mL3.5 mL

표 3: 미토콘드리아 호흡 평가를 위한 억제제 솔루션.

결과

IM-PTEC에서 허혈성 손상을 재현하기 위한 최적의 저산소/산소 재산소(H/R) 조건을 결정하기 위해 먼저 시간 경과 검증이 수행되었습니다. 신장 허혈-재관류 손상의 특징인 카스파제-3 활성화는 생체 내외 및 시험관 모두에서 모델 충실도의 지표로 사용되었습니다36,37. 우리는 48시간 저산소증 후 24시간 재산소 공급이 카스파제-3 활성의 가장 큰 증가를 보였다. MTT 분석법으로 평가된 세포 생존력은 이러한 조건에서 정상 산소 대조군과 유사하게 유지되어, 세포 세포 세포가 세포멸사 신호가 시작되었음에도 이후 약리학적 검사를 위해 생존 가능함을 나타냅니다(보충 그림 1). 이 검증된 프로토콜은 IM-PTECs의 통제된 저산소/재산소화를 통해 H/R 손상을 유도하는 데 사용되었습니다.

허혈성 손상 이후에는 RT-qPCR 검사를 통해 신장 손상의 여러 표지자의 발현을 확인하였습니다(그림 2). RT-qPCR 검사 결과, IRI 맥락에서 급성 신장 손상의 알려진 표지자인 Kim-138,39와 Ngal40,41의 발현이 유의하게 증가함을 보여주었습니다. 더불어, 신장 pEMT/섬유증 표지인 Acta242,43과 Col1a1 44,45,46의 발현도 증가하였습니다. 신장 pEMT/섬유증 지표일 뿐만 아니라, Col1a1 발현은 CKD 중증도와 상관관계가 있습니다47. /p>

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그림 2: 정상산소증 또는 저산소/재산소화(H/R) 하에서 신장 손상 표지자의 분자 발현. H/R 이후에는 IM-PTECs에서 신장 손상 분자 표지자 Kim-1, Ngal, Acta2, Col1a1 의 발현이 유의하게 증가합니다. 데이터는 조건당 4번의 생물학적 복제에서 평균 ± 표준오차(SEM)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 쌍이 없는 양측 학생 t-검정을 사용하여 평가하였다. 유의수준은 다음과 같이 표시되어 있습니다: p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.001 (***), p < 0.0001 (****). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

또한 H/R 후 미토콘드리아 호흡 능력을 확인하기 위해 미토콘드리아 호흡 연구도 수행되었습니다(그림 3). 산소 소비율(OCR) 측정을 통해 허혈성 도전 후 모든 미토콘드리아 호흡 지표(기저 호흡, ATP 생성, 양성자 누출, 최대 호흡, 여분 용량)가 감소하여 미토콘드리아 대사 저하를 시사하는 것을 확인했습니다.

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그림 3: 정상산소 또는 저산소 상태에서 IM-PTEC의 OCR(산소 소비율). 저산소증/재산소화(H/R) 후 IM-PTECs는 미토콘드리아 호흡 기능이 감소하는 것을 보입니다. 미토콘드리아 호흡은 올리고마이신, FCCP(카보닐 시안화물-p-플루오로메토시피닐하이드라존), 항마이신 A, 로테논 등 전자전달 사슬 억제제를 순차적으로 첨가하여 평가하였다. 데이터는 조건당 4번의 생물학적 복제에서 평균 ± 표준오차(SEM)로 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

이 결과는 H/R 프로토콜이 IM-PTECs에서 허혈성 신손상과 일치하는 분자 및 대사 변화를 효과적으로 유도한다는 것을 확인시켜 줍니다48,49. 따라서 이 프로토콜은 신장 허혈과 유사한 상태를 시험관 내에서 재재현하는 유용한 틀을 제공합니다.

보조 그림 1. 정상산소 및 저산소/재산소(H/R) 조건에서의 세포 생존 및 카스파제-3 활성. (A) 세포 생존 가능성. 정상산소증 또는 저산소/재산소화(H/R) 노출 후 MTT 분석으로 세포 생존 가능성을 평가하였다. 결과는 상대적 생존력(%)을 정상 목성 대조군에 정규화한 값으로 표현됩니다. (B) 절단된 카스파제-3. 절단된 카스파제-3 활성(nmol/min/mg 단백질)은 정상적인 산소증(N), 저산소증(H), 재관류(R)의 서로 다른 지속 기간을 받은 세포에서 정량화되었습니다. 데이터는 SEM 평균± 제시되며, 각 점은 개별 생물학적 복제체를 나타냅니다. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

신장 IRI 유발 AKI에 관한 대부분의 전임상 데이터는 in vitro 모델이 부족하여 in vivo 모델50, 51, 52, 53을 통해 생성됩니다. 여기에 잘 특성화된 쥐 불사성 근위 관 상피 세포주가 제한적으로 존재하는 점이 더해져 시험관 내 연구가 제한되어 이 프로토콜 개발이 매우 귀중한 자산이 되었습니다. 이 방법은 통제된 조건 하에서 신장 H/R 손상 기전을 연구할 수 있는 보다 접근하기 쉽고 재현 가능한 플랫폼을 제공하며, 동물 사용 필요성도 줄여줍니다.

더불어, 이 프로토콜은 주로 표준 실험실 장비를 사용하여 특수하고 고가의 기기 없이도 구현을 용이하게 합니다. 유일한 예외는 저산소 종양 미세환경을 재현하기 위해 암 연구실에서 일반적으로 제공되는 저산소증 인큐베이터(저산소 인큐베이터)입니다. 이러한 접근성은 더 넓은 채택을 지원하고 서로 다른 실험실 간 재현성을 촉진합니다.

이 프로토콜에서 중요한 고려사항은 IM-PTEC의 올바른 문화입니다. 세포는 33 °C에서 배양하고 IFN-γ로 보충하여 SV40 활성의 하향 조절을 방지해야 합니다. 실험 절차 전에 IM-PTEC는 실험 시작 7일 전부터 제한 조건으로 전환됩니다. 제한 배양은 온도를 37°C로 올리고 배지에서 인터페론-감마(IFN-γ)를 1주일간 제거함으로써 달성되며, 이는 세포를 불멸화하는 데 사용되는 바이러스 단백질인 SV40 큰 T 항원 발현을 감소시킵니다. 이 단백질은 세포를 불멸화하는 데 사용됩니다35,57 세포의 불멸화 상태를 잃고 더 분화되고 생리학적으로 중요한 표현형을 촉진합니다58. 특히 IM-PTEC는 배양 후 며칠간 세포질 공포가 형성될 수 있습니다; 진공 현상이 발생하면 이 변화를 예방하거나 되돌리기 위해 배양액에서 하이드록시코르티손을 빼야 합니다.

불멸화된 PTEC의 사용은 안정성과 유지 관리의 용이성을 제공하지만, 연구자들은 생리적 관련성을 높이기 위해 1차 근위 관 상피세포를 사용하는 것도 고려할 수 있습니다. 그러나 마우스 1차 PTEC는 기증자 간변이가 더 크고 증식 능력이제한되어 있어 고처리량이나 장기 실험에 덜 적합하다. 이 지침들은 검증 연구나 특정 환자 유래 반응을 연구할 때 더 적합할 수 있습니다

이 프로토콜은 H/R 손상의 분자 기전을 조사하고, 잠재적 치료법을 식별 및 평가하며, 통제된 환경에서 염증, 산화 스트레스, 세포 사사 경로와 같은 세포 반응을 탐구할 수 있는 귀중한 플랫폼을 제공합니다63,64.

그럼에도 불구하고 이 모델의 중요한 한계는 신장 이식에서 관찰되는 저체온증 및냉장 보관 중 영양 결핍과 같은 허혈의 특정 특징을 재현하지 못한다는 점입니다. 이러한 질환들은 세포 대사와 손상 패턴에 현저한 영향을 미치며, 이들이 없으면 임상 환경으로의 연구 결과를 제한할 수 있습니다65,66.

결론적으로, IM-PTECs에서의 이 시험관 내 H/R 모델은 통제된 조건 하에서 신장 허혈-재관류 손상을 연구할 수 있어 재현 가능하고 접근성 있으며 윤리적으로 유리한 접근법을 제공합니다. 생 체 내 허혈의 복잡성을 완전히 요약하지는 못하지만, 세포 메커니즘을 밝히고 치료 후보를 선별하며 신장 연구에서 동물 실험에 대한 의존도를 줄이는 데 유용한 보조 도구입니다.

공개 사항

저자들은 이 작업과 이해 상충이 없음을 선언하여 공개하지 않는다고 밝혔습니다

감사의 글

마리아노 마린-블라스케스는 무르시아 가톨릭 대학교(UCAM)의 "Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud" 프로그램에 속해 있습니다. 루벤 라바단-로스와 루벤 사파타-페레즈 그룹의 연구는 과학부, 혁신대학 - 2023년 코노시미엔토 발전 프로젝트(PID2023-147560OA-I00)의 지원금으로 지원받고 있습니다. 루벤 라바단-로스는 Fundación Séneca - Agencia de Ciencia y Tecnología de la Región de Murcia(22524/JLI/24, Ayudas a Proyectos para la Generación de Nuevo Liderazgo Científico Jóvenes Líderes en Investigación 2024)의 지원금으로 지원받고 있습니다. AT는 Zonmw(457002002호)가 주관한 NWO-FAPESP 건강 노화 공동 보조금과 Nierstichting의 주니어 인재 보조금으로 재정적으로 지원받고 있습니다.

저자들은 영상 촬영이 이루어진 시설에 접근할 수 있도록 제공해 준 무르시아 대학교(UM)와 무르시아 가톨릭 대학교(UCAM)에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
384웰 qPCR 플레이트응용 생명 시스템4309849
원심분리기오르토알레사바이오센22R
클로로포름VWR0757-500ML
DMEM/F12깁코21331020
표피 성장 인자시그마-올드리치E9644
에탄올PanReac 응용화학141086.1214
FCS바이오웨스트S181B-500
가열 블록에펜도르프서모믹서 C
하이드로코르티손시그마-올드리치H0135
저산소 인큐베이터멤머트ICO 50med
IFN-및 감마;ProspecBIoCYT-358
인큐베이터멤머트ICO 105
이소프로파놀VWR0918-1L
ITSe깁코41400045
L-글루타민깁코25030081
멀티채널 피펫에펜도르프3125000052
비CO2 인큐베이터
PCR 프라이머유로핀스 지노믹스
페니실린 - 스트렙토마이신깁코15140-122
qPCR 마스터 믹스NZYTechMB22303
실시간 qPCR 시스템응용 생명 시스템QuantStudio 5
역전사 마스터 믹스NZYTechMB12502효소 혼합물 함유
RNAse 없는 물하이클론SH3053802
Seahorse XF 세포 미토 스트레스 테스트 키트애질런트103015-100올리고마이신, FCCP, 안티마이신 A, 로테논 포함
Seahorse XF DMEM 미디엄애질런트103575-100
해마 XF 포도당애질런트03577-100
해마 XF 글루타민애질런트103579-100
시호스 XF 피루베이트애질런트103578-100
Seahorse XFe96 분석기애질런트S7800BR
시호스 XFe96 플럭스팩애질런트103792-100XFe96 세포 배양 마이크로플레이트와 XFe96 센서 카트리지 포함
열 사이클러바이오-래드T100 열 사이클러
트리이오도티로닌시그마-올드리치T5516
트리졸인비트로젠15596026
UV-VIS 분광광도계드노빅스DS-11

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