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방법 논문

마우스 안구 수정체 상피 및 섬유 세포 벌크 덩어리에서 RNA 분리

914 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69079

⸱

2025년 10월 10일

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 마우스 안구 수정체 상피와 섬유 세포 벌크 질량의 분리에 이어 RNA 분리 및 qPCR 분석을 자세히 설명합니다. 이 방법을 사용하면 상피 세포와 분화된 섬유 세포의 전사체 및 생물학적 과정을 보다 자세히 분석하기 위해 수정체 세포 구획을 분리할 수 있습니다.

초록

수정체는 상피 세포와 섬유 세포라는 두 가지 주요 세포 유형으로 구성된 눈의 전방에 있는 특수하고 투명한 조직입니다. 수정체 상피 세포의 단층은 수정체의 전반구를 덮고 있는 반면, 대부분의 수정체는 수정체 섬유 세포 덩어리로 구성됩니다. 캡슐로 알려진 콜라겐 기저막은 전체 조직을 둘러싸고 캡슐화합니다. 수정체 상피 세포는 수정체 캡슐에 강하게 부착되어 있으며 캡슐을 조직에서 떼어내면 벌크 섬유 덩어리에서 쉽게 분리될 수 있습니다. 수정체 단층의 적은 수의 상피 세포에서 충분한 RNA 농도를 얻는 데 어려움이 있어 이전에 상피 세포 대 섬유 세포 전사체에 대한 연구가 방해되었습니다. 이 프로토콜은 단일 마우스 렌즈 쌍에서 상피 세포 샘플에 대한 후속 전사체 실험을 허용하기 위해 상피 및 섬유 세포 구획 및 RNA 농축 단계를 깨끗하게 분리하고 분리하는 방법을 제시합니다. 수정체의 주요 세포 유형을 개별적으로 조사하는 능력은 수정체 유지 및 조절 장애의 생물학적 메커니즘을 조사하는 데 도움이 되며, 연령 관련 수정체 병리의 원인이 되는 세포 유형 특이적 중단의 특성을 분석할 수 있습니다.

서론

안구 수정체는 선명한 이미지를 생성하기 위해 망막에 빛을 미세하게 집중시키는 투명한 기관입니다. 수정체는 전반구를 덮고 있는 단층 상피 세포와 조직의 벌크 질량을 구성하는 섬유 세포의 두 가지 주요 세포 유형으로 구성됩니다(그림 1). 수정체는 수정체 캡슐로 알려진 콜라겐 기저막으로 둘러싸여 있으며, 상피 세포가 단단히 부착되어 있습니다. 수정체가 성장함에 따라 적도의 상피 세포는 증식하고 동심원으로 수정체 위에 층층이 쌓인 섬유 세포의 초기 껍질로 분화합니다 1,2,3. 평생 수정체 성장은 발아대를 구성하는 적도 상피 세포의 작은 집단의 지속적인 증식에 달려 있습니다4. 섬유 세포가 성숙함에 따라 모든 세포 소기관은 분해되어 광산란 물체 5,6,7,8,9,10,11 을 제거하고 조직 투명성을 유지하며, 가장 안쪽의 섬유 세포는 결국 압축되어 단단한 수정 체 중심 9,12을 만듭니다. 주변의 수정체 캡슐로 인해 수정체의 세포 회전율이 없으며, 정섬유는 조직 주변이나 피질에 새로운 섬유가 추가됨에 따라 평생 동안 수정체의 중심에 남아 있습니다. 렌즈의 섬유 세포는 나이에 따라 다른 광학적 특성을 가지며, 주어진 각 단계(13)에서 다양한 생물학적 특성의 시간적 스냅샷을 제공할 수 있다.

이용 가능한 수술 옵션에도 불구하고 일반적으로 투명한 수정체의 혼탁으로 정의되는 백내장은 여전히 전 세계 실명의 주요 원인으로 남아 있습니다14. 백내장은 다른 병태생리학을 가진 수정체 상피, 피질 또는 핵에서 나타날 수 있습니다15. 그러나 백내장 형성의 세포 및 분자 메커니즘은 불분명합니다16,17. 이러한 다양한 유형의 백내장을 예방하고 수술에 대한 대안을 개발하는 방법을 더 잘 이해하려면 이러한 다양한 세포 유형이 수정체에서 항상성을 유지하는 방법을 더 잘 이해해야 합니다.

상피 세포와 섬유 세포는 수정체에서 서로 다른 생리학적 역할을 합니다. 예를 들어, 세포 증식은 수정체 상피에 제한된다18. 한편, 렌즈 섬유는 렌즈의 벌크 질량을 구성하여 렌즈(9)에 구조 및 굴절 특성을 제공한다. 수정체의 다양한 구획과 관련된 생물학적 과정에 대한 보다 미묘한 관점을 얻으려면 상피 세포와 섬유 세포를 별도로 조사해야 합니다. 여기에서는 섬유 세포 벌크 덩어리에서 상피를 분리하고, 각 분획에서 mRNA를 추출하고, 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 사용하여 이러한 전사체를 분석하는 방법을 제시합니다.

figure-introduction-1
그림 1: 렌즈 해부학도. 수정체는 전반구를 덮고 있는 단층 상피 세포(파란색 및 주황색)와 수정체 섬유의 대량 덩어리(흰색)의 두 가지 세포 유형으로 구성됩니다. 조직은 수정체 캡슐(황갈색)으로 알려진 얇은 콜라겐 막으로 둘러싸여 있습니다. 전방 상피 세포(파란색)는 정지 상태인 반면 적도 상피 세포(주황색)는 증식, 분화 및 신장하여 수정체 주변에서 새로운 섬유 세포 층(흰색)이 됩니다. 새로운 세대의 섬유 셀은 동심원 쉘의 이전 세대 섬유 위에 겹쳐집니다. 가장 오래된 수정체 섬유 세포는 조직의 중앙으로 압축됩니다. 이 수치는 Cheng(2024)38에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

모든 동물 실험은 국립보건원(National Institutes of Health)의 "실험동물 관리 및 사용 가이드"와 인디애나 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인된 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 작업 영역, 장비 및 시약 준비

  1. 사용하기 전에 오토클레이브 피펫 팁을 사용하고 RNase 오염을 방지하기 위해 RNA 실험을 위해 고압멸균 팁 상자를 지정하십시오.
  2. 흄 후드의 작업 표면적과 조직 균질화 유봉을 RNase 오염 제거 용액으로 처리하고 탈이온수로 철저히 헹구고 건조시킵니다.
  3. 해부 도구(곡선 겸자, 직선 겸자 및 미세 해부 가위)를 70% 에탄올에 5분 동안 담그고 사용하기 전에 섬세한 작업용 물티슈로 건조시킵니다.
  4. 해부 및 조직 분리 단계를 위해 새로운 해부 트레이와 페트리 접시를 사용하십시오.
  5. 400 μL의 차가운 TRIzol 산-구아니디늄-페놀 시약을 흄 후드의 DNAse 및 RNAse가 없는 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다.

2. 마우스 렌즈 해부

  1. CO2 과다 복용을 사용하여 성인 마우스를 안락사시킨 후 2차 조치로 자궁경부 탈구를 사용합니다.
  2. 구부러진 겸자를 사용하여 눈을 적출합니다.
    1. 겸자로 눈 주변의 조직을 부드럽게 눌러 눈이 소켓에서 튀어나오도록 합니다. 눈 아래의 집게를 닫고 위쪽으로 꾸준히 당겨 제거합니다.
    2. 눈을 750-1000μL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  3. 해부의 경우, 새로운 1x PBS가 있는 해부 트레이의 웰로 눈을 옮깁니다.
  4. 해부 현미경으로 직선 겸자를 사용하여 시신경의 기저부를 잡고 날카로운 미세해부 가위로 신경을 가능한 한 눈에 가깝게 자릅니다.
  5. 시신경이 연결된 구멍에 가는 직선 겸자를 조심스럽게 삽입하고 꼬집어 조직을 제자리에 고정합니다.
  6. 미세해부 가위의 끝을 같은 구멍에 삽입하고 눈의 후극에서 각막-공막 접합부를 향해 조심스럽게 자릅니다. 렌즈 손상을 방지하기 위해 기구를 너무 깊게 삽입하지 마십시오.
    알림: 설치류 렌즈는 눈에서 많은 부피를 차지하므로 렌즈에 구멍이 뚫리는 것을 방지하기 위해 얕은 절단을 권장합니다.
  7. 미세 해부 가위를 사용하여 각막-공막 접합부를 따라 잘라 눈 둘레의 절반 이상을 분리합니다.
  8. 직선 겸자를 사용하여 각막을 밀면서 눈 조직을 부드럽게 반전시키고 각막-공막 절개 부위를 통해 수정체를 돌출시킵니다.
  9. 미세한 직선 겸자를 사용하여 렌즈에서 부착된 큰 조직을 조심스럽게 제거합니다.
  10. 필요한 경우 곡선 겸자를 사용하여 깨끗하고 섬세한 작업용 물티슈에서 렌즈를 부드럽게 굴려 남아 있는 부착된 렌즈외 조직을 제거합니다.
    알림: 작업 물티슈를 가로질러 티슈를 빠르게 굴리고 티슈가 과도하게 건조되지 않도록 하십시오. 렌즈 캡슐의 건조 반점으로 인해 렌즈 표면에 작은 혼탁이 있을 수 있습니다. 이러한 불투명도는 일반적으로 렌즈를 1x PBS에 다시 배치할 때 되돌릴 수 있으며 후속 단계에 영향을 미치지 않습니다.
  11. 세척된 렌즈를 1x PBS가 있는 6cm 페트리 접시에 옮깁니다.
  12. 미세한 직선 집게를 사용하여 적도 근처의 렌즈 캡슐을 얕게 뚫고 섬유 벌크 덩어리에서 렌즈 캡슐을 부드럽게 떼어냅니다. 수정체 상피 세포는 캡슐에 부착된 상태로 유지됩니다. 캡슐 해제로 인해 벗겨졌을 수 있는 큰 섬유 조각을 캡슐에서 부드럽게 제거합니다.
  13. 가는 직선 겸자로 캡슐을 부드럽게 잡고 1x PBS에서 소용돌이치며 남아 있는 섬유를 제거합니다. 느슨하게 부착된 섬유 세포는 캡슐 및 상피 세포에서 해리됩니다.

3. RNA 분리

참고: RNA 분리를 위한 요약된 워크플로우가 그림 2에 나와 있습니다.

  1. 2개의 렌즈 캡슐 또는 2개의 섬유 벌크 덩어리를 400μL의 차가운 TRIzol 시약이 들어 있는 각각의 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 증착합니다.
    알림: 섬유 덩어리는 조직을 퍼내기 위해 곡선 집게를 사용하여 접시에서 튜브로 이동해야 합니다.
  2. 후속 단계를 위해 튜브를 단단히 닫고 화학 연기로 옮깁니다.
  3. 깨끗한 펠릿 유봉을 사용하여 렌즈 섬유 벌크 덩어리를 부드럽게 균질화합니다.
    알림: 섬유 덩어리를 완전히 분해해야 합니다.
  4. 샘플(렌즈 캡슐 또는 균질화된 섬유 벌크 덩어리)을 TRIzol에서 훈제 후드의 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  5. 흄 후드에서 TRIzol 시약 400μL당 200μL의 클로로포름을 각 튜브에 추가합니다. 튜브를 단단히 닫고 엄지손가락을 튜브 바닥에 대고 집게손가락을 캡에 대고 손으로 15초 동안 세게 흔듭니다.
    참고: 재료 목록에 명시된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브는 단단히 밀봉되어 있기 때문에 사용됩니다. 다른 브랜드의 미세 원심분리기 튜브를 사용하는 경우 밀봉이 단단하지 않은 튜브의 캡 아래에서 TRIzol 및 클로로포름 용액이 누출될 수 있으므로 흔들기 전에 튜브 마개와 밀봉을 테스트하십시오.
  6. 상 분리를 허용하기 위해 실온에서 10-15분 동안 샘플을 배양합니다.
    참고: 튜브 바닥에는 지질과 단백질을 포함하는 분홍색 TRIzol 시약 층이 있어야 하고, DNA를 포함하는 상 사이에는 흰색 층이 있어야 하며, 상단에는 RNA를 포함하는 투명한 수성 상이 있어야 합니다. 백색 DNA 층은 상피 세포 샘플에서 보기가 더 어려울 수 있습니다.
  7. 샘플을 14,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
    알림: 튜브를 원심분리기 안팎으로 조심스럽게 옮기고 이송 단계를 방해하지 않도록 주의하십시오.
  8. RNA Clean and Concentrator 키트에서 튜브와 시약을 조립합니다. 스핀 컬럼 튜브는 키트의 수집 튜브에 장착됩니다.
  9. 흄 후드에서 투명한 수성상(최상층)을 깨끗한 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고 부피를 기록합니다.
    참고: 수성 상 아래의 백색 DNA 층을 방해하거나 만지거나 끌어올리지 마십시오. 수성을 옮길 때 흰색 층을 방해하지 않도록 튜브를 기울이십시오. 샘플을 오염시키는 것보다 튜브에 소량의 수성을 남기는 것이 바람직합니다. 일반적으로 200μL의 첨가된 클로로포름에 대해 180-190μL의 수성을 회수할 수 있습니다.
  10. 200프루프 에탄올을 수성상에 1:1 체적 비율로 첨가합니다.
    참고: 농축기 키트의 RNA 결합 완충액은 에탄올을 첨가하기 전에 수성상에 2:1 부피 비율로 첨가할 수 있습니다. RNA 수율을 높이고 분리 후 RNA가 충분한 순도를 갖기 때문에 이 단계를 건너뜁니다.
  11. 튜브를 여러 번 뒤집거나 용액을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 피펫터를 사용하여 혼합 용액을 RNA 스핀 컬럼으로 옮깁니다.
    알림: 피펫 팁으로 필터를 만지지 않도록 주의하십시오.
  12. 4°C에서 30초 동안 16,000 x g 스핀 컬럼을 원심분리합니다.
    참고: 튜브 세트를 정리하고 후속 원심분리 단계에서 캡이 부러질 경우를 대비하여 컬럼의 뚜껑과 수집 튜브의 측면에 라벨을 붙이는 것이 좋습니다.
  13. 플로우스루를 버리고 400μL의 RNA Prep Buffer를 스핀 컬럼에 추가합니다.
  14. 4°C에서 30초 동안 16,000 x g 스핀 컬럼을 원심분리합니다.
  15. 플로우스루를 버리고 700μL의 RNA Wash Buffer를 스핀 컬럼에 추가합니다.
  16. 4°C에서 30초 동안 16,000 x g 스핀 컬럼을 원심분리합니다.
  17. 플로우스루를 버리고 400μL의 RNA Wash Buffer를 스핀 컬럼에 추가합니다.
  18. 4°C에서 1분 동안 16,000 x g 스핀 컬럼을 원심분리합니다.
  19. 플로우스루를 버리고 4°C에서 30초 동안 16,000 x g 으로 다시 한 번 원심분리하여 스핀 컬럼이 건조한지 확인합니다.
  20. 스핀 컬럼을 새로운 표지 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 이동합니다.
  21. 멤브레인 필터에 RNase가 없는 물 15μL를 추가합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다.
    알림: 피펫 팁으로 필터를 만지지 않도록 주의하십시오.
  22. 스핀 컬럼을 4°C에서 30초 동안 16,000 x g 로 원심분리하여 정제된 RNA를 용리합니다.
    참고: 1.5mL 미세 원심분리기 튜브의 캡은 원심분리 중에 열린 상태로 유지됩니다. 원심분리 중에 흔들리거나 부러지지 않도록 열린 캡이 로터 뚜껑에 닿도록 스핀 컬럼과 미세 원심분리기 튜브를 조심스럽게 배치하십시오. 뚜껑은 로터 회전 방향을 따라야 합니다.
  23. 스핀 컬럼을 제거하고 폐기합니다. RNA는 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집된 액체에 있습니다.
  24. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 단단히 닫고 RNA 샘플을 55-65°C에서 10분 동안 배양하여 재용해를 촉진합니다.
  25. 가열 단계 후 즉시 샘플을 얼음 위에 올려 놓습니다.
  26. 샘플을 -80°C에서 보관하거나 장기 보관을 위해 cDNA로 역전사합니다.
    참고: RNA 샘플은 눈에 띄는 농도 손실 없이 최대 3개월 동안 보관되었습니다. 냉동-해동 주기를 최소화하고 분해를 방지하기 위해 보관을 위해 RNA 샘플을 더 작은 부피로 분취합니다.

4. UV-Vis 분광 광도계를 사용한 RNA 농도 측정

  1. RNA 샘플을 얼음 위에 보관하고 NanoDrop(UV-Vis 분광 광도계)의 전원을 켠 다음 기기가 초기화되도록 합니다.
  2. Nucleic Acids 메뉴에서 RNA 정량 모듈을 선택합니다.
  3. RNA 농도 단계에서 2.0μL의 용리액을 받침대(이 경우 분자 등급 물)에 피펫팅하여 UV-Vis 분광 광도계를 블랭크합니다. 기기 암을 내리고 빈 샘플을 읽습니다.
  4. 기기 암을 들어 올리고 깨끗하고 건조하고 섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 센서 받침대를 청소한 다음 탈이온수에 적신 물티슈를 한 다음 다시 한 번 마른 물티슈로 청소합니다.
  5. 원하는 경우 UV-Vis 분광 광도계 인터페이스에 샘플 세부 정보를 입력합니다.
  6. 2.0μL의 RNA 샘플을 받침대에 로드하고 팔을 내린 다음 정량화합니다.
  7. 4.4-4.6단계를 반복하여 샘플 사이의 받침대를 청소합니다.
  8. 완료되면 필요한 경우 추가 정량화를 위해 실험을 저장하고 내보냅니다.

5. 역전사

  1. 처리성이 높고 열에 안정적인 역전사 효소를 사용하여 제조업체의 권장 프로토콜을 사용하여 2.0μg의 수정체 섬유 RNA와 추출된 모든 상피 RNA를 역전사합니다. 깨끗한 PCR 튜브에서 각 샘플에 대한 시약과 RNA를 혼합합니다. 모든 용액과 RNA 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
    참고: 이 전사 효소는 반응당 최대 2.5μg의 RNA를 역전사할 수 있습니다. RNA에서 cDNA로의 완전한 전환이 가정되므로 RNA 시작 농도가 추정 cDNA 농도로 사용됩니다.
  2. 표 1에 나열된 조건을 사용하여 열 순환기에서 반응을 실행합니다.
  3. 역전사된 cDNA를 -80°C에서 보관하거나 qPCR 단계를 진행합니다.
    참고: cDNA 샘플은 cDNA가 RNA보다 더 안정적이기 때문에 눈에 띄는 분해 없이 최대 4개월 동안 보관되었습니다. 동결-해동 주기가 최소화된다면 샘플을 더 오래 보관할 수 있습니다.
걸음온도(°C)시간(분)사이클
어 닐 링25101
역전사50101
효소 불활성화8551
들다4∞1

표 1: 역전사를 위한 열순환기 조건. 이러한 조건은 특이적이고 매우 진행적이며 열에 안정적인 역전사 효소에 맞춰져 있습니다. 실행 조건은 사용하는 효소 및 키트에 따라 다를 수 있습니다.

6. 정량적 실시간 PCR

  1. 반응을 시작하기 전에 분자 등급의 물로 희석하여 원하는 농도로 cDNA 스톡 용액을 준비합니다. 이 실험에서 1μL의 cDNA를 5ng/웰 반응에 대해 5ng/μL로 사용됩니다. 모든 용액과 cDNA 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
    참고: TaqMan 어레이 플레이트(0.1mL 형식)는 웰당 5-50ng cDNA의 반응을 수용하는 것이 좋습니다. cDNA의 분취량을 만드는 것은 동결-해동 주기를 제한하는 데 유용합니다. 이 연구에서 샘플은 최대 5회의 동결-해동 주기로 제한되었습니다.
  2. 고급 마스터 믹스와 상업적 권장 사항에 대한 프로브로 구성된 작업 마스터 믹스를 준비합니다. 예제 준비는 섹션 7을 참조하십시오. 모든 용액과 cDNA 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
    참고: 두 가지 다른 염료를 가진 한 쌍의 프로브가 일반적으로 웰당 사용됩니다. 예를 들어, 본 연구에서는 Crygs-FAM-MGB를 관심 유전자 프로브로, Ppia-VIC-MGB를 내부 대조군으로 사용하였다. 최종 프로브 및 프라이머 농도에 대한 상업적 권장 사항은 각각 250nM 및 900nM입니다. 표적이 매우 높게 발현되는 경우 반응 시약의 고갈을 방지하기 위해 프라이머 제한 프로브가 필요할 수 있습니다.
  3. cDNA 스톡(1μL)을 qPCR 플레이트의 적절한 웰에 로드한 다음 작업 마스터 믹스(9μL)를 로드합니다. 마스터 믹스를 추가하는 동안 천천히 위아래로 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. cDNA 방울이 용액에 혼합되었는지 확인하고 기포가 발생하지 않도록 하십시오.
    알림: 대상의 감도에 따라 플레이트를 얼음 위에 적재해야 할 수도 있습니다.
  4. 광학 접착 커버를 조심스럽게 적용하여 qPCR 플레이트를 밀봉합니다. 접착 필름 어플리케이터를 사용하여 덮개를 매끄럽게 하고 각 웰 주위를 단단히 밀봉합니다.
  5. 1000RPM에서 10초 동안 혼합하는 와류 플레이트.
  6. 플레이트를 실온에서 2분 동안 1000 x g 으로 원심분리하여 웰 바닥에 기포가 없는지 확인합니다.
  7. 플레이트를 정량적 PCR 열 순환기에 로드하고 표 2에 나열된 사이클을 사용하여 실행합니다.
    참고: 기존의 qPCR 프로토콜은 일반적으로 40주기로 제한됩니다. 40 사이클까지 단일 표적 사본이 이론적으로 약 1조 앰플리콘을 산출할 수 있기 때문에 사이클 수를 늘리는 것은 의미 있는 결과를 생성하지 않을 것입니다19.
걸음온도(°C)시간사이클
우라실-N-글리코실라제(UNG) 비활성화501201
변성951201
변성95145
어 닐 링6020
들다4∞1

표 2: 정량적 중합효소 연쇄 반응을 위한 열순환기 조건. 이러한 조건은 특정 일련의 상업용 유전자 발현 분석에 맞춰져 있습니다. 증폭 주기를 40에서 45로 늘리는 것을 제외하고는 기본 매개변수가 사용됩니다.

7. qPCR의 부피 계산 예

참고: 아래에 설명된 방정식에 대한 부피 계산기의 R 소스 코드는 보충 파일 1에서 사용할 수 있습니다. 이 계산기는 재료 표에 나열된 Taqman 프로브 및 마스터 믹스용입니다.

  1. 피펫팅할 웰의 수를 결정하고 최소 12.5%의 초과분을 계산합니다. 이 초과 상수(k초과)는 피펫팅 오류를 보상하고 충분한 용액이 있는지 확인합니다. 이 예에서는 96개의 웰이 샘플 준비의 대상으로 사용됩니다.
    방정식:
    figure-protocol-1
    본보기:
    figure-protocol-2
    참고: 12.5% 초과가 정수가 아닌 경우 후속 단계에서 "좋은" 숫자를 보장하는 쉬운 방법은 가장 가까운 우물로 반올림하고 그에 따라 k초과를 조정하는 것입니다.
  2. 작업 마스터 믹스 부피를 계산합니다. 이 실험에서는 웰당 1μL의 cDNA와 9μL의 작업 마스터 믹스가 사용됩니다. cDNA 및 마스터 믹스 부피는 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
    방정식:
    figure-protocol-3
    본보기:
    figure-protocol-4
  3. 농도 수정자(kConc)를 계산합니다. 이 개질제는 cDNA와 혼합할 때 1배로 희석되는 보다 농축된 작업 마스터 믹스를 만드는 데 사용됩니다.
    방정식:
    figure-protocol-5
    본보기:
    figure-protocol-6
  4. 프로브(20x) 부피를 계산합니다.
    방정식:
    figure-protocol-7
    본보기:
    figure-protocol-8
  5. 마스터 믹스 스톡(2x) 부피를 계산합니다.
    방정식:
    figure-protocol-9
    본보기:
    figure-protocol-10
  6. 작업 마스터 믹스를 분자 등급 H2O를 사용하여 계산된 부피까지 가져옵니다.
    방정식:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    본보기:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

보충 파일 1: 볼륨 계산기의 R 소스 코드입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

수정체 상피와 섬유는 6주에서 7주 된 야생형 마우스에서 분리되었습니다. 이 실험에는 3마리의 마우스를 사용하였고, 각 마우스의 2개의 수정체 캡슐 또는 2개의 섬유 세포 덩어리를 하나의 생물학적 복제를 위해 함께 모았습니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이, RNA는 TRIzol 시약상 분리를 사용하여 추출되었습니다. 평균적으로 한 쌍의 수정체 상피와 섬유 벌크 덩어리는 각각 0.8μg(SD ± 0.2) 및 9.7μg(SD ± 2.3)의 RNA를 생성했습니다. 15 μL 용출의 평균 농도는 상피 및 섬유 샘플에 대해 각각 55.4 ng/μL(SD ± 16.3) 및 650.0 ng/μL(SD ± 152.2)였습니다. 5ng/웰 반응을 사용하면 이론적으로 이 프로토콜을 사용하여 분리된 단일 쌍의 수정체 상피에서 평균 160개의 반응이 가능합니다. A260/280 비율로 측정한 평균 RNA 순도는 상피의 경우 1.92(SD ± 0.05), 섬유의 경우 2.05(SD ± 0.01)로 단백질 오염이 최소화되었음을 나타냅니다. 일반적으로 ~...

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토론

여기에 제시된 단계는 분자 생물학 방법을 위해 cDNA로 성공적으로 역전사될 수 있는 별도의 수정체 구획에서 RNA를 분리하는 능력을 보여줍니다. 분석 방법의 민감한 특성으로 인해 해부 단계에서 렌즈에 부착된 조직이 깨끗해야 합니다. 적절한 청결을 얻기 위해 Kimwipe에서 렌즈를 몇 번 반복해야 할 수도 있습니다. 상피 세포 샘플이 상당한 양의 섬유 세포로 오염되지 않도록 섬유성 벌크 덩어리 구획에서 콜라겐 캡슐을 분리하는 동안 렌즈를 너무 깊게 침투하지 않도록 주의해야 합니다. 수정체 상피 세포는 캡슐에 단단히 부착되어 있으며 상피 세포와 밑에 있는 섬유 세포 사이의 접착력이 상대적으로 약하여 섬유 세포 덩어리에서 캡슐과 부착된 상피 세포를 깨끗하게 분리할 수 있습니다. 렌즈 구획이 분리되어 TRIzol에 증착되면 유해 연기를 피하고 분리된 RNA의 오염 및 분해를 방지하기 위해 샘플을 화학 연기에서 처리해야 합니다.

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공개 사항

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감사의 글

이 작업은 국립 안과 연구소(National Eye Institute)의 보조금 R01 EY032056(CC로)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
원심분리기 및 로터피셔 사이언티픽오후 14285554
클로로포름, HPLC 등급알파 이사르22920
에탄올(190프루프)데콘 연구소2801
에탄올(200프루프)피셔 바이오시약BP2818
피셔 브랜드 펠렛 유봉피셔 사이언티픽12-141-363
집게, 곡선; 학생용 핀셋 #7세계 정밀 기기501981
집게, 직선; 듀몽 #5정밀 과학 도구11252-40
집게, 직선; 학생용 핀셋 #4세계 정밀 기기501978
킴와이프, 소형킴벌리-클라크34155섬세한 작업 삭제
MicroAmp 접착 필름 어플리케이터어플라이드 바이오시스템4333183
MicroAmp EnduraPlate 광학 96웰 고속 투명 반응 플레이트(바코드 포함)어플라이드 바이오시스템4483485
마이크로피펫터에펜도르프  01-671-120
현미경, 해부칼 자이스스테레오 디스커버리.V8
MiniAmp 광학 접착 커버어플라이드 바이오시스템4360954
MiniAmp 열 순환기어플라이드 바이오시스템A37834
MixMate 플레이트 와류 믹서에펜도르프5353000529
분자 등급 물피셔 사이언티픽BP28191
Nanodrop One Microvolume UV-Vis 분광 광도계써모 사이언티픽ND-원-W
Nunc MicroWell 미니트레이피셔 사이언티픽12-565-154해부 트레이
PCR 튜브VWR201007-012
페트리 접시, 60mm x 15mm피셔 사이언티픽FB0875713A
인산염 완충 식염수, 1x Dulbecco's깁코14190-136
피펫 팁, 10 및 마이크로; L 눈금이 매겨진미국 사이언티픽1161-3700
피펫 팁, 1250 & micro; L XL 눈금미국 사이언티픽1161-1720
피펫 팁, 200 및 마이크로; L 프로파일 눈금이 매겨짐미국 사이언티픽1163-1700
QuantStudio 3 Real-Time PCR 시스템어플라이드 바이오시스템A28567
역전사 효소, 위 첨자 IV VILO 인비트로젠11756050가공성이 높고 열안정성이 높은 역전사 효소
RNA 세척 및 농축기 5 키트자이모ZR1013 시리즈
RNase-프리 워터피셔 바이오시약BP2819
RNaseZap시그마R2020RNase 오염 제거 용액
SealRite 미세 원심분리기 1.5 mL 튜브미국 사이언티픽1615-5500
슈퍼파인 반나 8cm세계 정밀 기기501778가위
qPCR용 TaqMan FAST Advanced Master Mix어플라이드 바이오시스템4444557
TaqMan 유전자 발현 분석(FAM) 프로브 (MTO)써모피셔 사이언티픽4448892
트리졸인비트로젠15596026산-구아니디늄-페놀 용액
와류 믹서써모 사이언티픽88880017

참고문헌

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