PAK5는 전사체 프로파일링을 통해 드러나는 식도 편평세포암의 진행을 촉진합니다

요약

본 연구는 ESCC에서 PAK5 기능을 평가하는 방법을 제시하며, 과발현이 예후를 좋지 않게 예측하고 PAK5-GAREM1 신호 전달 축을 통한 종양 진행을 촉진함을 보여줍니다.

초록

식도 편평세포암(ESCC)은 전 세계적으로 특히 아시아에서 암 관련 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 초기 증상이 없기 때문에 대부분의 환자가 진행된 단계에 진단받아 치료 효과가 제한되고 예후가 악화됩니다. ESCC의 기전을 이해하고 바이오마커나 치료 표적을 식별하는 것은 환자 치료 결과를 개선하는 데 매우 중요합니다. P21 활성화 단백질 키나아제(PAK5)는 미토겐 활성화 단백질 키나아제 계열의 일원으로, 세포 주기, 이동, 침범을 조절함으로써 다양한 악성 종양과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 ESCC에서의 역할은 여전히 불분명하다. 본 연구는 면역조직화학을 이용해 ESCC 조직과 인접한 정상 조직에서 PAK5 발현을 평가하고, PAK5와 예후 간의 연관성을 평가하기 위해 Kaplan-Meier 생존 분석을 수행하였습니다. PAK5 과발현 및 넉다운을 가진 ESCC 세포 모델이 구축되었고, CCK-8, 콜로니 형성, 트랜스웰 분석 등 기능적 분석도 수행되었습니다. 더 나아가 mRNA 시퀀싱을 수행하여 PAK5에 의해 조절되는 하위 표적과 신호 전달 경로를 식별하였습니다. 이 결과는 정상 조직에 비해 ESCC 조직에서 PAK5 발현이 유의하게 높았으며, 예후가 좋지 않음을 보여주었습니다. 기능적 분석 결과 PAK5는 ESCC 세포 증식, 집락 형성, 이동 및 침범을 촉진했으며, 전사체 분석에서는 GAREM1이 주요 하류 효과자임을 강조했습니다. 이 결과는 PAK5가 ESCC 진행에 기여하며 예후 바이오마커 및 치료 표적 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

서론

전 세계적으로 식도암은 가장 치명적인 악성 종양 중 하나입니다. 중국에서는 식도 편평세포암(ESCC)이 주요 조직학적 아형입니다. 치료적 진전이 이루어졌음에도 불구하고, ESCC 환자의 예후는 여전히 암울하여 5년 생존율이 10%에서 25%에 불과합니다^. 이는 주로 조기 발견의 어려움과 효과적인 분자 표적 치료제의 제한된 가용성^{때문입니다.} 표적 치료가 상당한 가능성을 보인 다른 고형 종양과 달리, ESCC에서의 이러한 접근법은 아직 초기 단계에 있으며, 실행 가능한 분자 표적이 부족하다는 점에서 제약을 받고 있습니다.

PAK5는 그룹 II PAK로, 세포골격 역학과 생존 촉진 신호를 통합하며, 3,4,5,6,7,8,9,10,11의 여러 암에서 화학요법 내성과 연관되어 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 하이난 의과대학 제2부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인번호 LW2022602), 그리고 헬싱키 선언에 따라 각 참가자로부터 사전 동의를 받았습니다. 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 환자 및 조직 샘플 수집

총 40명의 병리학적으로 확진된 ESCC 환자가 등록되었으며, 모두 수술 전 간 및 신장 기능이 정상이었다. 종양 표본(그룹 T)과 인접한 정상 조직(그룹 N; 종양 가장자리에서 ≥ 2cm)을 수술 직후 채취하였다. 조직은 파라핀 임베딩하기 전 7일간 상온에서 PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정되었습니다.

2. 면역조직화학 염색

파라핀 내재 블록은 5 μm 두께로 절단되어 60 °C에서 1시간 동안 베이킹되었습니다. 절편은 자일렌 대체물로 탈파라핀화되고, 등급 에탄올로 재수화된 후, 10 mM 시트레이트 나트륨 버퍼(pH 6.0)에서 95-98 °C에서 20분간 항원 회취를 했습니다.....

결과

PAK5는 ESCC에서 많이 발현되어 있으며 예후가 좋지 않은 것과 관련이 있습니다
그림 1은 PAK5의 임상 검증부터 기능 및 전사체 분석에 이르기까지의 전체 워크플로우를 보여주며, 이를 통해 GAREM1을 하류 표적으로 식별합니다. PAK5가 GAREM1 을 통해 MAPK 경로를 조절하여 ESCC 진행을 촉진한다는 가설을 검증하기 위해, ESCC 조직에서 PAK5의 발현 패턴과 임상 예후와의 연관성을 조사하였다. 첫째, 유전자 발현 데이터셋 GSE269447은 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터베이스에서 가져온 것으로, ESCC와 정상 조직 간 유의미하게 차별화된 유전자(DEGs)를 선별하는 데 사용되었다¹⁹. 이후 열지도와 화산 도표가 생성되었습니다(그림 2A<.......

토론

본 연구는 임상 샘플, 기능 검사, 전사체 분석을 결합하여 식도 편평세포암(ESCC) 진행에서 PAK5의 역할을 심층적으로 조사합니다. 이 발견들은 PAK5가 ESCC에서 얼마나 관여하고 있는지에 대한 이해를 넓히며, 예후 표지자이자 치료 표적으로서의 잠재력을 강조합니다.

ESCC 조직에서 PAK5의 현저한 과발현과 환자 생존율 저하와의 연관성은 다른 암에서 PAK5가 종양 진행과 예후 악화와 연관된 결과와 일치한다^10,11. PAK5를 ESCC 진행의 조절 인자로 규명함으로써, 우리 연구는 키나제 매개 암발생에 대한 더 넓은 이해에 기여하고, 식도암에서 MAPK 경로 조절에 대한 새로운 통찰을 제공합니다. 특히, PAK5만이 ESCC 발병 기전과 관련된 PAK 계열 중 유일한 구성원이 아니며, 이전 연구들은 이 질.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Annexin V-FITC 세포자멸사 검출 키트	비요타임 바이오테크놀로지컬	C1062S	세포자멸증 감지 염색 키트
항-PAK5 항체	앱캠	AB110069	IHC에 대한 1차 항체, 희석 비율 1:100
자동 전기영동 시스템	애질런트	2100 바이오분석기	RNA 무결성 평가
cDNA 합성 키트	인비트로젠	1896649	역전사 키트
크리스탈 바이올렛 용액	시그마-올드리치	C3886	식민지 및 침입용 염료
DMEM 미디엄	깁코 (써모피셔)	11965092	세포 배양 배지
태아 소 혈청 (FBS)	깁코 (써모피셔)	16000044	세포 배양 보충제
유세포계	BD 생명과학	FACSCanto II	세포 분석을 위한 기기
그래프패드 프리즘	그래프패드 소프트웨어	버전 8	통계 분석 및 그래프 작성 소프트웨어
H& E 스테인 키트	솔라비오	G1120	헤마톡실린 및 에오신 염색 용액
HRP 결합 항쥐 IgG	앱캠	AB150165	IHC에 대한 2차 항체
일루미나 노바세쿼 시퀀서	일루미나	노바세쿼터 6000	고처리량 시퀀싱 플랫폼
KYSE-150 세포주	리켄 셀 뱅크	RCB2057	인간 식도 편평암 세포주
리포펙타민 3000	서모피셔	L3000008	트랜스펙션 시약
마이크로플레이트 리더	바이오텍 인스트루먼츠	ELx808	흡광도 측정 기기
DynabeadTM Oligo(dT)25s	써모피셔 사이언티브	61005	mRNA 정제를 위해
페니실린-스트렙토마이신	깁코 (써모피셔)	15140122	세포 배양용 항생제
프로피듐 요오다이드 (PI)	시그마-올드리치	P4864	DNA 염색 염료
RPMI-1640 미디엄	깁코 (써모피셔)	11875093	세포 배양 배지
분광광도계	써모피셔	나노드롭 ND-1000	RNA 농도 및 순도 측정
SPSS 소프트웨어	IBM	버전 23	통계 분석 소프트웨어
트랜스웰 인서트	코닝	3422	세포 침범 분석 삽입물