방법 논문

공기-액체 계면 배양 시스템을 이용한 인간 유도 만능 줄기세포 유래 평면 모발 피부 오가노이드의 생성

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DOI:

10.3791/69088

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2025년 10월 17일

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1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 피부 구조 및 기능을 복제하기 위해 평면, 생리학적으로 관련된 공기-액체 계면 배양 시스템을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 모낭을 포함하는 피부 오가노이드를 생산하는 방법을 간략하게 설명합니다.

초록

모낭을 함유한 인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 피부 오가노이드(SO)는 피부 미세 환경 내에서 세포 간 상호 작용을 조사하기 위한 정교한 시험관 내 모델을 제공합니다. 처음에는 진피가 환경에 노출되고 표피가 오가노이드 중심을 향해 안쪽을 향하는 거꾸로 된 낭성 구성에서 개발된 SO는 이후 인간의 피부 생리학과 더 유사한 공기-액체 계면(ALI) 배양 시스템에서 평면 구성으로 옮겨질 수 있습니다. 이 원고는 평면 SO로 해부하고 ALI 배양 시스템에서 추가로 개발할 수 있는 낭포성 SO를 생성하고 선택하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 오가노이드 발달의 중요한 단계에서 거시적 정성적 평가를 위한 정의된 체크포인트가 포함되어 있고, 낭포성 SO를 평면 피부로 평평하게 만드는 데 필요한 기술 단계를 자세히 설명하고, ALI 배양을 위한 최적의 조건을 지정하고, 분자 분석을 통해 결과를 보여줍니다. 27일째에 계통 특이적 마커를 사용한 면역형광 염색은 모낭 및 피지선 유사 구조를 포함하는 피부 부속기가 있는 다층화된 색소 상피를 나타냈습니다. 이 프로토콜은 부속물이 있는 평면 SO를 생성하는 강력한 방법을 제공하여 생리학적으로 관련된 시험관 내 모델을 제공합니다. 이 시스템은 피부 연구의 다양한 응용 분야를 지원하며 이미 병원체 감염, 자외선 유발 조직 손상 및 약물 반응을 모델링하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

서론

피부는 유기체와 환경 사이에 중요한 보호 장벽을 형성하는 동시에 체온, 수분 균형 및 감각 입력을 조절합니다. 그것은 세 가지 주요 층으로 구성됩니다: 각질화된 표면을 가진 층화된 각질 세포 상피인 표피; 세포외 기질, 섬유아세포, 신경, 혈관 및 면역 세포가 풍부한 결합 조직인 진피; 그리고 주로 피하 지방세포로 구성된 피하 세포. 인간 피부의 기능은 또한 모낭(HF), 피지선, 땀샘과 같은 특수한 부속물에 의존합니다1.

피부 질환은 전 세계적으로 가장 흔한 질병 중 하나입니다 2,3. 역사적으로 대부분의 피부 중심 연구는 전신 맥락 내에서 장기의 생리적 복잡성을 복제하는 동물 모델4을 사용하여 수행되었습니다. 그러나 윤리적 우려 증가와 함께 상당한 종간 차이4가 생리학적으로 관련된 인간 피부 모델의 개발을 주도했습니다.

기존의 인간 피부 모델은 두 가지 범주로 나뉩니다: 층화된 각질 세포로 구성된 재구성된 인간 표피와 콜라겐 매트릭스에 내장된 섬유아세포로 구성된 기본 진피 구획을 추가로 통합하는 재구성된 인간 피부 5. 두 모델 유형 모두 피부 생리학에 대한 이해를 크게 발전시켰지만 천연 인간 피부의 완전한 구조적 충실도와 세포 다양성이 부족합니다. 이러한 모델의 주요 한계는 HF와 같은 피부 부속기가 없어 모발 성장 및 재생과 관련된 피부 질환과 관련된 연구 및 약물 테스트에 적합하지 않다는 것입니다6. HF를 통합한 보다 발전된 시스템이 보고되었지만 HF 구조 및 미세 환경의 복잡성을 완전히 요약하지 못하거나 바이오 프린팅 또는 마이크로몰딩과 같은 복잡한 기술에 의존합니다 7,8,9,10.

이러한 문제 중 몇 가지를 해결하는 새로운 피부 모델은 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)11에서 생성된 피부 오가노이드(SO)입니다. 배아 발달을 모방한 hiPSC는 두개골 표면 외배엽 및 두개골 신경능선 계통을 향해 인간 피부와 매우 유사한 낭포성 구조로 자기 조직화될 수 있습니다. 이러한 SO는 층화된 표피와 세포외 기질이 풍부한 진피로 구성된 거의 모든 비면역 피부 세포 유형을 포함합니다. 중요한 것은 SO가 피부 부속기인 HF 및 피지선의 발달을 지원한다는 것입니다. hiPSC의 사실상 무제한의 확장성을 감안할 때 SO는 정교한 유전 공학과 새로운 기능 도구 개발을 가능하게 합니다. 따라서 SO는 해당 분야의 주요 발전을 나타내며 발달 생물학, 질병 모델링, 약물 테스트 및 재생 의학 분야의 응용 가능성을 가지고 있습니다.

그러나 상당한 한계가 남아 있습니다: SO는 표피가 진피 낭종 내부에 위치하고 기계적 힘으로부터 보호되고 수성 매질에 잠기는 거꾸로 된 낭성 구조를 형성합니다. 이 구성은 생리학적으로 부정확할 뿐만 아니라 공기-액체 인터페이스(ALI)의 설정을 방해합니다. 결과적으로 낭포성 SO는 표피 장벽, 기계적 힘 또는 직접적인 치근단 치료와 관련된 연구에 대한 적용이 제한적입니다. 이 문제를 해결하기 위해 낭포성 SO를 기계적으로 평평하게 한 후 ALI 조건에서 평면 피부로 배양하는 재현 가능한 방법이 아래에 제시되어 있습니다. 원래 Jung et al.에 의해 보고된 이 접근법은 정점 표피가 공기에 노출되도록 조직 구조를 재구성하여 추가 층화 및 장벽 기능을 촉진합니다12. 생성된 평면의 모발 보유 오가노이드는 인간 피부의 복잡한 구조를 유지하는 동시에 생리학적으로 정확한 조직 방향을 반영하여 정점 표면에 대한 실험적 접근을 가능하게 합니다. 절차가 길고(~100일) 특히 낭포성 SO를 평면 SO로 해부할 때 기술적으로 어려운 단계를 포함하지만, 모델 시스템의 생리학적 관련성을 높이고자 하는 SO 또는 기타 인간 피부 등가물을 이미 사용하고 있는 연구자에게 특히 흥미로울 수 있습니다.

프로토콜

그림 1 은 ALI 배양 시스템을 사용하여 평면 SO를 생성하는 워크플로를 보여줍니다. 첫 번째 섹션에서는 Karl R. Koehler11이 개척한 방법론을 기반으로 hiPSC에서 낭포성 SO를 생성하는 방법을 약간 수정했습니다(그림 2). 두 번째 섹션에서는 이전에 설명한 바와 같이12 수정을 거쳐 ALI 배양 시스템을 사용하여 낭포성 SO를 평면 SO로 추가로 개발하는 절차를 자세히 설명합니다(그림 3). 모든 화학 물질 및 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다. 이전에 기술된 3개의 hiPSC 계통(LUMCi001-A, LUMCi004-A 및 WT2)을 사용하여 SO(https://hpscreg.eu/)13를 생성했습니다.

1. 낭포성 SO의 생성

그림 2 는 주요 단계에서 예상되는 형태와 비정상적인 형태를 보여줍니다.

  1. 세포 응집(-2일)
    1. 표준 6웰 플레이트에서 hiPSC를 70-80% 합류에 도달할 때까지 배양합니다.
    2. 1mL의 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)으로 세포를 세척합니다. 1mL의 세포 해리 시약(CDR)을 첨가하고 37°C에서 5% CO2 와 함께 ~6분 동안 배양하여 hiPSC를 매트릭스에서 분리하지 않고 느슨하게 합니다(과소화 방지).
    3. CDR을 흡인하고 10μM ROCK 억제제를 함유한 hiPSC 유지 배지(hiMM) 1mL를 추가합니다. P1000 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 세포를 부드럽게 분리하고 3.5 × 103 cells/mL로 세포 현탁액을 준비합니다.
    4. 다중 채널 피펫을 사용하여 96웰 U-바닥, 초저부착 플레이트의 각 웰에 100μL의 세포 현탁액을 분배합니다. 플레이트를 실온에서 6분 동안 110× g 에서 원심분리하고 5%CO2와 함께 37°C에서 배양합니다.
  2. ROCK 억제제의 희석(-1일)
    1. 100μg/mL의 항생제-항진균제 보충제(AAS)를 함유한 hiMM을 준비합니다.
    2. 웰당 100μL를 분배하고 5%CO2와 함께 37°C에서 배양합니다.
  3. 표면 외배엽 유도(0일)
    1. 다음 단계로 진행하기 전에 얼음 위에서 적절한 양의 기저막 매트릭스를 해동합니다. 기저막 매트릭스(2%), BMP4(2.5ng/mL), SB431542(10μM) 및 bFGF(4ng/mL)(hiMinM+SFB라고 함)가 보충된 hiPSC 최소 배지(hiMinM)를 얼음 위에 준비합니다.
      참고: BMP4 농도는 사용된 세포주에 따라 조정해야 할 수도 있습니다(설명 참조).
    2. 넓은 오리피스 P200 피펫 팁을 사용하여 세포 응집체를 2mL 둥근 바닥 튜브에 수집합니다.
      알림: 시중에서 판매되는 넓은 오리피스 팁을 사용하십시오. 골재의 손상을 최소화하기 위해 내경이 2mm 이상인 오리피스를 선택하십시오. 또는 적외선 루프 멸균기로 메스를 가열하고 이를 사용하여 기존 피펫 팁에서 넓은 구멍을 만듭니다.
    3. 골재가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 배지를 조심스럽게 흡인하고 2mL의 hiMinM을 첨가하여 응집체를 세척합니다. 총 3회 세척을 반복합니다.
    4. 차가운 hiMinM+SFB의 세포 응집체를 넓은 오리피스 P1000 피펫 팁을 사용하여 예식된 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 100μL의 hiMinM+SFB에 있는 각 응집체를 넓은 오리피스 P200 피펫 팁을 사용하여 96웰 U-바닥 초저부착 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에 다시 넣습니다.
      알림: 이 단계에서는 층류 기류(LAF) 후드 아래에 배치된 실체 현미경을 사용하십시오.
  4. 비상피 세포 집단의 유도(3일)
    1. LDN193189(1μM), bFGF(250ng/mL) 및 AAS(100μg/mL)를 함유한 hiMinM을 준비합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 25μL를 분배합니다.
    2. 매체가 고르게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 저어줍니다. 플레이트를 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에 다시 넣습니다.
  5. 영양분 공급(6일차)
    1. AAS(100μg/mL)를 함유한 hiMinM을 준비합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 75 μL를 분배합니다.
    2. 매체가 고르게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 저어줍니다. 플레이트를 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에 다시 넣습니다.
  6. 중간 다과(8일차 및 10일차)
    1. AAS(100μg/mL)를 함유한 hiMinM을 준비합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 100μL의 배지를 조심스럽게 제거합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100μL의 신선한 배지를 분배합니다.
    2. 매체가 고르게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 저어줍니다. 플레이트를 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에 다시 넣습니다.
  7. 저부착 24웰 플레이트로의 전환(12일)
    1. 다음 단계로 진행하기 전에 얼음 위에서 적절한 부피의 기저막 매트릭스를 해동합니다. 고급 배지(49% v/v), 신경 기초 배지(49% v/v), 글루타민 보충제(1x), 비타민 A를 뺀 B-27 보충제(0.5x), N2 보충제(0.5x), 2-메르캅토에탄올(0.1mM) 및 AAS(100μg/mL)를 사용하여 오가노이드 성숙 배지(OMM)를 준비합니다. 1% 기저막 매트릭스(OMM1%M)를 함유한 적절한 양의 콜드 OMM을 준비하고 얼음 위에 보관합니다.
      알림: 2-메르캅토에탄올을 조작할 때는 개인 보호 장비를 사용하고 환기가 잘 되는 곳에서 작업하십시오.
    2. 넓은 오리피스 P1000 피펫 팁을 사용하여 세포 응집체를 2mL 둥근 바닥 튜브에 수집합니다.
    3. 골재가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 조심스럽게 배지를 흡인하십시오. 1.5mL의 고급 배지를 첨가하여 응집체를 세척합니다. 총 3회 세척을 반복합니다.
    4. 차가운 OMM1%M의 세포 응집체를 넓은 오리피스 P1000 피펫 팁을 사용하여 예식된 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 500μL의 OMM1%M에 있는 각 응집체를 와이드 오리피스 P1000 피펫 팁을 사용하여 24웰 저부착 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에 다시 넣습니다.
      알림: 이 단계에서는 LAF 후드 아래에 배치된 실체 현미경을 사용하십시오.
  8. 중간 다과 (15일차)
    1. 다음 단계로 진행하기 전에 얼음 위에서 적절한 부피의 기저막 매트릭스를 해동합니다. 적절한 양의 차가운 OMM1%M을 준비합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
    2. P1000 팁을 사용하여 각 웰에서 250μL의 배지를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 250μL의 OMM1%M을 추가합니다. 플레이트를 65rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 5% CO2 와 함께 37°C의 인큐베이터에 다시 넣습니다.
  9. 18일에서 45일 사이에 월요일, 수요일 및 금요일에 OMM으로 반 배지 변경(250μL)을 수행합니다.
  10. 45일에서 90일 사이에 월요일과 수요일에 OMM으로 절반 배지 변경(250μL)을 수행하고 금요일에 전체 배지 변경을 수행합니다.

2. 낭포성 SO에서 평면 SO로의 전환

참고: 낭포성 SO는 표피가 오가노이드의 중심을 향해 안쪽을 향하고 진피가 외부 환경과 접촉하는 거꾸로 된 형태를 나타냅니다. 70일에서 90일 사이에는 세포주와 분화 효율에 따라 표피의 초기 기저부 상부 분화가 잘 진행되어 헤어 페그가 발달합니다. 이것은 낭포성 SO가 ALI 배양 시스템으로 전환되어 천연 인간 피부와 더 유사한 조직을 얻는 단계입니다.

  1. 평면 SO로의 전환을 위한 70일과 90일 사이의 낭포성 SO 선택
    1. 직경이 5mm 이상이고 부산물 함량이 최소화된 낭포성 SO(낭종의 한 극에 축적되고 연골도 포함할 수 있는 중간엽 세포)를 선택합니다. 피부 오가노이드 발달의 품질 지표로 모발 플라코드/페그의 존재를 사용하십시오(그림 1A 및 그림 2B).
      참고: 크기에 따라 각 낭성 SO에서 2-4개의 평면 SO를 평평하게 만듭니다.
  2. 콜라겐 코팅 인서트(12웰 형식) 준비
    1. 증류수에 적당량의 NaOH 펠릿을 녹여 NaOH 용액(1M)을 준비합니다. 0.2μm 기공 크기의 멤브레인 필터를 사용하여 NaOH 용액을 필터 멸균합니다.
      알림: NaOH 용액(1M)을 조작할 때는 개인 보호 장비를 사용하고 환기가 잘 되는 곳에서 작업하십시오.
    2. 얼음 위에서 콜라겐 I 용액을 10x PBS(최종 1x 농도), NaOH(5mM) 및 증류수를 사용하여 최종 농도 2mg/mL로 희석하여 최종 부피를 조정합니다. 150μL의 콜라겐 용액을 표준 12웰 플레이트에 배치된 각 인서트에 분배합니다. 콜라겐 겔이 중합되도록 플레이트를 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 낭포성 SO의 평탄화(그림 3)
    알림: 이 단계에서는 LAF 후드 아래에 배치된 실체 현미경을 사용하십시오.
    1. 넓은 오리피스 P1000 피펫을 사용하여 소량의 배지와 함께 선택된 낭포성 SO를 10cm 페트리 접시의 뚜껑에 놓습니다. 멸균 메스를 사용하여 SO의 부산물을 조심스럽게 절제합니다. 반대쪽에 멸균 겸자를 사용하여 절제 중에 오가노이드를 안정화합니다(그림 3A).
      참고: 이 단계에서 낭포성 SO는 두 개의 피부 층이 서로 위에 위치한 수축된 풍선과 유사합니다.
    2. 메스를 사용하여 첫 번째 절개에 인접한 오가노이드의 끝에서 약 1mm를 절제합니다(그림 3B,F). 멸균 겸자를 사용하여 피부의 상층을 부드럽게 펼칩니다(그림 3C,G).
    3. 티슈 조각을 크기에 따라 2-4 조각으로 자릅니다. 각 조직 조각을 섬세하게 옮기고 멸균 겸자를 사용하여 표피가 위를 향하도록 콜라겐 코팅 인서트에 배치합니다(그림 3D,H).
      알림: 올바른 표피 방향을 보장하기 위해 실체 현미경으로 페그를 평가하십시오.
    4. 인서트를 600μL의 OMM이 들어 있는 표준 12웰 플레이트로 다시 옮깁니다. 플레이트를 5% CO2 로 37°C의 인큐베이터에 다시 넣습니다(그림 3E).
  4. 장기 공기-액체 계면 배양 유지 관리
    1. 평탄화 후 1일과 21일 사이에 월요일, 수요일 및 금요일에 OMM으로 전체 배지 변경(600μL)을 수행합니다. 플레이트를 5% CO2 및 95% 상대 습도의 37°C에서 인큐베이터에 다시 넣습니다.
    2. 평탄화 후 21일에서 27일 사이에 플레이트를 습도 없이 5% CO2 로 37°C의 인큐베이터에 넣어 피부 장벽을 강화합니다. 매일 OMM으로 전체 배지 변경(800μL)을 수행합니다.

결과

낭포성 SO 생성을 위한 최적화 및 체크포인트는 광범위하게 설명되었습니다14. 따라서 여기에 제시된 방법은 낭포성 오가노이드의 개발 중에 평가해야 할 주요 체크포인트(그림 2A), 평면 SO로의 전환에 적합한 것의 선택(그림 2B) 및 결과 평면 SO의 품질을 평가하는 데 사용되는 기준(그림 1B-D 및 그림 4).

낭포성 SO 개발의 첫 번째 핵심 단계는 0일에 웰에 존재하는 대부분의 세포를 통합하는 단일의 조밀한 세포 응집체의 형성입니다(그림 2A). 이는 효율적인 원심분리와 결합된 hiPSC의 신중하고 신속한 취급을 통해 달성되며, 그 결과 웰 중앙에 세포가 균질하게 분포됩니다(그림 2A, -2일). 표면 외배엽의 적절한 유도는 3일째까지 응집체의 가장 바깥층에 얇고 투명한 상피를 형성하고(그림 2A), 이는 중간엽 세포 유도 후 8일째까지 중간엽 세포의 어두운 코어를 포함하는 투명한 낭포성 응집체로 발달합니다. 12일에서 20일 사이에 상피 낭종은 낭종의 한 극에 축적되는 얇은 중간엽 세포층으로 덮이게 됩니다(그림 2A, 12일). 상피 세포와 중간엽 세포의 성공적인 공동 유도는 궁극적으로 층화된 상피를 초래하여 50일에서 80일 사이에 보이게 되는 모발 판과 못의 형성을 가능하게 합니다(그림 2A,B). 이러한 발달 체크포인트를 기반으로 적절한 SO를 선택함으로써 평면 SO로의 전환 시 형태학적 및 크기 변동성을 최소화할 수 있습니다.

모발 판자 또는 못의 존재는 평면 SO로의 추가 개발을 위해 낭포성 SO를 선택하기 위한 주요 포함 기준입니다. 눈에 보이는 판상의 부재는 일반적으로 표피 층화의 결함으로 인해 발생하며, 이는 매우 얇게 보입니다(그림 2B, 50일, 중간 패널). 편평화를 위해 부산물이 한 극에 집중되어 있고 전체적으로 부산물이 최소화된 큰 낭종(직경 5mm 이상)만 사용되며 분극되지 않은 부산물이 있는 낭종은 제외됩니다(그림 2B).

평면 구성에 들어가면 SO의 1차 품질 검사는 입체 현미경에서 HF 성장의 거시적 모니터링에 의존합니다. HF는 ALI 배양의 27일 동안 점진적으로 늘어나며, 피지선은 14일경에 보이게 되고 색소 침착은 시간이 지남에 따라 점차 증가합니다(그림 1B,C). 얇은 콜라겐 겔 바로 아래에 있는 인서트 멤브레인에 의해 부과되는 공간적 제약으로 인해 평면 SO의 주변에 위치한 HF만 완전히 성장할 수 있으며 인서트와 평행한 방향으로 성장합니다(그림 1C). 특히, 모간은 피부 표면 너머로 거의 돌출되지 않습니다. 개발된 평면 SO의 품질을 추가로 평가하기 위해 파라핀 또는 OCT에 포매하고 절편화하고 염색하여 구성과 형태를 검사할 수 있습니다. H&E 염색은 이들의 구조가 완전히 층화된 상피와 기저막으로 분리된 진피를 가진 인간 피부의 구조와 매우 유사하다는 것을 보여줍니다(그림 4A). 다양한 표피층, 피지선 및 멜라닌 세포에 대한 특정 마커를 사용한 면역형광 염색은 평면 SO의 인간 피부와 유사한 조직 구조를 추가로 확인합니다(그림 1D 및 그림 4B).

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그림 1: ALI 배양 시스템을 사용하여 hiPSC에서 HF를 포함하는 평면 SO를 생성하는 워크플로. 주요 단계의 개략적 표현과 대표 이미지가 표시됩니다. (A) 본질적으로 이전에 설명한10과 같이 80일경에 눈에 보이는 모발 판자/못이 형성될 때까지 낭포성 SO의 생성. (B) 낭포성 SO는 I형 콜라겐 코팅 세포 배양 삽입물에서 표피면이 위를 향하도록 절개 및 평평합니다. ALI 배양은 가습 조건에서 21일 동안 유지된 후 건조한 조건에서 6일 동안 유지됩니다. (C) (B)에 표시된 영역의 고배율 보기로, 모낭 성장, 피지선 유사 구조 발달(화살촉) 및 시간 경과에 따른 점진적인 색소 침착을 보여줍니다. (D) 피지선 유사 구조를 표시하는 나일 레드 또는 멜라닌 세포를 염색하는 항-PMEL 항체와 함께 항형 IV 콜라겐 항체로 표지된 평탄화 후 27일째에 평면 SO 절편의 공초점 이미지. 핵은 DAPI로 대조염색됩니다. 스케일 바: 200μm (A); 500 μm (B, C); 50 μm (D)입니다. 약어: SO = 피부 오가노이드; HF = 모낭; hiPSC = 인간 유도만능줄기세포; ALI = 공기-액체 인터페이스; Col IV = IV형 콜라겐; PMEL = 프레멜라나좀 단백질; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: SO 생산 중 주요 단계에서 세포 응집체 형태의 대표적인 이미지. (A) 서로 다른 단계에서 적절한(왼쪽 패널) 및 부적절한(중간 및 오른쪽 패널) 형태를 갖는 낭포성 SO의 대표 이미지. -2일째에 세포 응집체는 균일한 분포를 나타내야 하는 반면 (왼쪽 패널), 원심분리 후 부적절한 플레이트 취급은 세포 분포를 방해할 수 있습니다 (오른쪽 패널). 0일째에 잘 형성된 응집체는 조밀하고 조밀한 세포 클러스터로 나타나며 (왼쪽 패널), 낮은 세포 생존력은 광범위한 세포 사멸과 조밀한 3D 구조의 손실을 초래합니다 (오른쪽 패널). 3일째에 뚜렷한 외부 상피층이 보이게 되 고(왼쪽 패널), 부재는 BMP4 농도에 최적화가 필요함을 나타낼 수 있습니다 (오른쪽 패널). 12일째에 중간엽 세포는 한 극에 축적되어 상피 낭종 (왼쪽 패널)을 감싸기 위해 이동하는 반면, 과도한 상피(중간 패널) 또는 중간엽(오른쪽 패널) 분화는 적절한 상피 계층화를 방해합니다. 50일째에 SO는 한쪽에는 낭성 피부가 있고 다른 쪽에는 주로 연골과 같은 부산물이 있는 양극성 형태를 나타냅니다 (왼쪽 패널). 과도한 상피(중간 패널) 또는 중간엽(오른쪽 패널) 분화는 적절한 피부 발달을 방해합니다. (B) 약 80일에 눈에 보이는 헤어 페그가 있는 낭포성 SO의 대표 이미지. 피부에 대한 부산물의 다양한 비율(점선 왼쪽)에 주목하십시오. 가장 왼쪽에 있는 3개의 패널은 2-4개의 평면 SO를 생성할 수 있는 반면, 가장 오른쪽 패널은 평탄화에 품질이 충분하지 않은 SO를 보여줍니다. 스케일 바: -2일, 50일 및 80일째 500μm; 0일, 3일 및 12일째 200μm. 약어: SO = 피부 오가노이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 평면 SO를 생산하기 위한 기술 단계의 개략도. LAF 후드 내의 실체 현미경으로 낭포성 SO의 평탄화를 수행합니다. (A) 멸균 메스를 사용하여 낭포성 SO에서 축적된 부산물을 극을 절제합니다. (B) 조직 전개를 용이하게 하기 위해 SO의 상지와 하지를 다듬습니다. (C) 평면 조직을 2-4 조각으로 자릅니다. 멸균 겸자를 사용하여 각 조각을 표피면이 위로 향하게 하여 콜라겐 코팅 인서트에 옮기고 평평하게 만듭니다. (D) 평평한 조직이 포함된 배양 삽입물을 600μL의 배지가 들어 있는 표준 12웰 플레이트에 넣습니다. (E) 플레이트를 37°C에서 5%CO2와 함께 배양합니다. (F) (B)에 묘사된 피부 오가노이드의 개략적인 횡단도. (G) (C)에 묘사된 피부 오가노이드의 개략적인 횡단도. (H) 600μL의 배지를 포함하는 12웰 플레이트에 위치한 세포 배양 인서트에 부어진 I형 콜라겐 겔에 배치된 평면 SO의 이미지. 약어: SO = 피부 오가노이드; LAF = 층류 공기 흐름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: hiPSC 유래 평면 SO의 특성화. (A) 평탄화 후 1일 및 27일째에 H&E-염색된 평면 SO의 대표적인 명시야 이미지. 27일째까지 평면 SO는 다층화된 표피와 피지선 유사 구조(화살촉)를 포함하는 HF로 피부 성숙을 보여줍니다. (B) 항-β4 인테그린 및 항-케라틴 10 또는 항-로리크린 항체로 염색된 평면 SO 절편의 공초점 이미지는 1일째에 초기 기저부 분화(KRT10+ 세포) 및 27일째에 후기 분화(LOR+ 층)를 보여줍니다. 핵은 DAPI로 대조염색됩니다. 스케일 바: 50μm (A); 100 μm (B). 약어: SO = 피부 오가노이드; hiPSC = 인간 유도만능줄기세포; H&E = 헤마트실린 및 에오신; β4 = b4 인테그린; KRT10 = 케라틴 10; LOR = 로리크린; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 설명된 프로토콜은 조직 평탄화 및 정점 표피의 공기 노출을 통해 천연 조직 방향 및 환경을 복원함으로써 낭포성 SO 시스템의 주요 한계를 극복합니다. 이 방법은 오가노이드의 고유한 세포 및 구조적 복잡성을 보존하고, 생리학적으로 관련된 조직을 촉진하며, 실험 조작을 위해 다층화된 표피 표면에 대한 직접적인 접근을 제공합니다.

프로토콜의 여러 단계는 고품질 낭포성 SO의 생성부터 시작하여 고품질 평면 SO를 달성하는 데 중요합니다. 주요 품질 관리 검사 및 잠재적인 프로토콜 수정 지점은12 이전에 광범위하게 설명되었습니다. 간단히 말해서, 시작점은 70-80% 컨플루언스에서 잘 유지되고 미분화된 hiPSC 배양이어야 하며, 높은 핵-세포질 비율로 촘촘하게 채워진 세포를 나타내야 합니다. 낭포성 SO의 생성은 표면 외배엽 유도 동안 BMP4 신호의 정확한 조절이 필요합니다12. BMP4 민감도는 hiPSC 라인마다 다를 수 있으므로 최적의 결과를 위해 적정이 필요할 수 있습니다. 이 범위를 벗어난 성공적인 사례가 보고되지 않았으므로 2.5에서 15ng/mL 사이의 BMP4 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. 시약 공급원의 일관성도 중요합니다. 따라서 단일 공급업체의 대량 재고는 권장 조건으로 준비 및 보관하고 유통기한이 만료되기 전에 사용하여 완전한 생물학적 활성을 보장하고 변동성을 최소화해야 합니다.

적절한 형태와 크기를 가진 낭포성 SO를 선택하는 것은 성공적인 SO 평탄화에 매우 중요합니다. 낭포성 SO의 성숙과 그에 따른 못 및 모발 판자의 형성은 hiPSC 계통마다 다를 수 있으므로 평탄화 시기는 70일에서 90일까지 다양할 수 있습니다. 낭포성 SO 형성 3일째에 GSK3 억제제 및 WNT 신호 작용제인 CHIR99021의 추가는 증식을 촉진하고 신경능선 이동을 억제함으로써 오가노이드 크기를 증가시키고 연골 형성을 감소시키는 것으로 나타났기 때문에 고려될 수 있습니다12. 유망하기는 하지만 우리 배양에서 이러한 변형에 대한 일관된 결과를 관찰하지 못했습니다.

평탄화 과정에는 손재주와 조직에 대한 친숙함이 필요합니다. 특히, 피부 조각을 코팅된 인서트로 옮기는 동안 올바른 조직 방향을 보장하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 실체현미경 아래에서 미세한 겸자를 사용하여 방향을 확인하고 정점이 위쪽을 향할 때까지 조직을 부드럽게 조정하는 것이 좋습니다. 적절하게 배치되면 못/헤어 플래코드가 아래를 향해야 합니다. 평면 SO를 ALI 배양으로 옮긴 후, HF는 일반적으로 며칠 내에 눈에 띄는 성장과 모간 색소 침착을 보이기 시작합니다.

설명된 모델의 주요 한계는 필요한 시간과 높은 수준의 유지 관리, 모델의 미성숙성입니다. 헤어 페그가 부여된 낭포성 SO의 발달은 70일에서 90일이 소요되며 이후 4주간의 ALI 배양이 이어집니다. 힘든 평탄화 절차와 결합된 이러한 연장된 일정으로 인해 시스템은 특히 상업적으로 이용 가능한 인간 피부 등가물에 비해 처리량이 많은 응용 분야에 적합하지 않습니다. 사소한 최적화로 배양 시간이 약간 단축될 수 있지만 크게 단축될 가능성은 거의 없습니다. 피부의 높은 세포 및 구조적 다양성은 상피-중간엽 상호 작용 및 기계적 단서의 복잡한 시퀀스에 의존하며, 이는 시험관 내에서 외인성 인자를 추가하여 가속화될 수 없을 가능성이 높습니다 15,16,17,18. 낭포성 SO의 형성과 평면 형태로의 진행에는 높은 수준의 유지 관리가 필요합니다. 낭포성 배양의 처음 18일을 제외하고 가장 취급 집약적인 기간 중 하나는 평면 SO가 습도가 낮은 분위기에서 유지되고 매일 배지 보충이 필요할 때 발생합니다. 다른 hiPSC 유래 모델과 유사하게 SO는 시험관 내에서 태아와 유사한 표현형을 유지합니다. 또한, 땀샘과 기립근 필리근은 SO14에 거의 없으며, 이는 혈관 형성, 면역 세포 및 전단 응력, 스트레칭 및 마찰과 같은 기계적 힘의 부족으로 인해 발생할 수 있습니다15,16,17,18,19. 이러한 제한 사항 중 일부는 모델의 복잡성을 증가시켜 해결할 수 있습니다. 자가 hiPSC 유래 대식세포와의 공동 배양17, 관류 시스템의 통합9 또는 기계적 스트레칭17의 적용은 모델 성숙도를 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다20,21.

트랜스웰 삽입 형식은 평면 SO에서 HF의 하향 성장을 다소 제한한다는 점에 유의해야 합니다. 결과적으로 HF는 측면으로 퍼지는 경향이 있으며 공기에 노출될 수 있습니다. HF는 일반적으로 생체 내 피부 내에서 보호되기 때문에 실험을 설계할 때 이를 고려해야 합니다. 더 두꺼운 하이드로겔 층을 적용하여 인서트 코팅을 수정하면 이 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 이 모델에서는 모간이 피부 표면 너머로 거의 돌출되지 않습니다. 우리의 관찰에 따르면 평면 SO의 HF는 ALI 배양 27일까지 활성 성장 단계인 성장기에 남아 있습니다. 인간 HF에서 성장기의 지속 기간이 길어진다는 점을 감안할 때 이는 완전히 예상치 못한 일이 아닙니다. 장기 배양이 결국 상전이를 지원할 수 있지만 전신적 단서가 없는 경우에는 그럴 가능성이 낮습니다. 난포 순환에 필요한 분자 신호를 식별하고 보완하면 퇴행기 및 휴지기의 인위적인 유도가 가능할 수 있습니다.

요약하면, 평면 SO를 생성하는 프로토콜은 낭포성 SO에서 실현 가능하지 않거나 관련이 없는 광범위한 실험적 접근을 가능하게 합니다. 평면 SO는 이미 박테리아11 및 바이러스 감염22, 자외선 유발 조직 손상22 및 관련 약물 반응12,22,23을 모델링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 생리학적으로 관련성이 있고 복잡한 피부 등가물의 정점 표면에 접근할 수 있는 능력은 이 분야의 상당한 발전을 나타내며 피부 연구에서 다양하고 새로운 응용 분야의 문을 열어줍니다.

공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

hiPSC 라인을 제공해주신 라이덴 대학 의료 센터의 hiPSC 호텔 동료들에게 감사드립니다. 이 작업은 덴마크 노보 노르디스크 재단(보조금 번호 NNF21CC0073729)이 KR에 지원하는 노보 노르디스크 재단 줄기세포 의학 센터의 지원을 받았습니다. KR은 INSERM(Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)의 주관입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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2-머캅토에탄올써모피셔 사이언티브#21985023유해 물질, 독성, 부식성, 자극성, 건강 및 환경 위험.
나오머 크#567530-250MG유해하고 부식성 있으며 자극적인 물질입니다. 즉석에서 해결책을 준비하세요.
신경기저 매질써모피셔 사이언티브#21103049신경 기저 매체라고 불립니다. 본문에서.
노르모신 50 mg/ml인비보젠#ant-nr-1검사에서는 항생제-항균 보충제라고 부릅니다. 알리코트, -20 & deg에 저장; C 앤 nbsp; 4도 & 도(4도) 유지 최대 14일간 C를 복용하며;
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핀셋머 크#T4537-1EA스타일 5; 미세한 바늘처럼 날카롭고 자성 방지 스테인리스 스틸
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