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방법 논문

SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

1.1K 조회수

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DOI:

10.3791/69094

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2025년 10월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

이 논문에서

요약

여기에서는 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 후속 사용을 위해 광시야 현미경 이미지에서 개별 웜의 자동 분할을 위해 개발한 딥 러닝 시스템인 SegElegans를 효과적으로 활용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 온라인과 오프라인 모두에서 시스템을 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

초록

현미경, 특히 형광 종류의 현미경은 C. elegans 연구에서 자주 사용되는 도구입니다. 그러나 현미경 실험의 데이터 분석은 매우 지루하고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 따라서 자동화가 바람직합니다. 우리는 많은 수의 개체가 접촉하거나 겹치는 이미지에서도 웜의 자동 분할을 위해 특별히 설계된 양두 U-net 기반 컨볼루션 신경망 시스템인 SegElegans를 개발했습니다. SegElegans의 첫 번째 부분은 하나의 인코더와 두 개의 디코더로 구성됩니다. SmaAt AT 모델을 기반으로 하는 인코더는 이중 컨볼루션 레이어와 CBAM(Convolutional Block Attention Module)을 적용합니다. 두 디코더 모두 컨볼루션 LSTM을 사용하며, 하나는 웜 이미지(몸체, 가장자리, 배경 또는 겹침)의 의미론적 분할을 수행하고 다른 하나는 각 웜을 따라 선형 골격을 추출합니다. 두 번째 부분은 두 디코더의 출력을 결합하고 이를 사용하여 정확한 인스턴스 분할을 생성하는 후처리 알고리즘입니다. 그런 다음 이러한 분할을 ImageJ 또는 기타 적절한 이미지 분석 도구에 공급할 수 있습니다. 여기에서는 이 시스템에 액세스하고 실행하는 방법에 대한 지침을 제시합니다. 우리는 온라인 클라우드 컴퓨팅 기반 구현과 필요한 하드웨어를 사용할 수 있는 경우 로컬 시스템에서 SegElegans 모델을 오프라인으로 사용하는 두 가지 방법을 제공합니다.

서론

Caenorhabditis elegans는 세포 및 분자 생물학 분야에서 널리 사용되는 진핵 모델 유기체입니다 1,2,3. 그것은 빠른 수명 주기(~3주)와 많은 수의 자손(일반적으로 자가 수정 자웅동체 부모와 유전적으로 동일함)을 가진 작은(야생형 성체의 경우 ~1mm) 토양 생활 선충류 벌레입니다. 상대적인 단순함에도 불구하고 동물은 여전히 정의되고 뚜렷한 조직과 기관을 가진 복잡한 다세포 유기체이며, 작은 크기와 투명성 덕분에 고정이나 기타 침습적 치료 없이 생체 내에서 연구할 수 있습니다4. 현미경을 통한 생체 내 연구를 위한 웜의 능력은 개별 세포의 쉽게 구별하거나 미토콘드리아, 지질 방울 또는 단백질 응집체와 같은 세포하 소기관/구성 요소의 직접 시각화를 허용하는 형광 리포터의 사용을 통해 더욱 증폭될 수 있으며, 신호 전달, 유전자 발현, 소포 융합과 같은 과정, 자가포식, 신경 및 근육 활동 전위 등5,6,7,8,9,10,11. 또한, 선충은 돌연변이 유발12, 미세 주입 또는 미세입자 폭격을 통한 형질전환13, CRISPR 편집14, 그리고 가장 중요한 것은 쉽고 비용 효율적인 유전자 스크리닝과 관련하여 RNAi15를 통한 유전자 조작에 매우 적합합니다. 이 조작은 선충 자체에서 유전자와 그 역할에 대한 광범위한 연구를 가능하게 하는 동시에 C. elegans가 다른 모델 유기체에 나타내는 중요한 유전적 상동성 덕분에 인간과 관련된 기초적인 발견을 합니다16,17. 마지막으로, 이러한 상동성/보존은 또한 웜을 약물 및 화학 작용제에 대한 이상적인 초기 테스트 장소로 만들어 약물 활성의 메커니즘을 밝히고, 잠재적인 활성 수정 유전적 변이를 식별하고, 잠재적인 원치 않는 상호 작용 및 표적 이탈 효과의 발견을 가능하게 합니다 18,19,20.

위에서 언급한 모든 장점으로 인해 C. elegans는 세포 및 분자 생물학 연구, 특히 현미경을 통한 생체 내 및 종종 실시간 모니터링에 관심이 있는 과학자들에게 매력적인 모델이 되었습니다. 이러한 연구에는 일반적으로 특수 소프트웨어를 통한 상당한 양의 이미지 분석이 포함되며 가장 널리 사용되는 옵션은 ImageJ 21,22,23입니다. 이러한 소프트웨어를 통한 분석의 공통된 특징은 사용자/연구원이 선택 도구를 사용하여 분석을 위해 관심 영역(ROI)을 지정해야 한다는 것입니다. 매우 자주, 이미지의 각 개별 웜은 단순한 형태학적 특징(예: 신체 치수) 또는 유전자의 발현 수준(형광 리포터로 측정), 비율 리포터의 판독값, 지질 방울의 수 및 크기, 단백질 응집체의 형성, 개별 소기관 및 네트워크 등의 형태 5,8,10,24,25,26,27. 표준 이미지 처리 알고리즘을 기반으로 하는 자동 선택 방법은 일반적으로 웜의 모양과 특징을 구별할 수 충분하지 않기 때문에, 특히 웜의 윤곽이 명확하게 보이지 않는 암시야 이미지 또는 접촉하고 겹치는 상당한 수의 동물이 있는 명시야 이미지에서 이러한 웜별 선택은 일반적으로 수동으로 이루어집니다. 그러나 수동 프로세스는 느리고(필요한 정밀도와 사용자 경험에 따라 웜당 20초에서 1분) 힘들며 사용자 편향 및 오류가 발생할 수 있습니다.

개별 C. elegans ROI 생성을 위한 대안적이고 훨씬 더 강력한 접근 방식(일반적으로 컴퓨터 비전 분야에서 세분화라고 하는 작업)은 딥 러닝/신경망 기술의 도움으로 이를 자동화하는 것입니다. 주로 마스크 R-CNN(28) 및 U-net 아키텍처(29)를 기반으로 하는 컨볼루션 신경망은 C. elegans 33,34,35,36,37,38,39를 포함하여 다양한 생물학적 모델 시스템(30,31,32)에 대한 분할 작업에서 적절한 결과를 생성했습니다 그러나 많은 수의 접촉 또는 완전히 겹치는 벌레가 있는 고해상도 이미지에서 개별 동물을 올바르게 구별하는 전신 분할(인스턴스 분할)을 생성하는 문제에 대한 만족스러운 솔루션을 제공한 것은 없습니다. 이러한 요구를 충족시키기 위해 우리는 이 작업을 위해 특별히 설계되고 최적화된 딥 러닝 모델인 SegElegans를 개발했습니다40.

SegElegans는 두 가지 주요 부분으로 구성됩니다(그림 1). 첫 번째 부분은 두 개의 머리 U-net 변형 컨볼루션 신경망입니다. 하나의 인코더 블록과 두 개의 디코더 블록으로 구성됩니다. 인코더 블록은 SmaAt AT 모델(41 )을 기반으로 하며 컨볼루션 블록 어텐션 모듈(CBAM)42에 공급되는 각 레이어에 대해 이중 컨볼루션 블록을 사용합니다. 두 디코더 블록은 컨볼루션 장단기 기억(LSTM) 네트워크(43)를 기반으로 한다. 하나의 디코더는 이미지의 각 픽셀을 웜 본체의 일부, 웜 가장자리의 일부, 배경의 일부 또는 웜이 겹치는 영역의 일부로 분류하는 역할을 합니다(일반적으로 의미론적 분할이라고 함). 다른 디코더는 각 웜의 길이를 따라 선형 "골격"을 그리는 역할을 합니다. 두 번째 부분은 두 디코더의 출력을 결합하고 이를 사용하여 정확한 인스턴스 분할을 생성하는 후처리 알고리즘입니다. 처음에는 의미론적 분할 출력을 스켈레톤 출력과 비교하여 실제 중첩 세그먼트를 식별합니다. 그런 다음 겹치지 않는 웜에 대해 직접 또는 겹치는 웜에 대한 세그먼트로부터 조립하여 인스턴스 분할을 출력합니다(40). 이러한 세분화는 바이너리 마스크와 ImageJ 호환 ROI로 저장됩니다.

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프로토콜

다음 섹션에는 SegElegans를 효과적으로 사용하는 방법에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다(그림 2). 여기에는 준비 이미지 획득(섹션 1), 모델을 온라인으로 실행하는 방법(섹션 2) 또는 오프라인(섹션 3-5), ROI를 ImageJ 또는 기타 도구로 가져오기(섹션 6)에 대한 지침이 포함됩니다. 모델을 통해 이미지를 평가하려면 최소 6GB(이상적으로는 그 이상)의 비디오 랜덤 액세스 메모리(VRAM)가 있는 CUDA 호환 그래픽 처리 장치(GPU)가 장착된 PC가 필요하므로 대부분의 사용자(Google 서비스에 액세스할 수 있는 경우)는 클라우드 컴퓨팅을 통해 이러한 하드웨어 요구 사항을 충족하고 능가하는 모델의 온라인 버전을 활용하는 것이 좋습니다(섹션 1 > 섹션 2 > 섹션 6). 또는 적절하게 강력한 하드웨어에 액세스할 수 있고 명령줄/터미널 사용에 대한 기본적인 이해가 있는 사용자(또는 앞서 언급한 클라우드 컴퓨팅 옵션에 액세스할 수 없는 사용자)는 모델을 로컬에서 실행하는 것이 더 편리할 수 있습니다(섹션 1 > 섹션 3 > 섹션 4 또는 5 > 섹션 6).

1. 샘플 및 가이드 이미지 획득

  1. SegElegans를 사용하여 발현 여부에 관계없이 모든 벌레 균주에서 성충 벌레의 분할을 획득합니다. 관심 있는 표현형/데이터가 명시야 이미지에서 측정되는 경우 4x 또는 유사한 대물 렌즈를 사용하여 광시야 현미경 및 호환 소프트웨어를 사용하여 정상적으로 획득합니다.
    참고: SegElegans는 광범위한 밝기와 대비로 이미지를 분석할 수 있지만 포화된 밝거나 어두운 픽셀이 없는 것이 좋습니다. 치수와 관련하여 시스템은 1328 x 1048 이미지로 학습되었지만 크기가 512x512 이상인 모든 이미지에서 작동해야 합니다.
  2. 관심 있는 표현형/데이터가 암시야 이미지에서 측정되는 경우(하나 이상의 형질전환 형광 리포터 또는 염료를 사용할 때 일반적임) 가이드 이미지로 사용할 데이터와 함께 명시야 이미지를 획득합니다(단계 1.1에 설명된 대로). 가이드 이미지가 형광 채널의 암시야 이미지와 공간적으로 완벽하게 일치하는지 확인하고 시간적으로는 현미경의 운영 소프트웨어에서 제공하는 다중 채널 획득 옵션을 사용하여 가능한 한 가깝게 일치하는지 확인합니다. 가이드 이미지를 해당 암시야 데이터 이미지와 별도의 폴더에 저장하고 둘 다 동일한 이름을 사용합니다.

2. SegElegans 온라인 버전 실행

  1. 웹 브라우저에서 Google 계정에 로그인합니다. 이를 위해 새 전용 랩 계정을 만드는 것이 좋습니다.
  2. Google 드라이브(https://drive.google.com)에 들어가 명시야 이미지(데이터 또는 가이드)가 있는 폴더를 업로드합니다. 앞서 언급했듯이 가이드 이미지를 사용하여 암시야 이미지에 대한 ROI를 생성하는 경우 이 폴더에 해당 암시야 데이터 이미지를 포함하지 마십시오.
  3. https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 로 이동하여 SegElegans Body Prediction Interface.ipynb 파일을 클릭합니다. 열리는 파일 상단의 Colab에서 열기 버튼을 클릭합니다. SegElegans용 Jupyter 노트북/인터페이스가 Google Colab에서 열립니다.
  4. 제목 아래의 재생(figure-protocol-1) 버튼을 눌러 코드 블록 1을 실행합니다. 실행이 끝난 후 코드를 실행하고 출력을 관찰할 수 있는 런타임 권한을 부여합니다(재생 단추 옆에 녹색 확인 표시가 표시됨). Colab은 올바른 CUDA 호환 런타임을 자동으로 실행하고 NVIDIA-SMI 출력 테이블을 표시해야 합니다. 그렇지 않으면 런타임 > 런타임 유형 변경 메뉴를 통해 T4 GPU 런타임을 강제로 사용합니다.
  5. 코드 블록 2를 실행하여 Google 드라이브의 콘텐츠를 런타임에 로드합니다. 모든 확인 대화를 수락하고 요청된 모든 권한을 부여합니다.
  6. 코드 블록 3을 실행한 다음 4를 실행합니다. 블록 3을 완료하는 데 몇 분 정도 걸리므로 4로 진행하기 전에 녹색 확인 표시가 나타나는지 확인하십시오.
  7. Colab 인터페이스 왼쪽에 있는 폴더 탭이 있는 아이콘을 엽니다. 그러면 드라이브에서 가져온 콘텐츠를 포함하여 런타임에 로드된 파일이 / content/drive/MyDrive로 표시됩니다. 이미지가 있는 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 경로를 복사한 다음 코드 블록 5의 test_images 입력 양식에 붙여넣습니다. /content/drive/MyDrive/Image폴더와 같은지 확인합니다. 마찬가지로 분석 출력의 경로(예: /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output)를 지정합니다. 이 환경의 경로는 슬래시를 사용하여 폴더(/)를 구분합니다.
  8. 코드 블록 5를 실행합니다.
  9. 제공된 코드 블록 6 형식으로 모델에서 분석할 이미지의 정확한 확장자를 지정합니다. 이 입력의 목적을 위해 ".tif", ". TIF"와 ".tiff"는 서로 다른 확장으로 처리됩니다.
  10. 시스템이 기본 T4 GPU 런타임(사용량 수준에 따라 하루에 제한된 시간 동안 모든 사용자에게 무료로 제공됨)에서 실행 중인 경우 코드 블록 6의 batch_crop_img 입력을 조정하지 마십시오. 런타임에서 메모리 가용성 문제가 발생하는 경우 줄입니다.
  11. 코드 블록 6을 실행합니다. 시간이 좀 걸리므로 계속하기 전에 녹색 확인 표시가 나타나는지 확인하십시오.
  12. 코드 블록 7을 실행합니다. 기본 T4 런타임에 대한 입력을 조정하지 말고 메모리 가용성 문제가 발생하는 경우 하위 프로세스 수를 줄이거나 병렬 처리를 완전히 사용하지 않도록 설정합니다. 이 또한 상당한 시간이 걸립니다.
  13. 다른 브라우저 창이나 탭에서 Google 드라이브에 액세스하고 2.7에서 지정한 출력 폴더로 이동합니다.
    참고: 이 시점에서 SegElegans는 세분화의 초기 평가 및 사후 처리를 완료하고 출력이 포함된 여러 하위 폴더를 만들었습니다. 0_summary 결과 에는 각 이미지의 출력을 요약한 그래프와 각 웜에 할당된 인덱스 번호가 포함되어 있습니다. 1_complete_mask 에는 알고리즘이 분석에 적합하다고 결정한 모든 세분화에 대해 선별된 이진 마스크가 포함되어 있습니다. 1_edge_small_mask 에는 동물이 너무 작거나 이미지 가장자리에서 부분적으로 가려져 있기 때문에 알고리즘이 거부하기로 결정한 모든 분할에 대한 이진 마스크가 포함되어 있습니다. 1_overlap_mask 에는 실제 겹침을 나타낸 웜의 모든 분할에 대한 이진 마스크가 포함되어 있으며 기본적으로 큐레이팅된 출력에 추가되지 않습니다. 1_all_rois_results 에는 큐레이션에 관계없이 ImageJ 형식(ROI가 있는 zip 파일)의 3가지 유형 모두의 세분화가 포함되어 있습니다.
  14. 이 시점에서 다음 세 가지 옵션 중 하나를 선택합니다.
    1. ImageJ의 1_all_rois_results 에서 제공된 ROI를 사용하고 가져온 후 원치 않는 ROI를 거부합니다(프로토콜 섹션 6 참조).
    2. 수동 수정 없이(그리고 겹치는 벌레를 포함하지 않고) 선별된 좋은 마스크를 수락합니다(2.16으로 건너뛰기).
    3. 출력에 포함할 웜(겹치는 웜 포함)을 선택하여 큐레이션을 수동으로 조정합니다(2.15로 계속).
  15. 큐레이션을 수동으로 조정하려면 코드 블록 8을 사용합니다. 0_summary 결과 폴더의 요약 그래프에서 초기 큐레이션 결과를 검사합니다. 수정이 필요한 각 이미지에 대해 원본 입력 이미지의 전체 이름(확장자 포함)을 "name_image_change" 형식으로 입력하고 보관할 마스크의 번호(요약 그래프에서)를 "index_images" 형식으로 쉼표로 구분하여 입력합니다. 코드 블록 8을 실행합니다. 수정이 필요한 다른 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다.
  16. 수정 후 또는 사용자가 수정 없이(및 겹치는 웜 없이) 초기 큐레이션을 수락하기로 선택한 경우 코드 블록 9를 실행합니다. Google 드라이브의 출력 폴더에 2_curated_rois_results라는 새 하위 폴더가 생성됩니다. 여기에는 ImageJ 형식(ROI가 있는 zip 파일)의 모든 최종 선별된 세분화가 포함됩니다.
  17. 다른 이미지 폴더에 대해 프로세스를 다시 실행하려면 런타임 > 세션 다시 시작 메뉴를 통해 런타임을 재설정하고 처음부터 다시 시작합니다.

3. 처음 사용하기 전에 SegElegans의 오프라인 버전 준비

  1. Colab에서 온라인으로 SegElegans를 실행하는 대신 Google의 클라우드 컴퓨팅 서비스를 사용할 수 없거나 사용하지 않으려는 사용자는 SegElegans의 오프라인 버전을 사용할 수 있습니다. 이를 위해서는 최소 6GB의 VRAM이 있는 CUDA 호환 GPU(https://developer.nvidia.com/cuda-gpus)가 있는 PC(Windows 또는 Linux)가 필요합니다(사용 가능하고 저렴한 경우 16개를 권장함).
    참고: 섹션 3-5의 다음 지침은 Windows에 중점을 두고 있지만 사용된 명령을 약간 변경하여 Linux 기반 시스템에서도 소프트웨어를 실행할 수 있습니다.
  2. 지침에 따라 https://developer.nvidia.com/cuda-downloads 에서 CUDA 툴킷 설치 프로그램을 다운로드하여 사용하는 장치에 적합한 버전을 가져옵니다.
    참고: SegElegans는 툴킷 버전 12.9 및 13.0과 Windows의 CUDA 버전 11에서 테스트되었지만 향후 버전에서는 이전 버전과의 호환성이 유지될 것으로 예상됩니다.
    1. 설치 프로그램 자체의 지침에 따라 툴킷을 설치합니다. Visual Studio는 필요하지 않습니다.
  3. https://www.python.org/downloads/ 에서 디바이스에 적합한 버전의 Python 설치 프로그램을 다운로드합니다. 설치 프로그램 자체의 지침에 따라 Python을 설치하고 python.exe가 PATH에 추가되었는지 확인합니다.
    참고: SegElegans는 Python 3.13에서 빌드 및 테스트되었지만 향후 버전에서는 이전 버전과의 호환성이 유지될 것으로 예상됩니다.
  4. https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 로 이동합니다. 소스 코드(zip) 링크를 클릭하여 SegElegans를 로컬로 설정하고 실행하는 데 필요한 파일이 포함된 패키지를 다운로드합니다.
  5. zip 파일의 압축을 풉니다. C:\SegElegans와 같은 상위 또는 최상위 폴더에 배치합니다. zip 파일의 내용은 이미 하위 폴더 SegElegansOffline-1 안에 있습니다.
  6. Windows 명령 프롬프트(cmd.exe)를 엽니다. python -m venv "fullsegeleganspath" 명령을 입력하십시오. 여기서 "fullsegeleganspath"는 SegElegansOffline-1 하위 폴더의 따옴표로 묶인 전체 경로입니다.
    참고: 예를 들어 zip 파일이 C:\SegElegans에서 추출된 경우 전체 경로는 C:\SegElegans\SegElegansOffline-1이고 명령은 python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1"입니다. 이 환경의 경로는 백슬래시를 사용하여 폴더("\")를 구분합니다.
  7. 명령 프롬프트에서 표준 컨트롤을 사용하여 SegElegansOffline-1 폴더 내부를 탐색하고 Scripts\activate 명령을 실행합니다. (SegElegansOffline-1) 레이블이 다음 프롬프트 커서 앞에 나타나 Python 환경이 이제 활성 상태임을 나타냅니다.
  8. 활성(SegElegansOffline-1) 환경 내에서 pip install -r requirements.txt 명령을 실행합니다. 이 과정은 다소 시간이 걸립니다.
  9. python assemblenetworks.py 명령을 입력하고 실행합니다.
    참고: 이제 SegElegans를 실행할 준비가 되었습니다. 이를 달성하는 두 가지 방법이 제공됩니다: 큐레이션을 수동으로 수정하는 옵션 없이 모든 세분화를 ImageJ ROI로 자동으로 제공하는 빠른 스크립트(섹션 4)와 큐레이션을 개요하고 수정하는 옵션을 제공하는 로컬 Jupyter 노트북(섹션 5)입니다. 후자의 접근 방식은 대부분의 사용자에게 권장됩니다.

4. 빠른 스크립트로 SegElegans의 오프라인 버전 실행

  1. Windows 명령 프롬프트(cmd.exe)를 엽니다. 3.7단계에서 설명한 대로 SegElegans 환경 폴더로 이동하여 활성화합니다.
  2. 빠른 스크립트를 사용하려면 활성 (SegElegansOffline-1) 환경이 있는 명령 프롬프트에서 명령 python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x <파일 확장자> 명령을 실행합니다. 여기서 "pathtoinputfolder"는 명시야 이미지가 있는 폴더의 전체 경로(예: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1")이고 <파일 확장자>는 사용자가 분석하려는 이미지의 정확한 파일 확장자입니다(예: "). TIF")를 사용합니다. 장치가 처리할 수 있는 경우 스크립트에 의한 처리를 가속화하기 위해 변경할 수 있는 추가 매개 변수에 대한 지침을 보려면 python SegElegansBodyQuickEval.py -h 명령을 입력합니다.
    참고: 이 경우 출력 폴더는 입력 폴더 내에 생성됩니다(위의 예에서는 "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). 내부에는 일련의 하위 폴더가 있습니다. 0_summary 결과 에는 각 이미지의 출력을 요약하는 그래프가 포함되어 있으며 각 웜에 할당된 인덱스 번호가 있습니다. 1_complete_mask 에는 알고리즘이 분석에 적합하다고 결정한 모든 겹치지 않는 세그멘테이션에 대해 선별된 이진 마스크가 포함되어 있습니다. 1_edge_small_mask 에는 동물이 너무 작거나 이미지 가장자리에서 부분적으로 가려져 있기 때문에 알고리즘이 거부하기로 결정한 모든 분할에 대한 이진 마스크가 포함되어 있습니다. 1_overlap_mask 에는 실제 겹침을 나타낸 웜의 모든 분할에 대한 이진 마스크가 포함되어 있습니다. 1_all_rois_results 에는 큐레이션에 관계없이 ImageJ 형식(ROI가 있는 zip 파일)의 3가지 유형 모두의 세분화가 포함되어 있습니다. 여기에서 큐레이션을 수동으로 수정할 수 있는 방법이 없기 때문에 2_curated_rois_results기본적으로 알고리즘에서 양호한 것으로 간주되는 모든 세그멘테이션과 ImageJ 형식의 모든 겹치는 세그멘테이션(ROI가 있는 zip 파일)이 포함됩니다.

5. Jupyter 노트북으로 SegElegans의 오프라인 버전 실행

  1. Windows 명령 프롬프트(cmd.exe)를 엽니다. 3.7단계에서 설명한 대로 SegElegans 환경 폴더로 이동하여 활성화합니다.
  2. Jupyter 인터페이스를 사용하려면 활성 (SegElegansOffline-1) 환경의 명령 프롬프트에서 jupyter Notebook 명령을 입력하고 실행합니다. 그러면 로컬에서 호스팅되는 사이트가 있는 웹 브라우저 창/탭이 열립니다. 초기 화면에서 SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb 파일을 선택합니다.
  3. 코드 블록 1의 코드를 선택하고(실제 코드 외부의 왼쪽을 클릭) 위의 도구 모음에서 재생(figure-protocol-2) 버튼을 눌러 코드를 실행합니다. 실행이 완료되면 코드 블록 아래에 확인 메시지가 나타납니다.
  4. 코드 블록 2를 실행합니다. 이렇게 하면 코드 블록 아래의 판독값에 일부 입력 양식이 생성됩니다. 생성된 양식에 명시야 이미지(예: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1")가 있는 입력 폴더의 경로, 분석 출력의 원하는 경로(예: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output") 및 분석할 이미지의 정확한 파일 확장자(예: ". TIF")를 사용합니다. 장치가 충분히 기능할 수 있는 경우 제공된 추가 설정을 조정합니다(배치당 하위 작물 수를 9개 또는 16개로 늘리고 여러 후처리 병렬 프로세스를 실행).
  5. 코드 블록 3을 실행합니다.
  6. 코드 블록 4를 실행합니다. 시간이 좀 걸리므로 진행하기 전에 완료되었는지 확인하세요.
  7. 코드 블록 5를 실행합니다. 다시 말하지만, 시간이 좀 걸릴 것입니다. 그런 다음 위에 지정된 출력 폴더로 이동합니다.
    참고: 이 시점에서 SegElegans는 세분화의 초기 평가 및 사후 처리를 완료하고 출력이 포함된 여러 하위 폴더를 만들었습니다. 0_summary 결과 에는 각 이미지의 출력을 요약한 그래프와 각 웜에 할당된 인덱스 번호가 포함되어 있습니다. 1_complete_mask 에는 알고리즘이 분석에 적합하다고 결정한 모든 세분화에 대해 선별된 바이너리 마스크가 포함되어 있습니다. 1_edge_small_mask 에는 동물이 너무 작거나 이미지 가장자리에서 부분적으로 가려져 있기 때문에 알고리즘이 거부하기로 결정한 모든 분할에 대한 이진 마스크가 포함되어 있습니다. 1_overlap_mask 에는 실제 겹침을 나타낸 웜의 모든 분할에 대한 이진 마스크가 포함되어 있으며 기본적으로 큐레이팅된 출력에 추가되지 않습니다. 1_all_rois_results 에는 큐레이션에 관계없이 ImageJ 형식(ROI가 있는 zip 파일)의 3가지 유형 모두의 세분화가 포함되어 있습니다.
  8. SegElegans의 온라인 버전과 유사하게 아래 나열된 세 가지 옵션 중 하나를 사용하십시오.
    1. ImageJ의 1_all_rois_results 에 제공된 ROI를 사용하고 가져온 후 원치 않는 ROI를 거부합니다(프로토콜 섹션 6 참조).
    2. 수동 수정 없이(그리고 겹치는 웜을 포함하지 않고) 자동으로 선별된 양호한 마스크를 수락합니다(5.11단계로 건너뛰기).
    3. 출력에 포함할 웜(겹치는 웜 포함)을 선택하여 큐레이션을 수동으로 조정합니다(5.9단계 계속 진행).
  9. 큐레이션을 수동으로 조정하려면 코드 블록 6과 7을 사용합니다. 먼저 실행 6. 이렇게 하면 코드 아래의 판독값에 입력 양식이 생성됩니다.
  10. 0_summary 결과 하위 폴더의 요약 그래프에서 초기 큐레이션 결과를 검사합니다. 수정이 필요한 각 이미지에 대해 수정할 이미지: 양식에 INPUT 이미지의 전체 이름(확장자 포함)을 입력하고 유지할 마스크: 양식에 쉼표로 구분된 요약 그래프에서 유지할 마스크의 번호를 입력합니다. 코드 블록 7을 실행하고 실행이 완료되었는지 확인합니다. 수정이 필요한 다른 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다.
  11. 큐레이션 수정이 완료된 후 또는 사용자가 수정 없이(그리고 겹치는 웜 없이) 초기 큐레이션을 수락하기로 선택한 경우 코드 블록 8을 실행합니다. 2_curated_rois_results라는 지정된 출력 폴더에 새 하위 폴더가 생성됩니다. 여기에는 ImageJ 형식(ROI가 있는 zip 파일)의 모든 최종 선별된 세분화가 포함됩니다.
  12. 다른 이미지 폴더에 대해 프로세스를 다시 실행하려면 커널 > 커널 다시 시작 및 모든 셀의 출력 지우기 메뉴를 통해 런타임을 재설정하고 처음부터 다시 시작합니다.

6. 세분화를 ImageJ(또는 대안)로 가져오기

  1. ImageJ에서 실제 데이터 이미지 중 하나를 엽니다.
  2. 해당 이미지의 ROI가 포함된 해당 zip 파일을 엽니다. 그러면 선택 항목이 ImageJ ROI 관리자에 로드됩니다. 2_curated_rois_results 출력의 ROI인 경우 일반적으로 사용되는 원하는 방법으로 분석할 준비가 된 것입니다(프로세스를 추가로 자동화하고 가속화하기 위해 매크로를 사용하는 것이 바람직함).
  3. 1_all_rois_results 출력의 ROI인 경우 ROI 관리자에서 원치 않는 세분화를 제거합니다. 이를 선택하고 관리자 창 자체에서 삭제 버튼을 누릅니다. 키보드의 Delete 키를 누르면 이미지에서 선택 항목의 내용이 삭제되므로 누르지 마십시오.
  4. 분석에 ImageJ 이외의 소프트웨어가 필요한 경우 ROI 형식이 호환되지 않을 가능성이 큽니다. 이 경우 1_complete_mask 및 1_overlap_mask 폴더에 제공되는 보편적으로 사용되는 바이너리 마스크 형태로 세그멘테이션을 가져옵니다. 해당 가져오기를 수행하는 방법에 대해서는 수신 소프트웨어의 지침을 참조하십시오.

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결과

이 프로토콜을 따르면 연구자는 눈에 보이는 웜 경계가 없는 형광 이미지 분석을 위해서도 고품질 웜 분할을 추출할 수 있어야 합니다. 프로토콜의 섹션 6에서 논의된 바와 같이, 이러한 분할은 ImageJ로 직접 가져올 수 있으며 형광 리포터의 강도(일반적으로 발현 정량화에 사용됨) 또는 형광 태그가 지정된 영역의 수, 크기 및 형태(단백질 응집체 또는 소기관을 연구하는 데 자주 사용됨)와 같은 관련 특성을 빠르게 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, SegElegans는 형광에 구애받지 않는 방식으로 명시야 이미지에서 분할을 획득하도록 설계되었기 때문에 강도 비율 측정(예: 특정 소기관의 자가포식 분해를 정량화하기 위해) 또는 공동 국소화 지표(예: 소기관 간의 상호 작용을 식별하려고 할 때)를 포함한 다중 채널 분석에도 도움이 될 수 있습니다.

SegElegans는 93% 이상의 세분화 IoU(Intersection...

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토론

여기에 제시된 방법론을 통해 사용자는 정확도 손실 없이 훨씬 더 빠른 시간 내에 C. elegans 현미경 실험을 분석할 수 있어야 합니다. 실제 형광과 독립적으로 명시야 가이드 이미지에서 분할을 추출하기 때문에(프로토콜 섹션 1에서 논의된 대로) 모든 균주 및 웜별로 표현형을 측정해야 하는 모든 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이들은 질병 모델(10)에서 비정상적인 단백질 봉입체의 형성의 정량화(그림 2에 도시된 예에서와 같이), 전사 리포터(26)의 활성, 또는 지질 방울(44)의 크기 및 수와 같은 단일 채널 응용을 포함할 수 있다. 그들은 또한 비율 측정 센서(27)를 이용한 과산화수소 수준의 측정, 소기관 및 단백질 공동...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자 연구실에서의 작업은 사무국에서 자금을 지원합니다.
그리스 개발부의 연구 및 혁신,
유럽 연합 - NextGenerationEU(프로젝트 코드: TAEDR-0535850, 약어:
BrainPrecision) "플래그십 액션"의 틀
연결에 특별한 관심을 가진 학제 간 과학 분야
생산적인 구조로", 국가 회복 및 회복력
"그리스 2.0" 계획, 유럽연합 집행위원회 연구 집행 기관
Excellence Hub "CHAngeing"(GA-101087071) 및 그리스 재단
연구 및 혁신(HFRI)을 위해 "1차 HFRI.
교수진과 연구원을 지원하기 위한 연구 프로젝트
고비용 연구 장비 조달"(프로젝트 번호:
HFRI-FM17C3-0869, NeuroMitophagy).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인터넷 접속이 가능한 컴퓨터 (예: Dell Vostro 데스크탑)여러 곳(예: Dell) -이를 통해 권장대로 클라우드 컴퓨팅을 통해 온라인 시겔레간스를 실행할 수 있고, ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
최소 6GB VRAM을 갖춘 CUDA 호환 그래픽 처리 장치(예: MSI Geforce RTX  RTX3050 벤투스 2X 6GB) (선택 사양)NVIDIA + 여러 제조사(예: Micro Star International)https://developer.nvidia.com/cuda-gpus이렇게 하면 로컬 머신에서 SegElegans를 오프라인으로 실행할 수 있습니다.
CUDA 호환 GPU 칩셋은 여기에서 찾을 수 있습니다:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
VRAM은 제조사가 칩셋을 GPU에 실제로 구현하는 방식에 따라 달라집니다.
경고: 클라우드 컴퓨팅 버전이 달성하는 성능을 맞추려면 최소 요구사항(16+ GB VRAM)을 훨씬 초과하는 비싸고 강력한 CUDA 카드가 필요합니다.
에피형광 현미경 (Invitrogen EVOS FL Auto 2)서모피셔 사이언티픽  예를 들어 AMAFD2000밝은 영역과 하나 이상의 형광 채널에서 거의 동시에 이미지를 자동으로 획득할 수 있는 시스템 사용을 권장합니다.
ImageJ (선택 사항)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloads피지 배포판을 추천합니다. 여기에서
https://imagej.net/software/fiji/downloads
NVIDIA GPU 호환 PC (예: Dell Vostro Desktop) (선택 사항)  여러 곳(예: Dell) -이는 로컬 컴퓨터에서 오프라인 구동을 위해 GPU와 함께 필요합니다.
GPU는 윈도우 호환 하드웨어와 메인보드에 적절한 PCI 슬롯, 카드를 장착할 공간, 충분히 강력한 전원 공급 장치가 필요합니다.
세겔레건스-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 전체 지침은 원고를 참조하세요.nbsp;

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